Bu protokol, böceklerdeki çeşitli hareketleri, böcek proteinlerinin işlevlerini ve in vivo virüs ve vektör böcek arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem verimli ve bilgilendiricidir. Böcek bağırsağının ve yardımcı hücrelerin yapıları, lazer taramalı konfokal mikroskopi ile bakıldığında açıkça görselleştirilir.
Prosedürü gösteren Lu Zhang, laboratuvarımızdan PhD olacaktır. Başlamak için, virülifer olmayan böcekleri cam beherlerden taze güney pirinç siyah çizgili cüce virüsüne, SRBSDV'ye, iki günlük bir virüs edinme erişim süresi boyunca böcek geçirmez bir ağ ile kaplı enfekte pirinç bitkilerine aktarın. Daha sonra böcekleri taze pirinç fideleri içeren cam beherlerde toplayın.
İki gün sonra, bağırsakların diseksiyonu ve eksizyonu için manuel bir aspiratör kullanarak cam beherlerden böcekleri toplayın. Metin makalesinde açıklandığı gibi 0.01 molar PBS,% 4 paraformaldehit ve% 2 Triton X-100 hazırlayın. Bir cam slayt üzerine 100 mikrolitre PBS yerleştirmek için bir pipetleyici kullanın ve slaytı optik mikroskop sahnesine yerleştirin.
SRBSDV ile enfekte olmuş yetişkinleri cam beherlerden toplamak için manuel aspiratör kullanın ve böcekleri felç etmek için buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Felçli bir yetişkini, karın yukarı bakacak şekilde slayttaki 100 mikrolitre PBS'ye aktarın. Vücudu sıkıştırmak için cımbız kullanın ve kafayı başka bir cımbızla çıkarın.
Bir cımbız setiyle, karnın kenarlarını kelepçeleyin ve ovipozitörü veya kuyruğun çiftleşme organını diğer setle sıkıştırın, ardından bağırsakları karın içinde yavaşça açığa çıkarmak için bir karın segmentinin intersegmental zarını dikkatlice çekin. Zarı yırtmaya devam edin ve yavaş yavaş tüm bağırsağı karnından çıkarın. Tüm bağırsağı çıkarmak için bağırsağın ucuna bağlı kuyruğu yavaşça çekin.
Eksize edilmiş bağırsakları 200 mikrolitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpe 200 mikrolitre PBS ekleyin ve bağırsakları iyice yıkamak için bir pipet kullanın. Bir cam slayt üzerine 100 mikrolitre PBS yerleştirmek için bir pipetleyici kullanın ve slaytı optik mikroskop sahnesine yerleştirin.
SRBSDV ile enfekte olmuş perileri cam beherlerden toplamak için manuel aspiratör kullanın ve böcekleri felç etmek için buz üzerine yerleştirilmiş 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin. Felçli bir perisini, karın yukarı bakacak şekilde slayttaki 100 mikrolitre tampona aktarın. Perisinin kuyruğunu ayırın, sonra yavaşça sabitlemek için böcek gövdesini sıkıştırın ve kafayı sıkıştırmak için diğer çifti kullanın.
Başın vücuttan ayrılması için bağırsaklara bağlanmasını sürdürürken kafayı yavaşça vücuttan uzaklaştırın, ancak bağırsak hala göğüs kafesine ve karnına bağlanır. Cımbızlar hala vücudu sıkıştırırken, kafayı dikkatlice hareket ettirmek ve bağırsağı yavaş yavaş çıkarmak için diğer çifti kullanın. Vücuda zarar vermeden sağlam bir bağırsak elde etmek için bağırsağı kafadan ayırın.
Eksize edilen bağırsakları bir tüpe yerleştirin. Tüpe PBS ekleyin ve yavaşça emerek bağırsakları iyice yıkamak için çözeltiyi bir pipetle serbest bırakın. Antikorları ve montaj ortamını metin makalesinde açıklandığı gibi hazırlayın.
Yeni eksize edilmiş ve PBS ile yıkanmış WBPH bağırsaklarını, oda sıcaklığında 200 mikrolitrelik bir santrifüj tüpüne 100 mikrolitre% 4 paraformaldehit içine yerleştirin. İki saat sonra, paraformaldehit çözeltisini 200 mikrolitre PBS ile değiştirin. 10 dakika sonra, herhangi bir paraformaldehiti ortadan kaldırmak için PBS'yi çıkarın ve PBS yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
İki PBS yıkamasından sonra, numuneleri oda sıcaklığında geçirgenleştirmek için 200 mikrolitre iyonik olmayan deterjan Triton X-100 ekleyin. 30 dakika sonra, Triton X-100'ü çıkarın ve kalan deterjanı PBS ile 10 dakikalık üç yıkama ile yıkayın. Etiketli antikorları 50 mikrolitre boğa serum albümini ile bir ila 50 arasında seyreltin.
Seyreltilmiş antikorları tüpe ekleyin ve numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Antikoru çıkardıktan sonraki sabah, kalan antikor seyrelticiyi PBS ile 10 dakikalık üç yıkama ile yıkayın. Bir mikrolitre DyLight 633-Phalloidin'i 50 mikrolitre PBS ile seyreltin ve oda sıcaklığında iki saatlik bir inkübasyon için tüpe 50 mikrolitre seyreltilmiş faloidin ekleyin.
Phalloidini çıkardıktan sonra, kalan falloidini PBS ile üç adet 10 dakikalık yıkama ile iyice yıkayın. Bir mikroskop lamdına DAPI içeren bir damla montaj ortamı yerleştirin. Bağırsakları ortama aktarın ve kapak camını kabarcıklar oluşturmadan numunenin üzerine yavaşça yerleştirin.
Falloidin ile etiketlendikten sonra yetişkinlerden eksize edilen WBPH bağırsaklarının temsili lazer tarama konfokal mikrografisi üç bölüm gösterdi: ön bağırsak, midgut ve hindgut. Bunlar arasında midgut, SRBSDV'nin ilk enfeksiyon bölgesidir. Bağırsağın tek katmanlı epitel hücre yapısı, böcek proteinlerinin hücresel lokalizasyonunun ve viral ve böcek proteinlerinin kolokalizasyonunun incelenmesini kolaylaştırır.
Burada DyLight 488 etiketli anti--7 ile eksize edilmiş WBPH bağırsakları ve DyLight 549 etiketli anti-SRBSDV antikoru ile SRBSDV viryonları gösterilmiştir. -7 ve SRBSDV viryonlarının sitoplazmada birlikte lokalize olduğu gösterilmiştir, bu da-7'nin in vivo virüs iletiminde rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Permeabilize bağırsaklar, arka planı ve spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için lusiferin konjuge antikorları ile inkübasyondan sonra iyice temizlenmelidir.
Bu, böceklerde virüs, diğer patojenler ve böcek proteinlerinin lokalizasyonunu görüntülemek için güvenilir bir yöntemdir. Patojenler ve böcekler arasındaki ilişkinin daha ileri çalışmaları için temel sağlar.
