Bu yöntem, bakteriyel patogenez alanında kan yoluyla bulaşan bakterilerin merkezi sinir sistemi ve beyne bulaşmasını sağlamak için kan-beyin bariyerini geçip geçemeyeceği konusunda anahtar soruların yanıtlatılabilir. Bu teknikle enfekte hayvanların kan ve beyin dokusu içindeki bakteri sayıları, beynin kan damarlarında bulunan bakteri sayısı hariç tutulabilir. Prosedürü gösteren Pallab Ghosh, benim laboratuvar bir araştırma görevlisi olacaktır.
72 saat post-enfeksiyon, dakikada EDTA 10 milimolar ile takviye PBS dört mililitre bir akış hızına otomatik bir perfüzyon sistemi ayarlayın. Ve ötenazi yapılan hayvanı bir diseksiyon tavasında supine pozisyonuna yerleştirin. Pati kıstırmak yanıt eksikliği ile ötenazi onaylayın.
Ve karnı %75 etanolle ısla. Diyafram ve visseral organları ortaya çıkarmak için göğüs kafesi hemen altında bir karın duvarı kesi yapmak için makas kullanın. Ve göğüs boşluğunu açmak için diyaframı kes.
Sol ventrikül maruz bırakmak için iki taraflı ovma kafesi kesin ve yavaşça kalp kavramak için forseps kullanın. Sol ventrikül içine perfüzyon sistemine bağlı bir 21-gauge kelebek iğne takın ve dikkatle pıhtılaşmayı önlemek için 10 milimolar EDTA içeren iki mililitrelik bir tüp içine kan yaklaşık 200 mikrolitre toplamak için sağ atriyum kesti. Daha sonra 15-20 mililitre PBS artı EDTA ile dört dakika hayvan perfuse.
Tam perfüzyon sonra, beyin ve karaciğer kalan bakterilerin hasat organları değil, dolaşan kan olmasını sağlamak blanched görünecektir. Perfüzyonu takiben, ilgi çeken organları, tüp başına beş mililitre steril dört santigrat pbs içeren 15 mililitrelik konik tüplere dikkatlice aktarın. Decapitation sonra beyin hasat için, gerektiği gibi herhangi bir fazla doku kesmek için kafatasına preslenmiş ipuçları tutarak, gözler arasındaki orta hat aşağı kafa derisi kesmek için makas kullanın.
Makanın bir ucunu foramen magnuma hafifçe takın ve her iki taraftaki kafatasını yanal olarak kesin. Dikkatle kafatası nın orta hattı aşağı gözleri arasındaki kafatası kesilmiş, yanal basınç uygulamak ve beynin tedirginliğini önlemek için dikkat. Forceps kullanarak, beyin ortaya çıkarmak için kafatası açın ve beynin alt ve kafatası tabanı arasında dikkatle dört derece Santigrat derece beş mililitre içeren 15 mililitrelik bir tüp içine beyin aktarmak için bir spatula yerleştirin.
Bir biyogüvenlik kabininde, ucu yerleştirin ve ayrı 15 mililitrelik konik tüplerde sıralı %5 çamaşır suyu, steril su, %75 etanol ve steril su çözeltilerinde 10 saniye boyunca bir doku homogenizer çalıştırın. Ucu iyice sterilize edildiğinde, tüp içinde enfekte beyin homojenize. Görünür doku parçaları kalmadığında, bakterinin bir sonraki organ örneğine taşınmasını önlemek için ucu yeniden sterilize edin ve bir sonraki organı homojenize edin.
Tüm organlar homojenleştirildiğinde, steril PBS'de homojenate her organın 10 kat seri seyreltmelerini hazırlayın ve beyin-kalp infüzyonu agar plakaları üzerindeki seyreltmeleri plakalayın. Daha sonra homojen seyreltme kültürlerini bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve organ başına toplam bakteri sayısını veya mililitre kanını belirlemek için her tabaktaki koloni sayısını sayın. L.monocytogenes-enfekte fare organlarındaki bakteriyel yüklerin hesaplanması, bu temsili çalışmada incelenen enfekte farelerin kan veya organlarındaki perfüzyon sonrası enfeksiyon yükünü önemli ölçüde değiştirmediğini göstermektedir.
Bu prosedürü takiben, Listeria monocytogenes-enfekte organlar daha fazla enfekte olmayan kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında enfekte fare organlarıiçine inflamatuar hücrelerin infiltrasyonu hakkında ek sorulara cevap histopatolojik işleme gibi ek analiz için işlenebilir. Bu işlemi çalışırken, beynin tedirginliği önlemek ve makas ve beyin dokusu arasında minimal temas korumak için hatırlamak önemlidir.
