Bu çalışma SEFD verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI079442 ve AI091918) hibe tarafından desteklenmiştir

1. Selective Agar Medya hazırlanması (BHI / L + G) Bağırsak Microbiota Engelleme için <ol><li> 26 g Brain Heart Infusion agar (Difco), 7.5 g LiCI ve 5,0 g glisin ve 1 litrelik bir şişe içinde yer tartılır. Iyonu giderilmiş suyun 500 ml ilave edilir. </li><li> Bir manyetik karıştırıcı üzerinde ısı agar kaynayıncaya kadar, sürekli bir şekilde karıştırarak. Isı şişesi alın, baloncuklar yerleşmek izin, ve sonra tekrar bir raddeye geri getirmek. </li><li> . Bir sıvı döngüsünde 16-19 psi altında 121 ° C&#39;de 30 dakika süreyle otoklavlanmaktadır Not: şişeye karıştırma çubuğu bırakın. </li><li> ° C su banyosunda 55 medya dengelenmesi veya oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Çözüm ° C veya kristalleri agar oluşturacak 55 daha serin olsun izin vermeyin. Kristaller, L. inhibe etmeyen monocytogenes büyüme veya medyanın seçici özelliklerini etkiler. Ancak, kristaller küçük koloniler görünüm olarak benzer olacaktır ve zor bakteriyel CFU saymak yapacaktır. </li><li> Yavaşça karıştırınmanyetik bir karıştırıcı kullanılarak 1 dk için agar. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek. Petri kapları (~ 25 ml / plaka) içine agar dökün. Not: Bu medya tüm L. büyümesini desteklemiyor monocytogenes suşları. Örneğin, L. monocytogenes EGDE 36-48 saat içinde görünür koloniler ile, bu agarda iyi yetişir, ama 10403S bu medya olmak değil. </li></ol> 2. İnokulum hazırlanması <ol><li> Küçük içine dilimlenmiş beyaz ekmek (Kroger) Kesme (2-3 mm) steril makas ora steril neşter bıçak kullanarak küpleri. Kabuklar kullanmayın. Enfeksiyonun güne kadar -20 ° C&#39;de mikrosantrifüj tüpleri içinde tek tek parçalar saklayın. </li><li> Steril bir neşter kullanılarak, tuzlu tereyağı (Kroger) küçük (0.5-1 cm) parçalar kesilir ve steril bir mikrosantrifüj tüp içinde her yer. 60 ekmek parçaları - Her tüp 50 hazırlamak için yeterli tereyağı içerir. -20 ° C&#39;de saklayın kadar gerekli. </li><li> L. büyütün BHI suyu monocytogenes ve 30 sallayarakderece; kültür ~ 0.8-1.0 bir OD 600 ulaşana kadar C. Numune, sık kullanılan tüpler her bakteri aynı sayıda girdap bakımı, mikrosantrifüj tüpleri içinde 500 ul hacimde hazırlayın. -80 ° C de saklayınız </li><li> , Bakteriyel alikotları titresi buz üzerinde bir tüp çözülme, sonra 500 ul, 9.5 mi, BHI et suyu ile ekleyin. 30 1.5 saat ayakta için inkübe ° C BHI agar plaka seri seyreltme. . Homojen alikotları hazırlanır, 2-4 kat bir varyans ile benzer bir şekilde hazırlandığında, tüplerin her biri bu titresi verecek şekilde elde edebilirler: ~ 1-5 x 10 8 CFU / ml Not bir titreye bekliyoruz. </li><li> Farenin bulaştırmak için, L. ve bir kısım hazırlamak monocytogenes, adım 2.4 &#39;te açıklandığı. L. önce yaklaşık 20 dakika monocytogenes kültür hazır, oda sıcaklığında ekmek parçaları çözülme. 55 tereyağı bir kısım eritin ° C ile 55 ° C &#39;de PBS içinde ön ısıtma küçük hacimli En az bir fare başına olacak şekilde yeterli ekmek parçaları hazırlamakenfekte edilen ve gerçek inokulum titresi belirlenmesi için en az bir adet ilave edilmesi. </li><li> Bakteriyel kısım önceden belirlenmiş titresi göre, L. toplam hacmi hesaplamak monocytogenes kültür ekmek parçaları gerekli sayıda için aşı hazırlamak için gerekli. 10 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüj ile pelet bakteri tüm BHI et suyu aspire edin ve önceden ısıtılmış PBS (2 ul / ekmek adet) küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon bakteri. </li><li> Vortex eritilmiş tereyağı, bakteriler (3 ul / ekmek parçasına eşit bir toplam hacim kullanarak) eklemek ve iyice karıştırın Not:. Bir kez ya da tereyağı pekiştireceğiz birden fazla 10-15 ekmek parçaları hazırlamak için çalışmayın. </li><li> , Hızlı bir şekilde mikrosantrifüj tüp içinde tek bir ekmek parçasının üzerine bakteriyel süspansiyon pipet 5 ul Çalışma. Çözelti tamamen ekmek parçası tarafından soğurulmaktadır. </li><li> Inokulum asıl titresini belirlemek için, ekmek piec biri 1 ml steril PBS ekleyines. 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın. Seri seyreltme ve plaka BHI ve BHI / L hem + G agar hazırlayın. </li><li> Yüksek titrede (&gt; 10 9 CFU) aşı için alternatif prosedür. Bakteriyel pelet çok büyük ise, bu kadar küçük bir hacim içinde süspansiyon haline getirilmesi zor olabilir ve sonuçta ortaya çıkan madde, bir macun gibi, çok viskoz ve inokulum bir mikrosantrifüj tüpü yanlarına yapışabilir. Bu durumda, steril bir 60 mm kültür tabağına ekmek aşılamak için, ve (bkz. aşağıda), fare için tüm çanak (kapaksız) sunmak için daha iyidir. Ekmek tarafından absorbe olmayan herhangi bir aşırı aşı sonra fare doğrudan yenebilir. Çok yüksek titre aşı ile uğraşırken Genel olarak, ekmek tüm yemek ve aşağıda açıklanan standart protokol daha temiz çanak yalamak için fareler için daha uzun sürer, bu nedenle bu sadece tercih edilen yöntemdir. </li></ol> 3. Farelerin Enfeksiyon <ol><li> Dişi BALB / c / J (hisse senedi # 0.010.026) ve C57BL/6/J By / (hisse senedi satın# 000.644) Jackson Laboratuvarı (Bar Harbor, ME) gelen ve yaş 6-9 hafta kullanın. </li><li> Hızlı gıda kaldırma ve yükseltilmiş (1 inç) kablo döşeme (# 3 gözenek; Allentown) üzerine farenin yerleştirerek enfeksiyon öncesi farenin bir gün (24 saat) coprophagy önlemek için. Sadece yeterli idrar absorbe kafeste yatak, ama döken dışkı yükseltmek için yeterli değil bırakın. Suya sınırsız erişim sağlar. </li><li> Kırmızı bir ampul ile donatılmış bir laminer akış kaputu çalışan, karanlık döngüsünün başlangıcında fareler bulaştırmak. Boş (hiç yatak) kafesine tek bir fare aktarın. Steril bir forseps kullanarak, boş kafesinin altına kirli ekmek parçası aktarın. Tipik olarak, fare ekmek parçası almak ve 2-10 dakika içinde tamamen tüketmek. Fare hemen ekmek yemez ise, 20-30 dakika süreyle rahatsız fare raf ve ayrılmak kafes dönmek. Hayvanların büyük çoğunluğu bu süre içinde ekmek yiyeceğiz, ancak fareler ot erişimi olmayan, rahatsız bırakılabiliren fazla 2 saat için onu yiyecek ya da su. </li><li> Enfeksiyondan sonra, orijinal kafes için fareyi dönmek ve fare yemi doldurmak. Deney süresi boyunca yükseltilmiş tel zemin üzerinde farenin ev devam edin. </li></ol> 4. Bakterilerin Seviyesi İzleme Dışkı içinde Shed <ol><li> Etiket ve ön ağırlık mikrosantrifüj tüpleri dışkıların toplanması için kullanılır. </li><li> Farenin bir kafeste aldıktan sonra hızlı bir şekilde çalışan, 500 ml&#39;lik plastik kabı içinde, her bir fare yerleştirin. Genellikle fareler 5 dakika içinde 1-4 dışkı pelet sınırdışı edecek. </li><li> Şekilde etiketlenmiş tüplere dışkı aktarmak için steril bir forseps kullanın. </li><li> Her bir tüp tartılır ve boş tüpün ağırlık çıkarılarak dışkı ağırlığını hesaplamak. Pislikleri için tipik ağırlıkları 10-30 mg arasında değişiklik gösterebilir. </li><li> Her bir tüp (200 μl/30 mg dışkı) PBS ekleyin ve püre fekal pelet için steril bir kürdan kullanın. </li><li> 30 saniye vorteks her tüp, daha sonra BHI / L üzerinde seri seyreltme ve plaka hazırlamak+ G agar. Kolonilerin sayısını ve CFU / mg dışkı hesaplamak. </li></ol> 5. Enfekte Bağırsak Dokular işlenmesi <ol><li> Fareler Euthanize, aseptik tek bir doku olarak her fareden mide ve bağırsak hasat ve boş 100 mm Petri kapları koyunuz. </li><li> Ince bağırsak, çekum ve buz saklanan ayrı 60 mm yemekleri kolon ve yer ayırın. Ince bağırsak daha duodenum, jejunum ve luminal içeriği çıkarılmasını kolaylaştırmak için ileum yaklaşan üç eşit parçaya uzunluğu ayrılabilir. Doku üçte sonra da birlikte işleme (bütün ince bağırsak başına CFU için) veya ayrı ayrı olabilir. ~ 0.5 ml steril PBS ile ıslak mendil esnek tutmak ve taşıma sırasında gözyaşları önlemek için. </li><li> 8 ml steril PBS ile 10 ml şırınga doldurun ve 25 g iğne takın. Bir atık beher (veya steril 50 ml tüp luminal bakteriler toplama varsa) içine luminal içeriğini sıkmak için steril forseps kullanın. Griplerdoku bir ucunu ile saat 4 ml PBS, içeriğini sıkmak için forseps kullanın ve sonra diğer ucunda doku ters çevirin ve tekrarlayın. </li><li> Luminal içeriği Listeria sayısı ölçmek için, 0.5 pelet askıya, 12.000 x g&#39;de 20 dakika için toplanmış basması santrifüj - 1.0 ml steril su. </li><li> Listeria hücre ile ilişkili miktarı toplam sayısı ölçmek için, daha küçük parçalara doku dilim için birkaç yan keser sonra steril neşter bıçağı ile boyuna keserek her yıkanmış doku açın ve Not:. Bu adımı sağlamak için gerekli olduğunu bağırsak dokusu homojenizatör bıçak etrafında kaydırma değil. 2 ml steril su ihtiva eden bir 15 ml santrifüj tüpüne bağırsak parçaları aktarın. </li><li> 30 saniye için% 60 güçte% 70 etanol içinde prob yerleştirerek bir doku homojenleştirici (Fisher PowerGen 1000) sterilize edin. 10 sn için, steril su içinde hava kuru etanol, veya işlem bekleyin. Her ti homojenize1 dakika boyunca ssue. Her numune arasında steril su ile tedavi tekrarlayın, ve örnek gruplar arasında% 70 etanol kullanın. </li><li> Steril su ve BHI / L + G agar plaka her numunenin seri dilüsyonları hazırlayın. </li></ol> 6. Enfekte Mezenterik Lenf düğümleri işlenmesi <ol><li> Hasat lenf aseptik düğümleri, buz üzerinde steril bir 60 mm çanak yer, ve bağlı tüm yağ çıkarmak için steril forseps kullanabilir. Fare başına 3-6 düğümleri bulmak için bekliyoruz. </li><li> Paslanmaz çelik # 80 örgü 1.5-2 inç kare parçalar keserek tel örgü ekranları hazırlayın. Her köşesinde küçük bir kesim yapmak ve bir yükseltilmiş yatak oluşturarak, dört tarafı aşağı katlayın. 0.75 ml steril su içeren bir 60 mm Petri kabındaki% 95 etanol ve sonra sterilize etmek için ateş ve yerde batırın. Her kullanımdan sonra, ekranlar, 20 dakika süreyle% 70 etanol içinde ıslatma gömülü dokulara kaldırmak için bir fırça ile ovma, 2N NaOH ile 20-30 dakika boyunca kaynamaya, ve daha sonra su ile iyice yıkanarak geri dönüştürülebilir. </li><li> Piston kullanınağ elek boyunca steril 3 ml şırınga mash düğümleri. Bu çanak su ile temas yapar böylece yemeğin altına ekranda aşağı itmek için emin olun. </li><li> Ekran üzerinden 0.75 ml steril su geçmek ve ekrandaki durulama birkaç kez aşağı yukarı pipet ve. Bir mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Vorteks her numune kuvvetli bir şekilde 30 saniye için hücreleri eritmek için. Ya BHI / L + G agar seri seyreltme ve plaka hazırlayın. </li></ol> 7. Enfekte Dalak, karaciğerleri, ve Gall Bladders işlenmesi <ol><li> Steril forseps ile dalak tutun ve iki kesim, her sonunda bir yaparak serbest. 2.5 ml steril su ihtiva eden 15 ml&#39;lik bir tüp içinde yer. (Not: yuvarlak dipleri ile tüpler homojenizatör ile kullanmak daha kolay olabilir.) </li><li> Safra kesesi (karaciğer bağlı küçük bir sarı sıvı dolu kese) ve patlama olmadan karaciğer ayırmak için steril makas ile dikkatlice kelepir bulun. Transf1 ml steril su ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüpüne er. </li><li> Aseptik, karaciğer kaldırmak tüm lobları kaldırmak için emin ve steril su 2.5 ml içeren 15 ml santrifüj tüpüne aktarın. </li><li> Olarak% 60 güç 30 saniye yukarıda açıklanan dalak ve ciğeri homojenize. Forgall mesane, 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteks sonra mikrosantrifüj tüp içinde paramparça steril makas kullanın ve. </li><li> Seri seyreltme ve BHI veya BHI / L ya da üzerinde plaka her bir örnek + G agar hazırlayın. </li></ol> 8. Enfekte Brain işlenmesi <ol><li> Fare arka tarafında çalışan, bir 45 ° açıyla boyun üzerinde deri ve doku kesme ve her iki kulakta arasında. Burun doğru çekerek cilt U şeklindeki kapak kalkmasına steril bir forseps kullanın ve kafatası ve yüz kemikleri ortaya. </li><li> Bir forseps ile göz arasında kemik sırt tutarak kafatası hareketsiz ve kafatasının yan kenarları boyunca sığ kesim yapmak için makas kullanın. Olmaksadece kemik değil, beyin dokusu kesmek için dikkatli. Daha sonra, gözler arasında kemik sırt kesti. Beyin ortaya çıkarmak için (boyun doğru) kafatasının üst tutun ve geriye doğru çekmek için bir forseps kullanın. </li><li> Yavaşça 1.5 ml steril su ihtiva eden 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne steril ve forseps kullanarak boşluğundan beyin kaldırın. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi% 60 güç, 20 sn için homojenize edilmiştir. BHI veya BHI / L + G agar ya da üzerinde seri seyreltme ve plaka hazırlayın. </li></ol> 9. Ek Prosedür: Bağırsak Dokuların Fraksiyonu Mukus Kesir Bakterilerin 9.1 izolasyonu <ol><li> Her bağırsak dokusu için, 6 mM N-asetilsistein (; Sigma # A-9165 NAC) 3 ml içeren 3 tüpler hazırlamak. </li><li> Kızarmış yerleştirin ve uzunlamasına şiddetle her 20-30 sn dönen, 1-2 dakika için ilk tüp doku kesti. Steril forseps kullanarak, doku almak ve yavaşça aşırı Sıvı sabun kaldırmak için tüpün kenarına sıkmakkimliği. </li><li> Kalan NAC tüpler kullanılarak iki kez daha adım 9.1.2 tekrarlayın. Bağırsak dokusu kaldırmak ve daha fazla işlem için bir kenara koyun. </li><li> Havuz NAC (9 ml toplam) yıkar ve 12,000 x g de 20 dakika süre ile santrifüjlenir. </li><li> 30 saniye için steril su, girdap içinde pelet tekrar süspansiyon, BHI / L + G üzerinde seri seyreltme ve plaka hazırlamak </li></ol> Epitel Hücre (EC) Kesir Bakterilerin 9.2 izolasyonu <ol><li> % 5 FBS (RP-5), 5 mM EDTA, 1 mM DTT ile desteklenmiş 5 ml RPMI (Invitrogen # 21870) içeren bir 50 ml tüp içinde steril makas ve yer ile küçük parçalar halinde her bir doku kesin. ° C&#39;de 20 dakika boyunca 37 çalkalama inkübe edin. </li><li> 5 ml RP5/EDTA/DTT içeren yeni bir tüp bağırsak parçaları aktarın ve 37 çalkalama ° C&#39;de 20 dakika için inkübe edilir. Ilk tüpten medya kaydedin ve 37 kenara ° C RP5/EDTA/DTT üç 20 dakika inkubasyon olmak üzere toplam bir kez daha bu işlemi tekrarlayın. Lamina propria iso geçmeden eğerlation adım, boş 50 ml tüp içine kalan bağırsak parçaları aktarın. </li><li> Üç RP5/EDTA/DTT yıkar (15 ml toplam hacmi) ve pelet hücreleri düşük hız (1.200 xg) santrifüj birleştirin. </li><li> Dışı bakteriler ölçmek için, 12,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca santrifüj ve süpernatan toplamak. 0.5 pelletini tekrar - BHI / L 1.0 ml steril su ve plaka seri seyreltme + G agar. </li><li> Hücre içi bakteri numaralandırmak için, 25 ug / ml gentamisin içeren RP-5, 5 ml EM pelletini. 37, 30 dakika boyunca tek bir hücre süspansiyonu inkübe ° C artı% 7 öldürmek için CO2 kalan herhangi bir hücre dışı L. monocytogenes. Hücreleri eritmek için 30 saniye boyunca 0.5 ml steril su ve girdap içinde askıya, PBS içinde hücreler iki kez yıkayın. BHI / L + G su ve plaka seri dilüsyonları hazırlayın Not: Bu aşamada toplanan hücreler temel Peyer en Yamalar hücreleri de içerir. Arzu edildiği takdirde, görünür PeyerYamalar kızarma ve uzunlamasına önce bağırsak dokularından kaldırılabilir. </li></ol> Lamine Propria (LP) Kesir Bakterilerin 9.3 izolasyonu <ol><li> Tüpe 25 ml steril PBS eklenerek bağırsak parçaları arasındaki aşırı DTT / EDTA ile durulayın. Şiddetle çalkalanır, yeni bir tüpe aktarmak ve iki kez tekrarlayın. </li><li> 40 dakika boyunca 37 ° C&#39;de çalkalama 1 mg / ml tip IV kollajenaz ve 40 ug / ml DNAz I inkübe ile desteklenmiş RP-5 oluşan sindirim çözelti 4 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüpe bağırsak parçaları aktarın. </li><li> 4 ml sindirim çözeltisi içeren yeni bir tüp içine sindirilmemiş parçaları aktarın ve doku parçaları tamamen sindirilir kadar bir veya iki kez tekrarlayın. 37 serbest LP hücreler içeren sindirim çözümler, her biri ° C katılım </li><li> Pelet hücreleri düşük hız (1.200 xg) toplanmış sindirim çözümleri santrifüj. Descri olarak supernatant ve hücre pelletini ayrı ayrı işlemesırasıyla hücre dışı ve hücre içi bakteri numaralandırmak için yukarıdaki IBED. </li></ol>

<ol>
	<li>Becker, L. A., Evans, S. N., Hutkins, R. W., Benson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+sigmaB+in+adaptation+of+Listeria+monocytogenes+to+growth+at+low+temperature.">Role of sigmaB in adaptation of Listeria monocytogenes to growth at low temperature.</a> Journal of Bacteriology. 182, 7083-7087 (2000).</li><li>Neunlist, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+salting+and+cold-smoking+on+the+culturability,+viability,+and+virulence+of+Listeria+monocytogenes+strain+Scott+A.">Effect of salting and cold-smoking on the culturability, viability, and virulence of Listeria monocytogenes strain Scott A.</a> Journal of Food Protection. 68, 85-91 (2005).</li><li>Aureli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+febrile+gastroenteritis+associated+with+corn+contaminated+by+Listeria+monocytogenes.">An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes.</a> N. Engl. J. Med. 342, 1236-1241 (2000).</li><li>Dalton, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+gastroenteritis+and+fever+due+to+Listeria+monocytogenes+in+milk.">An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk.</a> N. Engl. J. Med. 336, 100-105 (1997).</li><li>Frye, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+febrile+gastroenteritis+associated+with+delicatessen+meat+contaminated+with+Listeria+monocytogenes.">An outbreak of febrile gastroenteritis associated with delicatessen meat contaminated with Listeria monocytogenes.</a> Clin. Infect. Dis. 35, 943-949 (2002).</li><li>Salamina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+foodborne+outbreak+of+gastroenteritis+involving+Listeria+monocytogenes.">A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes.</a> Epidemiol. Infect. 117, 429-436 (1996).</li><li>Mead, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food-related+illness+and+death+in+the+United+States.">Food-related illness and death in the United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 5, 607-625 (1999).</li><li>Wing, E. J., Gregory, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+Clinical+and+experimental+update.">Listeria monocytogenes: Clinical and experimental update.</a> The Journal of Infectious Disease. 185, S18-S24 (2002).</li><li>Condotta, S. A., Richer, M. J., Badovinac, V. P., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+CD8+T+cell+responses+with+Listeria+monocytogenes+infection.">Probing CD8 T cell responses with Listeria monocytogenes infection.</a> Advances in Immunology. 113, 51-80 (2012).</li><li>Disson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+listeriosis+in+natural+and+genetically+engineered+animals.">Modeling human listeriosis in natural and genetically engineered animals.</a> Nat Protoc. 4, 799-810 (2009).</li><li>Czuprynski, C. J., Faith, N. G., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A/J+mice+are+susceptible+and+C57BL/6+mice+are+resistant+to+Listeria+monocytogenes+infection+by+intragastric+inoculation.">A/J mice are susceptible and C57BL/6 mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric inoculation.</a> Infect. Immun. 71, 682-689 (2003).</li><li>Gajendran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+IFNgamma+expression+is+insufficient+for+efficacious+control+of+food-borne+bacterial+pathogens+at+the+gut+epithelial+barrier.">Regional IFNgamma expression is insufficient for efficacious control of food-borne bacterial pathogens at the gut epithelial barrier.</a> Int. Immunol. 19, 1075-1081 (2007).</li><li>Lecuit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+model+for+listeriosis:+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier.">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li><li>Pron, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+study+of+the+intestinal+stage+of+listeriosis+in+a+rat+ligated+ileal+loop+system.">Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system.</a> Infect. Immun. 66, 747-755 (1998).</li><li>Wollert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design.">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129, 891-902 (2007).</li><li>Ghanem, B. o. u., N, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InlA+promotes+dissemination+of+Listeria+monocytogenes+to+the+mesenteric+lymph+nodes+during+food+borne+infection+of+mice.">InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice.</a> PLoS Pathogens. , (2012).</li><li>Kowal, M., Buda-Lewandowska, D., Plytycz, B., Styrna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Day/night+food+consumption+in+mice+is+strain+and+age-dependent.">Day/night food consumption in mice is strain and age-dependent.</a> Folia Biol. (Krakow). 50, 1-3 (2002).</li><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).</li><li>Camejo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arsenal+of+virulence+factors+deployed+by+Listeria+monocytogenes+to+promote+its+cell+infection+cycle.">The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle.</a> Virulence. 2, 379-394 (2011).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim. Burada açıklanan tüm deneyler Kentucky Üniversitesi&#39;nde ICAUC onayı ile Laboratuar Hayvan Refahı (OLAW) için Office uygun olarak yapıldı.

Doğuştan fareler günün her zaman beslenme için düzgün açık değildir ve kontamine ekmek yemek için istekli olduklarını hem gerginlik tipi ve farelerin 17 yaşına bağlıdır. Bizim tecrübelerimize göre, 6-9 haftalık B6 fareler günün herhangi bir zamanda besleme için açık olan, ama onların karanlık döngüsü sırasında sunulan sürece BALB fareler sürekli ekmek parçası yemek olmaz. Karanlık evre laboratuvar personeli için normal iş günü denk böylece hayvanların ev için kulla...

Listeria monocytogenes, insanlarda gıda kaynaklı enfeksiyonlara neden fakültatif hücre içi bakteriyel patojenler bulunmaktadır. Bakteri tuzlama, kurutma gibi olarak gıda tedarik, korumak için kullanılan süreçlerin çok dayanıklı, ya da soğutma 1,2 ve enfeksiyonlar genellikle tüketim önce ısıtılır değildir işlenmiş, &quot;hazır yemek&quot; gıdalar ile bağlantılıdır . L. birkaç önceki salgınları, kaynak monocytogenes-kontamine yiyecek tespit edilmiştir, ve maruz kalan bireylerin kısıtlı grup yakından 3-6 izlenmiştir. Bu örneklerde, aksi takdirde sağlıklı kişilerde klinik hastalık hafif, kendini sınırlayan gastroenterit daha ağır bağırsak ve sistemik enfeksiyonlar gerektiren hastanede. L. çeşitli yenidoğan ve yaşlılar dahil olmak üzere bağışıklık sistemi zayıflamış kişiler, içinde monocytogenes enfeksiyonları bile antibiyotik tedavisi ile, bir yüksek ölüm oranı (% 25-30) ile ilişkilendirilmiştir <s7,8&gt; kadar. Küçük L. için bulaşıcı dozu hakkında bilinen monocytogenes, ya da küçük bir hayvan modeli eksikliği nedeniyle öncelikle sözlü iletim sonra enfeksiyona duyarlılık yöneten ana faktörler, bu enfeksiyon sonuçları özetlediği bu geniş. Listeryoz En yaygın olarak kullanılan model farenin intravenöz (iv) bir aşı. Iv modeli son derece tekrarlanabilir, ve enfeksiyon 9,10 sırasında naif ve bellek hem de T hücre yanıtları eğitim için son derece yararlı olmuştur. Iv modelinin dezavantajı tamamen enfeksiyon bağırsak faz atlar olmasıdır. Gıda kaynaklı iletim sonra, bağırsak mukoza muhtemelen yavaşlatır ve sürekli çevre dokulara yaymak olabilir bakteri sayısını sınırlayan bir engel oluşturur. Buna karşılık, tüm inokulum iv uygulamadan sonra birkaç dakika içinde dalak, karaciğer ve bulunabilir ve organizmaların bu büyük bolus olarak doğuştan gelen bağışıklık d bastıran olabilirbu dokularda efenses. Yüksek dozlarda (10 9 -10 11 CFU) genellikle bağırsak kolonizasyonu 10 elde etmek için gerekli, çünkü sonda ile farelerin ağız enfeksiyonu daha az yaygın olarak kullanılır. Ayrıca, bir besleme iğnesi ile birlikte intragastrik (Ig) aşılama sistemik yayılmasını önce sindirim sistemi enfeksiyonu tekrarlanabilir bir süre üretmez. Bazı laboratuvarlar bu L. bildirdin diğerleri 48 hpi 11-15 kadar sistemik yayılma gösterdi monocytogenes, 4-12 saat sonrası enfeksiyon (hpi) içinde dalak ve karaciğer ulaşır. Bu laboratuvar-to-laboratuar varyasyon yemek borusu astar minör travmaya neden olabilir hangi, ig inokülasyon invaziv bir sonucu olması ve bakteri doğrudan kan işgali teşvik edebilir. Biz son zamanlarda sözlü L. yeni bir fare modeli geliştirdi yakın insan hastalığı 16 her aşamasında taklit monocytogenes enfeksiyonu. Fareler devam parçaları yemek zaman enfeksiyon ortaya çıkarGıda, travmatik olmayan bir süreç, aminated ve laboratuvar araştırmacılar tarafından özel beceri gerektirmez. Zaman ayrı bir süre (36-48 saat) için, L. monositogenlerinin tekrarlanabilir böylece bağırsak mukozasındaki transloke ve çevre dokulara yayılması için Listeria patojen tarafından kullanılan mekanizmalarının incelenmesi sağlayan, sadece mide-bağırsak sisteminde koloni. Önemli olarak, model enfeksiyona ana doğal dirençte farklılıklarını incelemek için kullanılabilir. Bir önceki çalışmada, BALB / c / J fareler By / L. üstel çoğaltma ile, gıda kaynaklı listeriozis son derece duyarlı olduğunu gösterdi bağırsak, dalak, karaciğer ve safra kesesi 16 meydana monocytogenes. Bunun aksine, C57BL / 6 fareler L. yalnızca geçici kolonizasyonunu, gıda kaynaklı enfeksiyona karşı dirençli monocytogenes, bu dokuların her meydana gelen. Yakın insan hastalığı taklit gıda kaynaklı modelinin bir diğer özelliği doğal yayılması olduğunubeyin enfeksiyonu sonraki aşamalarında (5-7 dpi) sırasında meydana için.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brain Heart Infusion Agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>BD-241830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9650</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>Omnipur</td>
 <td>4840</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15575-038</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D5545</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase, type IV</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS004089</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS002007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Diff-Quik</td>
 <td>Dade-Behring</td>
 <td>B4132-1A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PowerGen 1000 homogenizer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-261-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stainless steel type 304 mesh #80</td>
 <td>Small Parts, Inc.</td>
 <td>CX-0080-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytospin</td>
 <td>Statspin</td>
 <td>M801-22</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

oral transmission of listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food

L. monocytogenes insanlarda gıda kaynaklı enfeksiyonlara neden fakültatif hücre içi bakteriyel patojenler bulunmaktadır. Çok az yakın insan hastalığı taklit eden küçük bir hayvan modelinin eksikliği nedeniyle listeriosis gastrointestinal faz hakkında bilinmektedir. Bu çalışma, L. sözlü iletim için yeni bir fare modeli açıklar monocytogenes. Fareler beslenen L., bu modeli kullanarak monositogenlerinin kirlenmiş ekmek duyarlı (BALB / c / j /) veya dirençli (C57BL / 6) fare suşlarının sistemik yayılmasını değişen derecelerde takip gastrointestinal enfeksiyon gibi ayrı bir faz vardır. Enfeksiyon daha sonraki aşamalarında, safra kesesi ve beyne yayılması görülmektedir. Listeriosis gıda kaynaklı modeli, son derece tekrarlanabilir özel beceri gerektirmez, ve bakteriyel izolatlar ve laboratuvar fare suşlarının geniş bir yelpazede kullanılabilir. Bu nedenle, L. tarafından kullanılan iki virülans stratejileri incelemek için ideal bir model monocytogenes </em&gt; bağırsak kolonizasyonu, hem de invaziv gıda kaynaklı bakteriyel enfeksiyon için ana tepki teşvik etmek.

L. monocytogenes kolonileri 37 ° C&#39;de 36-48 saat inkübasyondan sonra BHI / L + G plakaları görünür olacak Koloniler düzgün, kubbe şeklinde kremsi beyaz bir görünüm (Şekil 1A) var. Büyüme intestinal mikrobiyota çoğunluğu için inhibe ama L. olmayan bazı koloniler görmek için ortak olan edilecektir monocytogenes, direkt olarak seyreltme (Şekil 1B) olmadan ince bağırsak ya da kolon kaplama özellikle. Şüpheli koloniler CHROMagar <sup...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food at JoVE.com

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Bu kağıt kullanılarak farenin oral enfeksiyonu için yeni bir yöntemi anlatmaktadır<em&gt; Listeria monocytogenes</emGıda&gt;-kontamine. Protokol kolayca diğer gıda kaynaklı bakteriyel patojenler ile kullanım için adapte edilebilir.

Sözlü İletim<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Kirlenmiş Gıda Yutma ile Farelerde

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

oral-transmission-listeria-monocytogenes-mice-via-ingestion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

19.1K Görüntüleme.  University of Kentucky. Bu kağıt kullanılarak farenin oral enfeksiyonu için yeni bir yöntemi anlatmaktadır Listeria monocytogenes-kontamine. Protokol kolayca diğer gıda kaynaklı bakteriyel patojenler ile kullanım için adapte edilebilir.

Video: Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Makrofaj

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Deneysel Enfeksiyon<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Ana İnterferon-γ Yanıtları incelenmesi için Bir Model Olarak

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

bir<em&gt; In vitro</emTüberküloz Lezyonlarında İlaç Penetrasyonunu Öngören Caseum Bağlanma Testi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

Listeria Monositogenez Enfeksiyon beyin

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Listeria monocytogenes enfeksiyonu sonrasında Mouse dalağında In situ Interferon gama üretiminin görüntülenmesi

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Inducing Meningococcal Meningitis Serogroup C in Mice via Intracisternal Delivery

Neisseria meningitidis (meningococcus) is a narrow-host-range microorganism, globally recognized as the leading cause of bacterial meningitis. Meningococcus is a transient colonizer of human nasopharynx of approximately 10% of healthy subject. In particular circumstances, it acquires an invasive ability to penetrate the mucosal barrier and invades the bloodstream causing septicaemia. In the latest case, fulminating sepsis could arise even without the consequent development of meningitis. Conversely, bacteria could poorly multiply in the bloodstream, cross the blood brain barrier, reach the central nervous system, leading to fulminant meningitis. The murine models of bacterial meningitis represent a useful tool to investigate the host-pathogen interactions and to analyze the pathogenetic mechanisms responsible for this lethal disease. Although, several experimental model systems have been evaluated over the last decades, none of these were able to reproduce the characteristic pathological events of meningococcal disease. In this experimental protocol, we describe a detailed procedure for the induction of meningococcal meningitis in a mouse model based on the intracisternal inoculation of bacteria. The peculiar signs of human meningitis were recorded in the murine host through the assessment of clinical parameters (e.g., temperature, body weight), evaluation of survival rate, microbiological analysis and histological examination of brain injury. When using intracisternal (i.cist.) inoculum, meningococci complete delivery directly into cisterna magna, leading to a very efficient meningococcal replication in the brain tissue. A 1,000-fold increase of viable count of bacteria is observed in about 18 h. Moreover, meningococci are also found in the spleen, and liver of infected mice, suggesting that the liver may represent a target organ for meningococcal replication.

Here, we describe a method to induce meningococcal meningitis through an intracisternal route of infection in adult mice. We present a step by step protocol of meningococcal infection from the preparation of inoculum to the intracisternal infection; then record the animal survival and evaluate the bacterial loads in murine tissues.