Bu protokol önemli çünkü hücrelerin belirli bir sitokin ürettiği mikro çevreyi görselleştirmemizi sağlıyor, burada, interferon gama. Dokular çok karmaşık olduğu için sitokinlerin etki aralığının sınırlı olduğu kabul edilmektedir. Hangi hücrelerin onu kaplayacak larını saptamak için interferon gama üreten hücreleri çevreleyen hücreleri karakterize etmek önemlidir.
Tekniğin en büyük avantajı, ilgi dokusunda bulunan mikroortamı bozmamasıdır. Buna ek olarak, hücreleri interferon gama üretmeye zorlamak için yapay olarak yeniden uyarmadığımız için, bize hücrelerin aktif olarak interferon gama üretip üretmediği konusunda daha iyi bir tanımlama sağlar. Bu protokol potansiyel olarak diğer organlara ve diğer sitokinlerin görselleştirilmesine uyarlanabilir.
Bu protokoldeki adımların çoğu basittir, ancak doku işleme, donma ve kesit, doku bütünlüğünü korumak için özenle yapılmalıdır. Başlamak için, lm kültür 300 mikrolitre genetik olarak ifade OVA bir şişe de 37 derece Santigrat bir et suyu kalp infüzyonu için değiştirilir. OD600 0,08 ila 0,1 ulaşana kadar lm'yi üstel bir aşamaya getirmek için nazik ajitasyon için şişeyi çalkalayıcıya yerleştirin.
PBS'deki LM OVA kültürünü 0,1 kat öldürücü doza seyrelttikten sonra, %50'si 29-gauge insülin şırınga kullanarak 100 mikrolitreyi OT1 GFP veya OT1 RFP hücreleri taşıyan C57 siyah 6 vahşi fare alıcısına intravenöz olarak enjekte eder. Fare kurban etmeden 6 saat önce sitokin salgısını engellemek için 29-gauge insülin şırınga ile 250 mikrogram BFA ve 200 mikrolitre PBS intraperitoneal enjekte edin. Karbondioksit ve sonraki servikal çıkış kullanarak farelerin ötenazi sonra,% 70 etanol ile karın temizlemek.
Dalağının bulunduğu farenin sol kanadında, makasla deriden kesip 1-2 santimetrelik bir kesi yapın. Sonra, dikkatle dalak ortaya çıkarmak ve cımbız ile çıkarmak için periton bir kesi yapmak. Dalak mimarisini bozmamak için forceps ile sıkmak veya kesmek için dikkatli olun.
Şimdi, pbs 3.75 mililitre ve 0.2 molar L-lizin 3.75 mililitre karıştırarak fiksatif çözüm hazırlayın. Sodyum m-periodate 21 miligram ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra 2,5 mililitre %4 PFA ve 20 mikrolitre 12 normal sodyum hidroksit ekleyin.
Dalağını üç parçaya böl. Altı kuyulu bir plaka içinde fiksatif dalak batırın ve en az dört saat düzeltmek. Tipik bir fiksasyon dönemi nazik ajitasyon altında dört derece santigrat 16 ila 20 saattir.
Bundan sonra, fiksatif çözeltiyi atın ve hafif ajitasyon altında oda sıcaklığında beş dakika boyunca beş mililitre PBS ekleyin. Daha sonra, doku morfolojisini korumak için PBS'yi %30 sakaroz un beş mililitresi ile değiştirin ve 12 ila 24 saat kuluçkaya yatırın. Şimdi, organ tabağın dibinde batıyor.
Örneği dondurmak için, büyük bir hazneye kuru buz koyun ve yaklaşık 50 mililitre saf metanol ve birkaç parça kuru buz içeren daha küçük bir hazne yerleştirin. Dalağını tüy bırakmayan bir mendille hafifçe kurutun. Taban kalıbının altına bir damla OCT bileşiği damlatın ve dalağını kalıbın içine yerleştirin.
Herhangi bir kabarcıklar üretmek için dikkatli olun. Dalak üzerine yaklaşık bir mililitre OCT ekleyin. Forceps ile, kuru buz banyosunda metanol yüzeyinde taban kalıbı mevduat, metanol OCT dokunmaz emin olun.
OCT kalınlaşır ve dondurulduğunda beyaz olur. Eserleri en aza indirmek için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde doku dondurmayı unutmayın. Kriyo-mikrotomda eksi 20 santigrat derece sıcaklıkta.
Kesit doku istenilen kalınlıkta, yaklaşık 10 mikrometre. Cam mikroskop slaytları üzerine bölümleri toplamak ve görsel olarak incelemek için bir fırça kullanın. Bölümlerin oda sıcaklığına gelmesine izin verin.
Sıvı blokerile bir daire çizin, örneğin, bir PAP kalem, OCT dışında doku bölümü etrafında. Doku kuruduktan sonra, beş dakika boyunca doku bölümüne 100 mikrolitre PBS damlatarak numuneyi yeniden nemlendirin. Daha sonra, aspirasyon ile pbs kaldırmak ve örnek bölümü başına engelleme çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin.
Oda sıcaklığında en az bir saat kapalı ıslak bir odada kuluçka. Birincil antikorlarla lekelemek için, blokaj çözeltisini her numune için hazırlanan birincil antikor karışımıyla değiştirin. El yazmasına göre yıkamadan önce oda sıcaklığında veya gece boyunca kapalı ıslak bir odada dört saat kuluçka.
Şimdi, optimum konsantrasyon, genellikle mililitre başına 2,5 mikrogram, engelleme çözeltisi ilgi ikincil antikorlar seyreltmek. Son yıkama çözeltisini kesitten çıkarın ve hazırlanan ikincil antikor karışımını bölümün üstüne ekleyin ve kapalı ıslak bir odada oda sıcaklığında 1-4 saat kuluçkaya yatırın. El yazmasına göre yıkama tamponu ile yıkadıktan sonra, yıkama çözeltisini çıkarın ve PBS ile son bir yıkama yapın.
Fosfat tamponlu salini aspire edin ve kalan PBS'nin tamamen kurumadan buharlaşmasına izin verin. Slaydın arka kısmındaki bölümün etrafına bir daire çizin. Daha sonra, montaj ortamının bir damlasını numunenin üzerine yerleştirin, ortamın tüm bölümü kapladığından emin olun ve üzerine dikkatlice bir kapak camı yerleştirin.
Numune polimerazın bir gecede karanlıkta oda sıcaklığında satın. Sabah, ters spektral lazer tarama mikroskobu altında slayt yerleştirin. Sitokin subselliyer lokalizasyonunun analizi için hedefi 10x NA 0.40 veya 60x NA 1.4 olarak ayarlayın.
Bu protokolde interferon gama üreten hücreler görselleştirilir ve bulunur. F4/80 işareti tüm makrofajları etiketler ve kırmızı hamuru vurgular. İşaretleyici B220, B hücrelerini etiketler ve T-hücre bölgesini çevreleyen B hücre foliküllerini vurgular.
Marker CD169 etiketler marjinal bölge makrofajlar beyaz hamuru çevreleyen. Enfeksiyondan 24 saat sonra interferon gama, aktif antijene özgü OT1 CD8 T-hücreleri ve NK hücreleri de dahil olmak üzere birden fazla hücre tarafından üretilir. Sitokin salgılanmasını inhibe etmek için BFA kullanılmadan, NK hücreleri tarafından interferon gama tespiti büyük ölçüde bozulmuştur.
LM OVA enfeksiyonu sonrasında interferon gama üreten hücrelerin yerini tespit etmek için B hücreleri, marjinal bölge makrofajları ve tüm makrofajlar boyandı. İlginçtir, kümelenmiş antijen spesifik T-hücreleri dalak beyaz hamuru boyunca bulunan bulundu, ama sadece NK hücrelerinin onlarla birlikte olduğu bölgelerde interferon gama üretmek. Interferon gama ve NK ile CD8 pozitif T-hücrelerinin farklı hücre altı lokalizasyonu gösterilmiştir.
NK hücrelerinde interferon gama lokalizasyonu sitosol da yaygıniken, CD8 pozitif T-hücreleri genellikle başka bir T hücresine doğru interferon gama işe. Brefeldin A enjeksiyonu situ in situ tespit etmek için çok önemlidir. Hücreler genellikle hızlı bir şekilde salgılar ve sitokinleri alır ve biz hücrelerde birikmesine izin sitokin salgısını inhibe etmek gerekir.
Bu yöntem, sitokin üreten hücreleri kendi yerel ortamlarına yerleştiren bir keşif aracıdır. Bu ortamın bileşimini deşifre etmek, bu konumda bulunan ve interferon gama'yı etkilenebilen veya etkilenebilen doğru hücrelere veya bağışıklık arabulucularına odaklanmamızı sağlar. Bir dokudaki bir hücrenin kesin lokalizasyonunun işlevi için çok önemli olduğu giderek artan bir anlayış vardır.
Protokolümüz, sitokin üreten hücrelerin lokalizasyonunu belirlememize ve bu sayede işlevini daha da karakterize etmemize olanak tanır.
