DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

NOT: Tüm hayvan prosedürleri Federal düzenlemelere bağlı kalarak, Louisville Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen kurallar çerçevesinde gerçekleştirildi. Düşük Ca 2+ ve 2 mM Ca 2 + Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (aCSF) 1. hazırlanması guruplarına <ol><li> Tablo 1&#39;de açıklandığı gibi 2x düşük Ca 2 + (0.1 mM) Stok C tampon, 2x, normal Ca 2 + (2 mM) Stok bir tampon ve 2x Stok B tampon hazırlayın. Bireysel stok solüsyonları iyon içeriği değiştirilmesine izin (örn, düşük ya da sıfır, Ca + 2) ve bir aya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Diseksiyon sırasında intrakardiyak perfüzyon için, 1x düşük Ca 2+ aCSF yapmak için plastik bir şişenin içine 2x düşük Ca 2 + Stok C 100 ml ve 2x Stok B 100 ml ekleyin. Mix ve 4 ° C&#39;de gece boyunca saklamak veya taze yapmak. </li><li> Imag sırasında ex vivo olarak omuriliğin perfüzyon içining 1x aCSF oluşturmak için bir 1 L&#39;lik bir cam şişe içine 2 x normal bir Ca + 2 Hazır A 500 ​​ml ve 2 x stok B 500 ilave edin. Karıştırınız ve oda sıcaklığında gece boyunca depolamak ya da taze olun. </li><li> 7.4 aCSF tampon pH ayarlayın. Oda sıcaklığında aCSF tutarken, buz üzerinde düşük Ca 2 + aCSF yerleştirin ve kabarcık karbojen gazı ile iki tampon (% 95 O2;% 5 CO2) 30 dakika önce, perfüzyon sırasında sürekli olarak kullanmak için. </li></ol> Ex Vivo Görüntüleme Odası 2. Hazırlık <ol><li> ACSF şişe etrafında bir ısıtma battaniye (hayır otomatik kapanır) sarın ve düşük / orta ayarda ısı ayarlayın. </li><li> Şekil 1A &#39;da gösterildiği gibi iki kutuplu bir sıcaklık kontrol ve geri besleme sıcaklık probu vasıtasıyla kontrol edilir ısıtıcı bir perfüzyon pompaya ve hat-içi bağlı şişe içine özel bir CSF perfüzyon hattı yerleştirin. </li><li> 2-foton uyarma / conf düz bir mikroskop sahne eki (152 x 102 mm) takınocal mikroskop sahne bir dökülme kabı ile donatılmış. </li><li> Büyük bir açık-banyo perfüzyon odasına yerleştirin (G x U x Y; 12 x 24 x 8 mm) dökülme kabına (uygun ex Şekil 1B görmek uyum ve ex vivo omurilik taze oksijenli aCSF sürekli akışını sağlamak için ) odası tasarımı görüntüleme vivo. </li><li> Uygun boru kullanılarak ex vivo görüntüleme odasının giriş-line ısıtıcının metal çıkış portuna bağlayın. Görüntüleme sırasında tampon / doku sıcaklığını korumaya yardımcı olmak için, ex vivo görüntüleme odasının altında ince bir emici pedi yerleştirin. </li><li> Çıkarılabilir yapışkan yapışma kullanarak dökülme konteyner / sahne ucun altına ex vivo görüntüleme odasına uyun. yapışkan tack malleability AMAÇ ışık yolu doku yüzeyine dik olduğundan emin olmak için gerektiği gibi odası ayarlanır sağlayacaktır. Gerekirse, bölme ayarlamak için bir daireye düzeyini kullanır. </li><li> Güvenli birbölmesi sıvı girişinin yakınına, ısıtıcısı geri besleme sıcaklık probu ve oda çıkışında bir elektrik hattına bağlı bir paslanmaz çelik emme tüpü. Manyetik bant ve uygun mikropipet sahipleri, bu bağlamda da faydalıdır. Vakum kaynağı açın. </li><li> Oksijenli aCSF ile görüntüleme odasını dolduran başlamak için perfüzyon pompası açın. Dakika başına 1.5-2 ml perfüzyon pompası ayarlayın. </li><li> Vakum hattı ayarlayarak görüntüleme odasında aCSF düzeyini kontrol eder. Bu omurilik kesimi kapsayacak ve su daldırma objektif ve doku yüzeyi arasında yeterli çalışma mesafesi sağlamak için görüntüleme odasının yeterli aCSF olması önemlidir. Doku segmenti tamamen için deneyci kaynaklı eserler önde gelen taze oksijenli aCSF altındayken değilse miyelin ve akson zararlı etkilenebilir. </li><li> Görüntüleme odasında o perfüzyon sıcaklığı oda sıcaklığına yakın yani in-line ısıtıcı sıcaklık kontrolörü ayarlayın. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Yetişkin Kemirgen Servikal Omurilik diseksiyonu <ol><li> Intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi sodyum pentobarbital (200 mg / kg) aşırı dozda enjekte edilerek bir yetişkin, 6-10 haftalık thy1 -YFP transjenik fare (Dorsal kök ganglion nöronlarının floresan protein ekspresyonu sahip kullanılması uygun suş) ile öldürülür. </li><li> Bir kez anestezi seviyesinin doğru (örneğin, ayak tutam ve göz kırpma refleksinin kaybı yok reaksiyon), dikkatle cerrahi makası ile omurilik ve beyin örten cilt tıraş altında. Betadin ve% 70 etanol yastıkları kullanarak cildi temizlemek. </li><li> % 70 etanol ile göğüs / karın alan Sprey, daha sonra soğutulmuş, karbojen-kabarmış düşük Ca kullanarak transkardiyal konuyu serpmek 2+ aCSF. (Bakınız Şekil 1C önerilen diseksiyonu tezgah üst kurmak). </li><li> Karaciğer sönük kalır gibi, küçük bir klip kullanarak kalbin içine perfüzyon iğne sabitleyin. Traş dorsal yüzü erişmek için konu üzerinde çevirinkonu ve% 70 etanol ile traş bölgeyi silin. </li><li> Beyin ve omur sütunu (Şekil 2A) maruz diseksiyon makas kullanarak kalça burun başlayarak orta hat boyunca dorsal cilt kesi yapmak. Burun ve kalça de işaretçilerine koyarak hazırlık sabitleyin. </li><li> Bu noktada bir diseksiyon mikroskop kullanarak, sıkıca koku ampuller düzeyinde kafatasının dorsal yüzeyi boyunca kesti. Kesi lateral kenarları içine makas ipuçlarından birini yerleştirin ve bilateral beyincik kadar takke kenarlarında kesilmiş. NOT: diseksiyon boyunca omurilikten örten doku kaldırmak için daha sonra gerekli gibi tamamen takke tüketim etmeyin (Şekil 2B bakınız). </li><li> Beyin maruz takke kaldırın. Yavaşça (beyincik bulunan) interparietal kemik sol ve sağ kenarları kesilmiş ve (beyin sapı / omurilik maruz kaudal geri Şekil 2C çekin </strong&gt;). </li><li> Masa yüzeyine 45 ° açıda ince uçlu makas kullanın ve posterior sinir köklerine ikili sadece alt vertebra kesti. NOT: Parlak beyaz dorsal sütunları ile temastan kaçının. Bu lifler (Şekil 2B) yansıması olacak ve kolayca zarar görebilir olanlardır. </li><li> Keser omuriliği ortaya çıkarmak için yapılır gibi yavaşça tek parça örten doku çekerek, ince uçlu forseps ile vertebral kolonun takke ve dorsal yüzeyini kaldırın. Sonraki görüntüleme (Şekil 2E) servikal kord 1-2 cm&#39;lik bölümünü izole etmek üst torakal düzeyde vertebra kesmeye devam. </li><li> Sütununun altında vertebral kolon ve net dokuya doku / kemik paralel kesmek için makas kullanın. Mümkün olduğunca aynı seviyede bu kesim yapmak. Kord görüntüleme için seviyede olacak şekilde doku bölmesi içinde olmasını sağlayacak çok önemlidir. </li><li> Geçmiş (beyin sapı transect için 11. neşter kullanıngracile fasikül liflerin) ve servikal spinal kord segmenti izole üst torakal düzeyde sonlandırma () Şekil 2F Bkz. Bu aynı iki noktada doku / kemik kesmek için makas kullanın. İzole doku kuyruk beyin sapı, servikal genişleme ve üst torakal spinal kord (Şekil 2G) kapsayan vertebral kolonun 2/3 içermelidir. </li><li> Karbojen-kabarmış, soğutulmuş düşük Ca bir petri 2+ aCSF içine izole omuriliğe yerleştirin. Gerekirse bu çanak düz yatıyor kadar, omurganın altında doku kırpın. </li><li> Ex vivo görüntüleme odasına izole belkemiğine aktarın ve 36 için 1 saat boyunca perfüzyon sıcaklık artışı - 37 ° C. Görüntüleme sırasında bu sıcaklığı korumak. </li></ol> Nil Kırmızı Görüntüleme Odası ve Miyelin Etiketleme içine Ex Vivo Omurilik 4. Yerleştirme <ol><li> Dikkatle i vertebra sütun güvenliğiniUygun bir montaj dilim ile maging odası aşağı ince lycra parçacığı oluşan dikey ızgara platformu ile modifiye tutun (Şekil 3A görmek omurilik için yer sağlamak için ızgara platformu orta Konuları kaldırmak). </li><li> (DMSO içinde 5 mM&#39;lik bir stok ve süzüldü 0.22 um, 4 ° C, ya da karanlıkta -20 ° C&#39;de 6 ay, 1 ay boyunca saklanabilir) Nil kırmızısı bir kısım çözülme. Sadece görüntüleme odasına Nil Kırmızı eklemeden önce, perfüzyon pompa akışını azaltmak ve odasında sıvı daima omuriliği kapsar emin olmak için vakum hattı ayarlayın. </li><li> Kord (Şekil 3B) kaudal ucuna yakın görüntüleme odasına 5-10 ul Nil Kırmızı stok solüsyonu ekleyin. Yavaşça oda boyunca, Nil Kırmızısı karıştırmak için 1 ml pipet kullanın. Nil Kırmızı, sonra 1-2 dakika odasında kalmak geri vakum hattı koyun ve sürekli omuriliği serpmek için min başına 1.5-2 ml perfüzyon pompası ayarlamak için izin ver. </li><li> Dikkatle mikroskop sahne yükseltmeksuya daldırma hedefi odasında aCSF yüzeyinden yaklaşık 10 mm kadar ve omurilik segmentinin merkezi ve medial dorsal sütunlar üzerinde hedefi hizalayın. Hafifçe aCSF yüzeyine temas edene kadar yavaşça aşağıya hedefi getirmek için mikroskop burun parçası odak tekerleğini kullanın. Görüş alanı (Şekil 3C) içine dorsal sütunları odaklanmak bir epifluorescent ışık kaynağı kullanın. </li></ol> TPLSM ve Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Fare Omurilik 5. Ex Vivo Görüntüleme (Lisci) Not: arka damar ince yapılı fasikül elyafları gibi doku merkezi için yararlı bir marker sağladığını (sırt kök ganglion hücre gövdesinden çıkan ve T6 arasından çıkmak ve aşağıdaki omurilik orta hat boyunca), bu kan damarı paralel uzanır. kalın YFP + servikal dorsal kök projeksiyonları da lifler yükselmek gibi yararlı bir işaretleyici sağlamak ve Y yanal inmekKüçük bir çapa sahip olan AP + ince yapılı fasikül lifleri. <ol><li> Spinal kord dokusu uygun hizalanmış sonra, lazer tarama moduna geçiş artan gracile fasikül miyelinli liflerin temel görüntüleme gerçekleştirmek için. Hem YFP ve Nil Kırmızı heyecanlandırmak için, floresan emisyon izole etmek 950 nm dalga boyunda (~ bir 25X, 1.1 NA amacı çıkışında ölçülen 17 mW) ve uygun dichroics (DM) ve bant geçiren filtreler için ayarlanmış bir iki-foton lazer kaynağı kullanın fluorophores (biz sarı-turuncu, kırmızı ve genişletilmiş kanalları, sırasıyla içine YFP ve Nil Kırmızı ayırmak için, 525/50 DM560, 600/60 DM640 ve 685/70 kullanın). <ol><li> Akson fazla% 3 temel görüntüleme (30-60 dakika) sırasında aksonal sferoidler gösteriyorsa nedeniyle deneyci kaynaklı eserler hazırlık atın. </li></ol></li><li> 30.3X görüş alanını büyüterek bir Lisci indükleyin (bir ~ 20 mikron çapında ablasyon oluşturmak için). Dinle 800 nm lazer ve en ~ 110 mW için lazer gücünü artırmakÖrnek. Lifler tamamen transeksiyon sağlamak için görünüm lazer taramaları 5 tam alanını izin verin. </li><li> (Numune, 2.08X de 950 nm, 17 mW) görüntüleme ayarlarına geri lazer ayarlarını değiştirerek Lisci onaylayın ve ablasyon görselleştirmek için doku tarayın. Ablasyon çapını doğrulayın ve birincil ablasyon aksonlar tamamen transeksiyon olduğunu (Şekil 3D bakınız). Yaralanma sonrası 8-10 + saat kadar yaralanma akson ve miyelin dinamik tepkisini kaydetmek için z yakalama ile birlikte mikroskop zaman atlamalı ayarlarını kullanın. NOT: ablasyon eksik ise (yani, liflerin eksik yaralanması), şaşırmış olacak birincil ve ikincil yaralanma mekanizmalarının belirlenmesi gibi, hazırlık atın. Buna ek olarak, izole spinal kord segmentleri Lisci bağımsız doku hasarı orta sadece hafif 24 saat sonrası Lisci kadar görüntülü olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS.">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).</li><li>Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+regulating+axon+regeneration:+an+integrin+perspective.">Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective.</a> Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).</li><li>McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+in+combinatorial+approaches+for+spinal+cord+regeneration.">Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration.</a> Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).</li><li>Pernet, V., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Nogo-A+in+axonal+plasticity,+regrowth+and+repair.">The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair.</a> Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).</li><li>Bradbury, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitinase+ABC+promotes+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury.</a> Nature. 416, 636-640 (2002).</li><li>Cregg, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+beyond+the+glial+scar.">Functional regeneration beyond the glial scar.</a> Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).</li><li>Park, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+axon+regeneration+in+the+adult+CNS+by+modulation+of+the+PTEN/mTOR+pathway.">Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway.</a> Science. 322, 963-966 (2008).</li><li>Coleman, M. P., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration,+wld(s),+and+nmnat.">Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).</li><li>Sulaiman, W., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+peripheral+nerve+injury,+regeneration,+and+functional+recovery:+from+bench+top+research+to+bedside+application.">Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application.</a> Ochsner J. 13, 100-108 (2013).</li><li>Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+a+new+growth+cone+after+axotomy:+the+precursor+to+axon+regeneration.">Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).</li><li>Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganized+microtubules+underlie+the+formation+of+retraction+bulbs+and+the+failure+of+axonal+regeneration.">Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration.</a> J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).</li><li>Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+degeneration+'dieback'+in+the+corticospinal+tract+after+transection+injury+of+the+rat+spinal+cord:+a+confocal+microscopy+study.">Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study.</a> J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).</li><li>Fishman, P. S., Mattu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+severed+cortical+projection+axons.">Fate of severed cortical projection axons.</a> J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).</li><li>McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+activated+phagocytes+and+myelin+degeneration+to+axonal+retraction/dieback+following+spinal+cord+injury.">The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury.</a> Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).</li><li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+treatment+reduces+delayed+oligodendrocyte+death,+attenuates+axonal+dieback,+and+improves+functional+outcome+after+spinal+cord+injury.">Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+laser-scanning+microscopy+of+Ca2++dynamics+in+visual+motion-sensitive+neurons.">In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons.</a> Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).</li><li>Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+of+cortical+astrocytic+networks+in+vivo.">Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo.</a> PLoS Biol. 2, 96 (2004).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-+and+short-term+intravital+imaging+reveals+differential+spatiotemporal+recruitment+and+function+of+myelomonocytic+cells+after+spinal+cord+injury.">Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury.</a> J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+single+neuron+axotomy+triggers+axon+regeneration+to+restore+synaptic+density+in+specific+cortical+circuits.">In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits.</a> Nat Commun. 4, 2038 (2013).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo.">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58, 1133-1144 (2010).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+microglia+in+the+mouse+cortex+in+vivo.">Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation.">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nat Commun. 3, 1227 (2012).</li><li>Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+maintenance+of+molecular+domains+in+myelinated+axons.">Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons.</a> J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).</li><li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2-mediated+alternative+activation+of+microglia+is+protective+after+spinal+cord+injury.">Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury.</a> Brain. 137, 707-723 (2014).</li><li>Greenspan, P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrofluorometric+studies+of+the+lipid+probe,+nile+red.">Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red.</a> J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).</li><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).</li><li>Tajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hemodynamic+response+to+acute+hyperoxia+in+awake+mice.">Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice.</a> Brain Res. 1557, 155-163 (2014).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80, 900-913 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+behavior+activates+Bergmann+glial+networks.">Motor behavior activates Bergmann glial networks.</a> Neuron. 62, 400-412 (2009).</li><li>Tsutsui, S., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+injury+to+axons+and+myelin.">Metabolic injury to axons and myelin.</a> Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).</li><li>Matute, C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+white+matter+in+central+nervous+system+pathophysiologies.">Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies.</a> ASN Neuro. 4, (2012).</li><li>Matute, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dyshomeostasis+in+white+matter+pathology.">Calcium dyshomeostasis in white matter pathology.</a> Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).</li><li>Stys, P. K., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+matter+NMDA+receptors:+an+unexpected+new+therapeutic+target.">White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target.</a> Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).</li><li>Baltan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+anoxia:+a+tale+of+two+white+matter+tracts.">Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts.</a> Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).</li><li>Stirling, D. P., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+injury:+internodal+nanocomplexes+and+calcium+deregulation.">Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation.</a> Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues.">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys J. 89, 581-591 (2005).</li><li>Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration.">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li><li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons.">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li><li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu yüzey görüntüleme ex vivo olarak omurilik miyelinli aksonlar (yani, ince yapılı fasikül) zaman içinde hem birincil hem de ikincil miyelinli aksonal dejenerasyon dinamik ilerlemesini incelemek için bir lazer kaynaklı, omurilik yaralanması ile birleştirildi. Ex vivo görüntüleme için bir yöntem tarif Omurilik gibi hareket eserler ve uzun süreli görüntüleme oturumları sırasında deneyci kaynaklı hipoksi potansiyeli olarak in vivo görüntüleme ile ilişkili kom...

Akson Dejenerasyon nörotravma, inme, otoimmün ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere birçok nörolojik koşulları kapsayan morbidite önemli bir nedenidir. Periferik sinir sistemi (PNS), santral sinir sistemi aksine (MSS) aksonlar kez nedeniyle iç ve dış engelleri (yani, miyelin dejenerasyonu sırasında skar oluşumu sırasında üretilen ve serbest aksonal büyüme inhibitör molekülleri) 1 hem yaralı yenilemek için sınırlı bir kapasiteye sahip -7. Bu engellerin çeşitli yaygın araştırdı olmasına rağmen, tedavi amaçlı müdahaleler, MSS akson dejenerasyonu önlemek sağlam aksonal rejenerasyonu teşvik ve fonksiyonel connectively geri, sınırlı kalmaktadır. Bir kez soma ayrılmış aksonlar akson şişlik, sfero oluşumu ve (8 gözden) nihai parçalanma ile karakterizedir Wallerian dejenerasyon olarak bilinen dejenerasyonun bir basmakalıp sürecine tabi. Içindekontrast, nakledilen periferik akson soma ile süreklilik kalır proksimal güdük, sonraki aksonal rejenerasyon için hayati bir ön koşul gerekli, bir ucunda şişlik oluşturan geri Ranvier yakın düğüme ölür, ve sonra büyüme konisinin oluşumunu başlatabilir 9-11. Buna karşılık, birçok aksonlarda proksimal akson uçlarının, karakteristik &quot;endbulbs&quot; veya retraksiyon ampuller oluşturan büyüme konileri oluşturur, ve bunun yerine uzak onlar yaralanma 12-15 sonraki ay kalır yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. Primer aksonal hasara ek olarak, ek akson hasarı / kaybı da büyük ölçüde ilk yaralanma bağışladı akson oluşabilir. Başlangıçta bağışladı akson Bu gecikmiş akson kaybı gibi ikincil aksonal dejenerasyon denir. Yaralanma MSS akson Bu doğal tepki fonksiyonel aksonal rejenerasyon beyin ve omurilikte ulaşmak için daha da zor hale golü. Ha ne kadaraksonal yaralanma (örneğin, sfero oluşumu, retraksiyon ampuller) ve llmarks iyi ölüm sonrası doku ve aksonal dejenerasyon deneysel modellerden karakterize edilmiştir, bu dinamik süreçleri altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması sınırlı olmuştur. Bu çalışmaların çoğu doğal zamanla bireysel akson yanıtları yakalamak için başarısız statik uç nokta gözlemlere dayanıyordu. Gerçi dışsal olarak aksonal izleyiciler statik bölümlerden ve canlı görüntüleme sırasında aksonal yanıtları aydınlatmak için yararlı olmuştur uygulanan genetik olarak kodlanmış aksonal belirteçlerin kullanılabilirliği floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak aksonlar görselleştirmek için yeteneğimizi oldukça geliştirdi. Nitekim, Kerschensteiner ve meslektaşları bir seminal rapor ilk spinal dorsal sütunları kendi projeksiyonlarını göndermek nöronların alt kümelerinin yeşil floresan proteinini kodlayan Thy1 GFP-S fareleri kullanarak in vivo aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon doğrudan kanıt sağladıkord 16. Canlı görüntüleme iki foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM) kullanarak yaklaşımları ve ilgi hücrelerin genetik floresan protein etiketleme gibi aksonal dejenerasyon, Ca 2 + sinyalizasyon, aksonal rejenerasyon, astrosit fizyolojisi gibi birçok farklı dinamik süreçlere doğrudan kanıt ve mekanik anlayış vermeye devam mikrogliyal fizyolojisi ve yaralanma 17-25 yanıt. Akson aksine, çok az gerçek zamanlı olarak yaralanma miyelin tepkilerinin bilinmektedir. Miyelin PNS CNS ve Schwann hücrelerinde oligodendrositler tarafından üretilen ve tutulan beyaz cevherin önemli bir bileşenidir. Miyelin akson yüzeyinin% 99 yalıtım ve böyle yaparak son zamanlarda Buttermore ark. 26 tarafından gözden hızlı ve verimli saltatory darbe yayılımını destekleyen bir yüksek direnç, düşük-kapasite koruyucu kaplama sağlar. Biz solvatokromik, lipofilik kullanmak yaralanma miyelin dinamik tepkisini yakalamak içinFloresan boya Nil kırmızısı 27. Bu hayati leke solvatokromik özellikleri fiziko-kimyasal ortamına 28,29 bağlıdır emisyon spektrumunun spektral vardiya izin verir. Bu özellikler axomyelinic yaralanma mekanizmaları anlamak için yararlıdır ve uygun seçilmiş dichroics ve emisyon filtreleri kullanılarak görüntülendi veya spektral mikroskopi kullanılarak 27 çözülebilir. Örneğin, Nil Kırmızısı emisyon spektrumu mavi-kaydırılmış örneğin adipositler ve normal bir merkezi sinir sistemi miyelin (tepe emisyon ~ 580-590 nm) 27 bulunan bu gibi daha az polar lipid bakımından zengin ortamda bulunmaktadır. Buna karşılık, ~ 625 nm akson olarak oluşturulmuş endbulbs içinde bu hayati boyanın emisyon spektrumu zirveleri aksonal tepe kurumalarına 27 uğrarlar. Normal miyelin karşı endbulbs içinde özellikle bu spektral vardiya altında yatan kesin mekanizmalar belirsiz kalmasına rağmen, bu tür spektral değişiklikler, protein birikimi veya dağınıklığı yol altında yatan değişiklikler gösterebilirhidrofobik bağlama bölgelerinin 27 maruz kalma. In vivo görüntüleme kendi doğal ortamında omurilik aksonal yaralanma dinamiklerini gözlemlemek için nihai metrik iken, bu teknik açıdan zor ve önemli bir cerrahi uzmanlık gerektirir, ve sık sık (örneğin, inflamasyon ve yara deneysel eserler tanıtmak olabilir dorsal sütun açığa ameliyatları tekrar formasyonu). Buna ek olarak, pahalı ekipman genellikle mikroskop objektif mercek altında sağlam bir hayvanın süspansiyon ve konumlandırma izin vermek için gereklidir. hayvanlar dikkatle sıvılar doldurulan sağlamak için, nedeniyle uzamış anestezi görüntüleme oturumlara hipoksi hiçbir işaret olmadığından emin olmak için, sıcak kalmasını sağlamak için de izlenmesi gerekir. akson ve miyelin kesinlikle canlı kalması için sürekli perfüzyon ve yeterli oksijen seviyelerini gerektiren ikinci derece önemlidir. Ancak, bu genellikle bildirilen veya in vivo çalışmalar çoğu izlenmeztarihi. Buna ek olarak, kalp hızı ve solunum için hareket eserler (izofluran yetişkin fare anestezi: ~ dakika başına 300-450 atım (BPM)% 97-98 oksijen doygunluğunu (Normal oranı ~ 632 BPM) ve korumak için en uygunudur ~ 55-65 nefes dakika başına kaçınılmaz bu hareketin tabidir sırasıyla)) 30 bile hızlı lazer taramaları zorlu yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında karşılaşılan (Normal oranı ~ 163 dk başına nefes olduğunu) eserler. Uyanık hayvanlarda kemirgen omurilik görüntüleme izin verebilir bir implante sert vertebra çerçeveli pencere ile kombine ultra hızlı rezonans tarayıcıları gelişmeler, ancak daha hızlı tarama kez kaçınılmaz gürültü oranı aşağılayıcı görüntü kalitesi sinyali azaltır. Şu anda beyin görüntüleme için kullanılan spinal kord görüntüleme tekniklerindeki gelişmeler daha fazla bu engellerin birçoğu üstesinden gelmek ve ina tarafından tanıtıldı potansiyel boşa sınırlayabilirdequate doku perfüzyon, örneğin, 31-33. Beyaz cevher fizyolojisi ve beyaz cevher hasarı mekanizmaları hakkında bildiklerimizin çoğu vitro veya optik sinir, periferik sinir ve omurilik beyaz madde 34-41 şeritler beyaz madde ex vivo hazırlıklarında kullanılarak tespit edilmiştir. Çevresel faktörler değişiklikleri, canlı doku uyuşturucu ve reaktiflerin kontrollü uygulama, elektrofizyoloji kullanarak fonksiyonel değerlendirmeler ve akson doğrudan floresan mikroskop gözlemleri ve miyelin kontrollü izin gibi bu hazırlıklar beyaz cevher hasarı mekanizmaları bilgimizi ilerletmek için devam ediyor. Ancak, daha önceki bazı yaklaşımlar kaçınılmaz yakından karşı akson yanıtı etkileyebilir çıkarma aşamasında yüzey aksonları zarar omurilik dorsal kolon şerit veya ventral beyaz cevher şeritler aksonlar gözlemlemek için. Yukarıdaki deneysel manipülasyonlar yararlanmak ve A.Ş. zarar görmemesi içinomuriliğin dorsal doğrudan temasını engeller soruşturması kapsamında ry lifler, biz bir ex vivo servikal spinal kord modeli kullanın. Böylece, pia mater ve komşu yüzeysel dorsal kolon akson mimarisi izolasyonu sırasında canlı ve soğukkanlı kalır. Yaralanma sonrası 10+ saat - İşte onlar dinamik 8 gerçek zamanlı bir odak yaralanma cevap olarak, merkezi miyelinli akson doğrudan görselleştirme sağlar nispeten basit bir yaklaşım açıklar. Lazer kaynaklı omurilik yaralanması (Lisci) modeli mekansal zamanla kısıtlı kalır primer lezyon (ablasyon sitesi) gibi birincil ve ikincil aksonal yaralanma mekanizmaları arasındaki farklılaşmayı izin verir. açık banyo görüntüleme odası terapötik müdahale, reaktif teslimat ve çevre manipülasyonlara erişilebilir. Putatif axomyelinic koruyucu maddeler hızla doku sürecini kapsayan uzun ve masraflı deneyler karşı doğrudan gözlemlerle gerçek zamanlı olarak değerlendirilebiliring, bu nedenle, immün, görüntü yakalama ve analiz kesit ve canlı hayvanlarda deneysel maddeleri test etmeden önce akut yanıtları ve koruyucu manipülasyonlar değerlendirmek için yararlı bir vekil model sunar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="968">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:341px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large bath chamber with slice supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Slice Supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SS-3</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-27LP/10</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">ST-1L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solution In-line heater/cooler</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SC-20</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CL-100</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Liquid Cooling System</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">LCS-1</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Cable assembly for heater controllers</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CC-28</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">TS-70B</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Magnetic holder with suction tubing</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH-S</td>
			<td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Adjustable holder</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH</td>
			<td>To hold the temperature probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">clear silicone sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">superglue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">thin plexiglass strips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">nile red</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td>N-1142</td>
			<td>For labeling myelin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

Yaralı MSS aksonlar rejenere ve genellikle uzak yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. İlk yaralanma kurtulmuş aksonlar sonra ikincil aksonal dejenerasyonu uğrayabilir. Spinal kord içindeki büyüme konisinin oluşumu, rejenerasyon ve ek miyelinli akson projeksiyonlar kaybı olmaması büyük ölçüde yaralanma sonrası nörolojik iyileşme sınırlar. Omuriliğin miyelinli aksonları yaralanma nasıl tepki merkezi değerlendirmek için, biz kaderi belgelemek için sarı floresan akson protein ve fokal ve yüksek tekrarlanabilir lazer kaynaklı omurilik yaralanması ifade transgenik fareler kullanan omurilik modeli yaşayan bir ex vivo geliştirdi İki foton uyarma time-lapse mikroskopi kullanılarak akson ve zamanla miyelin (lipofilik floresan boya Nil Kırmızı). Akut aksonal yaralanma, akson retraksiyon ve miyelin dejenerasyonu gibi dinamik süreçler en iyi gerçek zamanlı olarak incelenmiştir. Ancak, çürük temelli yaralanmalar ve hareket eserler olmayan odak doğa karşılaştıyüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak zorlu birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında. Burada anlatılan ex vivo omurilik modeli aksonal şişme, sfero oluşumu, akson Transeksiyon, ve gerçek-zamanlı olarak bu dinamik süreçleri incelemek için yararlı bir model sağlayan şişme peri-akson olmak üzere klinik olarak anlamlı kontuzyon / sıkıştırma kaynaklı aksonal patolojilerin çeşitli yönlerini taklit eder. Bu modelin önemli avantajları doğrudan akson ve ikincil yaralanma mekanizmaları yaralandı birincil hakaret arasındaki farklılaşmayı sayesinde mükemmel bir uzaysal çözünürlüğü vardır; doğrudan Perfüzat banyo kablosunu reaktif kontrollü infüzyon; Çevre ortamın kesin değişiklikler (örneğin kalsiyum, sodyum iyonları, aksonal yaralanma, ama imkansız yakın bilinen katkıda in vivo işlemek için); onlar görselleştirmek için bir fırsat olarak ve kemirgen modeller de bir avantaj sunuyoruz vegenetik belirlenen hücre popülasyonları ve hücre içi yapıları manipüle. Burada, biz izole etmek ve görüntü farelerin yaşayan omurilik akut aksonal yaralanma dinamiklerini yakalamak için nasıl açıklar.

Uygun bir canlılığı, izole korumak için gerekli kurmak laboratuar ve görüntünün Detayları ex vivo omurilik Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Mikroskop ayarlanabilir darbeli femtosaniye lazer, uygun dicroics ve emisyon filtreleri ve bir su- ile donatılması gerekmektedir yüksek sayısal diyafram objektif lens daldırma (≥1.0). Diseksiyon sırasında omurilik canlılığını sağlamak için, prosedür izole akson membranlar 42 mühür için 2+ yeterli Ca veriy...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time at JoVE.com

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K Görüntüleme.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

Video: An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Yanal Akışkan Perküsyon: Travmatik Beyin Hasarı Farelerde Modeli

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Nörobilim

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

Fare Embriyonik Omurilik Tüm Dağı Hazırlık aksonal dallanma Eğitim DRG Nöronlar DII-Etiketleme

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, Zebra balığı rejenerasyon modelini Müller Glia hücre aktivasyonu

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied in vitro using the neurosphere assay. This colony-forming assay is a powerful tool to study the response of NSCs to exogenous factors in a dish; however, this can also be used to study the effect of in vivo manipulations with the proper understanding of the strengths and limitations of the assay. One manipulation of the clinical interest is the effect of injury on endogenous NSC activation. Current models of spinal cord injury provide a challenge to study this as the severity of common contusion, compression, and transection models cause the destruction of the NSC niche at the site of the injury where the stem cells reside. Here, we describe a minimal injury model that causes localized damage at the superficial dorsolateral surface of the lower thoracic level (T7/8) of the adult mouse spinal cord. This injury model spares the central canal at the level of injury and permits analysis of the NSCs that reside at the level of the lesion at various time points following injury. Here, we show how the neurosphere assay can be utilized to study the activation of the two distinct, lineally-related, populations of NSCs that reside in the spinal cord periventricular region - primitive and definitive NSCs (pNSCs and dNSCs, respectively). We demonstrate how to isolate and culture these NSCs from the periventricular region at the level of injury and the white matter injury site. Our post-surgical spinal cord dissections show increased numbers of pNSC and dNSC-derived neurospheres from the periventricular region of injured cords compared to controls, speaking to their activation via injury. Furthermore, following injury, dNSC-derived neurospheres can be isolated from the injury site &#8212; demonstrating the ability of NSCs to migrate from their periventricular niche to sites of injury.

Here, we demonstrate the performance of a minimal spinal cord injury model in an adult mouse that spares the central canal niche housing endogenous neural stem cells (NSCs). We show how the neurosphere assay can be used to quantify activation and migration of definitive and primitive NSCs following injury.

Endojen nöral kök hücre etkinleştirme en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında, fare modeli değerlendirmek için bir Neurosphere tahlil

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Etkinlik tabanlı eğitim omurilik ile bir koşu bandı üzerinde Wistar fareler yaralı

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

Farelerde Tam Traneksiyon Tipi Spinal Kord Yaralanması İndüksiyonu

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...