Bu eser R01 NS052532 (HLH için), Moody Vakfı ve Anesteziyoloji Bölümü tarafından finanse edilmektedir. Biz Laurie Kalınlaştırma, kendi editoryal yardım için Christine Courteau Butler ve Christy Perry ve düzeni ve tüm şekil, tablo ve sanat mükemmel üretim için Christy Perry ederim.

1. Cerrahi Prosedürler ve TBI Akışkan Perküsyon <ol><li> Tüm hayvan deneyleri ilk Laboratuvar Hayvanlar (8th Edition, Ulusal Araştırma Konseyi) Bakım ve Kullanım Texas Medical Branch, Galveston, Teksas ve Sağlık Rehberi Ulusal Enstitüleri Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. </li><li> Sıçanlar (satıcı Charles Rivers, Portland elde yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçan, 400-500 gr, Maine) kafes başına iki ev ve bu sabit koşullar ile bir vivaryum yiyecek ve su ad libitum verilmiştir: ışık döngüsü (600 saat 1800 kullanmak için saat), sıcaklık 21 ° C (23 ° C) ve rutubet (% 40 ile% 50) bir hafta önce. </li><li> % 4, izofluran entübe ve mekanik havalandırın ratlarda uyuştur (Nemi Bilimsel; New England Medical Instruments, Medway, MA) oksijen izofluran 1.5-2.0% ratlarda: hava (70:30) ve sıvı-perküsyon parasagital hazırlamak yaralanma önce açıklandığı gibi. 8, 10 </li><li> Deneysel tasarım bağlı yaralanma sonrası uygun zamanda noktada sıçan Kurban. Çabuk, beyinleri kaldırmak kuru buz üzerinde hemen dondurmak ve mağaza -80 50 ml&#39;lik bir tüp içinde ° C veya dondurulmuş kesit için OCT gömmek için hemen devam. </li></ol> 2. Kesit ve Rat Beyin Boyanması <ol><li> Sabit bir sıcaklıkta muhafaza edilmesi durumunda derhal kullanılmaz Beyin dokusu bir ay kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. -80 Donmuş Brain ardından ° ardından kesit için -20 ° C ile çözülmüş C, ve yeniden donmuş ikinci çözdürme sonrası kalite RNA verim yok. Beyin, OCT çözülmüş ve kesitli monte edildikten sonra, slaytlar 24 saat içinde boyandı ve boyanma bir saat için 30 dakika içinde LCM için kullanılmalıdır. Bu kaliteli RNA sağlayacaktır. LCM takiben, LCM kapaklar yakalanan hücrelere kadar bir hafta için -80 ° C&#39;de lizis tamponu saklanabilir, ancak RNA yüksek kaliteyi sağlamak için zamanında izole edilmelidir. &lt;/ Li&gt; <li> Önce beyin kesit için, RNaz-Zap kriyostat silin ve ETOH (her beyin arasındaki tek bıçak yerine) ile fırçaları temizleyin. </li><li> -80 ° C dondurucu dan 50 ml tüp içinde beyin Al, -22 ° C ila yaklaşık olarak 10 dakika için tüp içinde çözülme bir sıcaklıkta kriyostat içine yerleştirin. Gazlı bez üzerine sahneye tüp ve yer kadar ventral tarafında beyin çıkarın. </li><li> Bir jilet kullanarak, optik kiazma de serebellum ve ön kısmı sadece rostral beyin arka kısmını kaldırmak için beyin dilim. Ekim montaj orta (Tissue Tek) ile bir cryomold doldurun ve ön tarafı ile kalıp içine beyin aşağı yerleştirin. O (yaklaşık 10 dk) beyaza dönene kadar beyin dokusu montaj ortamında dondurmak için izin verin. </li><li> OCT ile beyin üzerine numune disk (Tissue Tek) dondurun. Kalıptan beyin çıkarın. Numune kafa içine beyin takın ve vidaları sıkın. </li><li> Bir tek kullanımlık eklemeble, düşük profilli bıçak tutucu içine bıçak (Fisher Scientific) ve kolu aşağı sıkın. </li><li> OCT dış katmanı kaldırmak için 20 mikron de beyin dilimleme başlayın. Hipokampal bölgede ulaşıldığında, 10 mikron kadranını ayarlayın. Doku bölümünde (Fisher Scientific) üzerine bir cam slayt veya artı-cam slayt koyarak koronal seri bölümleri toplayın. Kesit tamamlanana kadar Slaytlar bir RNaz ücretsiz boyama rafa -20 ° C&#39;de muhafaza edilmiştir. </li><li> Doku kesitlerinde işlenir cam tüm RNaz kaldırmak için, tüm boyama kapları silin ve ELIMINase (Fisher Scientific) ile silindir mezun ve Milli Q su ile durulayın. RNaz içermeyen su ile tüm çözümleri hazırlayın ve cresyl menekşe (Sigma-Aldrich) ve Flor-Jade (Histo-kimya) kullanmadan önce filtre 0.2 mikron ile leke filtre. </li><li> 30 sn için RT beyin kesitleri çözülme ve% 75 ETOH (1 dak) sabitleyin. </li><li> Fiksasyon sonra tek yaralanan nöronların LCM için RNaz içermeyen su (1 dak) slaytlar durulama, 1% cresyl menekşe (15-20 sn) ile counterstain, RNaz içermeyen su (2 × 30 sn) durulama, Flor-Jade (4 dk) ile leke, RNaz içermeyen su (3 × 1 dk) durulayın RNase içermeyen su (30 sn),% 100 EtOH (30 sn) ve ksilen (2 x 3 dk) elde edilen% 95 EtOH ile kurutmak. </li><li> Fiksasyon sonrası nöron bozkırlarında LCM için RNaz içermeyen su (1 dak) slaytlar durulama,% 1 cresyl menekşe (1 dk) ile leke, (3 × 1 dk) RNaz içermeyen su ile durulayın,% 95 ile kurutmak EtOH (2 x 30 sn),% 100 EtOH (2 x 30 sn) ve ksilen (2 x 3 dk). </li><li> Hava LCM öncesinde 15 dakika bir davlumbaz tüm bölümleri kurutun. Onlar odadan odaya transfer gerekiyorsa Slaytlar, Dessicant ile kaplı bir slayt kutusunda, yukarı bölümünde iki saklanabilir. Bölümleri kuru sonra LCM hemen gerçekleştirilir Ancak, iyi sonuçlar elde edilir. LCM 30 dakika ile 1 saat ile sınırlı olmalıdır. Bir sonraki bölümde, biz ea olan hücrelerin sürekli bozkırlarında, yakalamak için nasıl ilk tarifsiest bu tekniği öğrenen kişiler için usta. Sonra tam tek nöronların yakalamak için nasıl açıklar. Bizim prosedürü, biz dejenere nöronların Floro-Jade-bir işaretleyici için onların yakınlığı tarafından ölüyor nöronların tanımlamak. Fluoro-Jade-negatif hücreleri nöronların hayatta kalan ettiği kabul edilmektedir. </li></ol> 3. Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon (LCM) Hipokampal nöronların zenginleştirilmiş popülasyonları bozkırlarında LCM <ol><li> LCM kızılötesi bir lazer diod (Life Technologies) ile bir PixCell mikroskop IIe kullanılarak gerçekleştirilir. </li><li> Dikey konuma merkezine joystick&#39;e ayarlayın. Döndür ve pozisyona 4X objektif kilitleyin. </li><li> Mikroskop aşama merkezinde bir slayt yerleştirin ve hipokampus bölgesinde görünümde kadar elle ayarlamak. Odak haline görüntüyü getirmek için kaba ve hassas fokus ayar kullanın. </li><li> Kumanda üzerindeki vakum düğmesine basarak vakum mandreni etkinleştirin. Pl içine 10X objektif döndürün ve kilitleyinace. Kaba ve ince ayarlar ile tekrar odaklanın. </li><li> CapSure kaset modülü ve pozisyon yük hattı pozisyonunda bir kap içine CapSure Makro LCM kapaklar (Life Technologies) yerleştirin. Kapağı etrafında Cap Yerleştirme kolu ve pozisyon döndürün. Kaset modülü CapSure kapağını kaldırmak için Cap Yerleştirme kolunu kaldırın. </li><li> Slayt üzerinde Cap Yerleştirme kolu döndürün ve slayt üzerindeki kolu aşağı düşürmek, bu slayt üzerine kapağı yerleştirecektir. Ince odak ayarlayın ve hücre kapağı üzerindeki siyah daire içinde olup olmadığını kontrol etmek için kumanda kolunu hareket ettirin. Tüm hücre yakalar bu siyah daire içinde olmalıdır. </li><li> Lazer parametreleri ayarlayın. İlk olarak, denetleyici üzerindeki lazer etkinleştirmek düğmesine basın. Lazer hedef nokta bilgisayar monitörü üzerinde görüş alanında pembe bir nokta olarak görünür olacaktır. </li><li> 75 mW, 1.0-2.0 msn için optimal hücre yakalama için gerektiği gibi - lazer odaklanmak ve 65 gücünü ve süresini ayarlamak için küçük lazer nokta boyutu (7.5 mikron) ayarlayın. </li><li> Te içinLazer st almak için hiçbir hücre olduğu yerde bir alana lazer nokta hareket etmek için joystick&#39;i kullanın. Başparmak anahtarı kullanarak lazer ateşleyin. Görünür bir karanlık halka lazer kovuldu açık alanı çevreleyen görmek için uzağa erimiş polimer nokta lazer nokta hareket ve kontrol etmek için joystick&#39;i kullanın. </li><li> Hücreleri yakalamak için yakalama hücrelerin alana lazer nokta hareket etmek için joystick&#39;i kullanın. Başparmak anahtarı kullanarak lazer ateşleyin. Hücrelerin geniş bir alana yakalamak için lazer ateşleme sırasında kumanda kolu hareket ettirin. Lazer çalıştığı zaman, hedef hücrelerin yüzeyine kapak üzerinde termoplastik polimer filmi erir. Böylece polimer gelecek moleküler uygulamalar için örnek bütünlüğünü sağlamak RNA, DNA ya da protein değiştiren değil, lazer radyasyonu absorbe eder. </li><li> Ilgi tüm hücreleri pişirme sonrası, Cap Yerleştirme kolunu kaldırın. Yakalanan hücreler doku bölümünden ayırmak ve CapSure kap uyacaktır. Kalan doku ve eksik hücrelerin vis olacakgörüş alanında yuvarlak cephelere. Kapak üzerinde hücreleri de sürgünün boş bir kısım üzerinde kapak yerleştirerek görülebilir. </li><li> Cap Yerleştirme kolunu kaldırın ve Cap İstasyonu Unload döndürün. Istasyonu kapağını indirin ve önceki konumuna geri Cap Yerleştirme kolunu döndürün. </li><li> Platformu boyunca ve kabını CapSure ekleme aracını kaydırın. Platformdan alet kaldırın. Kapağı takılı kalır. Hafifçe istenmeyen doku uzak temizlemek için CapSure temiz ped kap dokunun. </li><li> RNAqueous Mikro-İzolasyon kiti elde edilen lizis tamponu 100 ul ile dolu bir 0.5 ml RNase içermeyen tüp içine kapak yerleştirin. Hücreler lyse 30 sn için hemen girdap kap. 42&#39;de örnekleri inkübe -80 ° de 30 dakika ve dondurularak ° C&#39;de RNA izolasyonu kadar. </li></ol> Hipokampusta tek FJ + nöronların LCM <ol start="15"><li> Tek hücre yakalamak için, CapSure kaset modülü ve positi içine CapSure HS LCM kapaklar yükleyebilirsinizyük hattı konumunda kapağı. Cap Yerleştirme kolu çevirin ve kapağı etrafında konumlandırın. Kaset modülü CapSure kapağını kaldırmak için Cap Yerleştirme kolunu kaldırın. </li><li> Lazer odak ve tek hücrelerin optimum hücre yakalama için 0,45-0,50 msn için 65 -75 mW lazer gücü ve süresini ayarlamak için küçük lazer nokta boyutu (7.5 mikron) ayarlayın. </li><li> Slayt üzerinde Cap Yerleştirme kolu döndürün ve slayt doğru kolu aşağı indirin. Bu slayt üzerine kapak yerleştirir. Capsure HS kap yüzeyi LCM sırasında örnek bir yükseklikte duruyor. </li><li> Tek FJ + hücreleri üzerinde lazer hareket etmek için joystick&#39;i kullanın. Çekilen tüm hücreler kapağı üzerindeki küçük siyah bir halka içinde olmalıdır. Başparmak anahtarı kullanarak lazer ateşleyin. </li><li> Siyah bir daire alanı içindeki tüm hücreler lazer ile ateş edildiğinde, Cap Yerleştirme kolunu kaldırın. Yakalanan hücreler doku bölümünden ayırmak ve CapSure HS kap uyacaktır. </li><li> Micros başka bir slayt yerleştirinevre baş ve HS kap dolana kadar FJ + hücreleri toplamak. Lizis tamponu 40-50 ul ile dolu bir 0.5 ml RNase içermeyen tüp içine kapak yerleştirin. Hücreler lyse 30 sn için hemen girdap kap. 42&#39;de örnekleri inkübe -80 ° de 30 dakika ve dondurularak ° C&#39;de RNA izolasyonu kadar. </li></ol> 4. LCM Örnekleri kaynaktan Toplam RNA İzolasyonu (Bu bölüm sadece video sunumu olarak tarif edilecektir) <ol><li> Hücrelerinden toplam RNA, imalatçının protokolü takip RNAqueous-Micro Kit (Ambion) kullanılarak izole edilir. Tüm reaktifler ve yıkama çözümleri bu kitinde. Filtre lizis çözüm tampon 30 ul ekleyerek Pre-ıslak mikro filtre kartuşu tertibatını. 5 dakika sonra, 10,000 x g hızında 30 saniye için filtre santrifüjlenir. </li><li> Örnek lizat için LCM katkı 3 ul ekleyin, pipet karıştırın ve santrifüj. </li><li> Örnek lizat 100% ETOH (1/2 hacim) 52 ul ekleyin; pipet karıştırın ve filtreye lizat aktarmak içinsütun. </li><li> Sütun RNA bağlamak için 1 dakika için 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin filtre kolon. Bir örnek için birden kapaklar varsa, ayrı ayrı aynı sütun aracılığıyla her lizat dönerler. </li><li> RNAqueous Micro kiti açıklandığı gibi RNA izolasyon prosedürü tamamlayın. </li><li> DNaz tedavi ve gibi kit açıklandığı LCM RNA örneklerinin DNaz inaktivasyonu gerçekleştirin, -80 bir RNaz ücretsiz tüp ve mağaza ° C&#39;ye RNA transferi </li></ol> 5. RNA niceliksel ve Mansap Uygulamaları RNA kalitesi ve miktarının değerlendirilmesi bir Agilent Bioanalyzer üreticinin protokolü takip Pico Takımı (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) reaktifleri kullanılarak yapılır. <ol><li> Toplam RNA bir Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) analiz edilir. Yazılım, her bir numune arasında değişen f, bir RNA bütünlüğü sayısı (RIN) atayarak konsantrasyon ve RNA numunesinin bütünlüğü değerlendirirrom 1 ile 10. 1-5 bozulmuş RNA gösterir ve 7-10 kaliteli RNA gösterir. </li><li> SYBR-yeşil kimya kullanarak bireysel Taqman deneyleri veya RT2 profiler dizileri; Sigara bozulmuş bozulmadan RNA Real-Time PCR için kullanılacaktır. RNA mRNA mikroarray ve microRNA mikroarray için de kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medial+temporal+lobe.">The medial temporal lobe.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).</li><li>Bast, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+integrative+perspective+on+hippocampal+function:+from+the+rapid+encoding+of+experience+to+adaptive+behavior.">Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior.</a> Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).</li><li>Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+networks+to+brain+networks.">From gene networks to brain networks.</a> Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).</li><li>Schouten, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+in+traumatic+brain+injury:+a+complex+struggle+against+the+biology+of+nature.">Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature.</a> Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).</li><li>Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+a+novel+fluorochrome+for+the+sensitive+and+reliable+histochemical+localization+of+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration.</a> Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).</li><li>Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade+and+silver+methods:+application+to+the+neuropathology+of+scrapie,+a+transmissible+spongiform+encephalopathy.">Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain:+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression.">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).</li><li>Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Fluid+Percussion:+Model+of+Traumatic+Brain+Injury+in+Mice.">Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice.</a> J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+long-term+gene+expression+in+neurons+of+the+hippocampal+subfields+following+traumatic+brain+injury+in+rats.">Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats.</a> Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).</li><li>Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+age-specific+responses+to+traumatic+brain+injury+in+mice.">Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice.</a> Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).</li><li>Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+hypotension+suppress+neuroprotective+gene+expression+in+injured+hippocampal+neurons.">Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons.</a> Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).</li><li>Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stochastic+gene+expression+on+the+cell+survival+rheostat+after+traumatic+brain+injury.">Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury.</a> PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).</li><li>Elstner, M., Morris, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson's+disease+and+aging+links+transcriptional+dysregulation+of+energy+metabolism+to+cell+death.">Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).</li><li>Chen, H., Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Profiling+of+Nucleus+Accumbens+Neurons+Projecting+to+Ventral+Pallidum+Using+both+Microarray+and+Transcriptome+Sequencing.">Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing.</a> Front. Neurosci. 5, 98 (2011).</li><li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons,+numbers+and+the+hippocampal+network.">Neurons, numbers and the hippocampal network.</a> Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).</li><li>Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+long-term+treatment+with+L-deprenyl+on+the+age-dependent+microanatomical+changes+in+the+rat+hippocampus.">Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus.</a> Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).</li><li>Schmued, L. C., Hopkins, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+novel+fluorochromes+for+detecting+toxicant-induced+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration.</a> Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).</li><li>Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+use+of+laser+capture+microdissection+to+selectively+obtain+distinct+populations+of+cells+for+proteomic+analysis--+preliminary+findings.">The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings.</a> Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).</li><li>Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunostained+frozen+sections+for+mRNA+analysis.">Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis.</a> Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Bu LCM tekniği TBI moleküler mekanizmalarının anlaşılmasında önemli ilerlemeler yapmak için bize sağlamıştır. 8,10,11,12,13 Biz sıçan hipokampus farklı alt bölgeler gen ekspresyon profilleri var olduğunu göstermek için bu tekniği kullanan ilk araştırmacılar olduğunu yaralanma onların seçici açığı ile ilişkilidir. Çalışmalarımız biz 10 gibi az sayıda lazer yakalanan hücreleri, qPCR göre, gen ekspresyonu ölçmek ve biz 600 yakalanan hücreleri gibi birkaç itibaren genom mikroarray analizi gerçekleştirmek verebilecek olabileceğini gösterdi. LCM çeşitli nörolojik ve nöropsikiyatrik hastalıklardaki rolü olduğu bilinen diğer beyin bölgelerinin benzer çalışmalarda değerli bir araç olacaktır. Örneğin, LCM kullanıldığı çalışmalarda ler karışmış ödül devrelerini katılır akumbens genom-geniş profilleme çalışmaları, substantia nigra, 14 dopamin nöronlar Parkinson hastalığının patogenezinde içine ışık tutacak ve yardım etmişubstance kötüye kullanım bozuklukları. 15. Nöronal heterojenite genom düzeyinde 16 yansiyan ve klinik çalışmalarda TBI için deneysel tedavilerin başarı eksikliğinin katkıda bulunabilir. Böylece, amacımız TBH sonrası nöronal sağkalımı etkileyen kritik unsurları araştırmak için bu tekniği kullanmaktır. Ölüyor ve bitişik TBH sonrası hipokampal nöronların hayatta Bizim son genom profilleme çalışmada hücre ölümüne genler hücre canlılığı ekspresyon düzeylerinin oranı yansıtmaktadır hücresel reosta TBH sonrası hücre kaderinin düzenler önerdi. Bu devam eden çalışmalar olumlu hücre sağkalım reosta etkileyebilir farmakoterapötik stratejilerinin tasarım ve gelişimine katkı sağlayacak. Ayrıca, şu anda TBH sonrası hipokampal nöronlarda potansiyel terapötik ilaç tedavilerinin etkilerini izlemek ve izlemek için LCM kullanın. Böylece, çalışmalar verilen dikkatli RNaz ücretsiz taşıma teknikleri ve bazı göstermekmevcut protokollerde değişiklik, bu doğru kantitatif gen ifadesi için analiz LCM yüksek kaliteli RNA örnekleri elde etmek mümkün olur. Bununla birlikte LCM teknikleri ile ilgili bir kaç zorluk vardır. Örneğin, herhangi bir mikroglia kontaminasyon olmaksızın sadece sinir hücreleri toplamak neredeyse imkansız olabilir. Hipokampus piramidal hücre tabakası yılında, hücrelerin% 95 glial ve diğer hücre tiplerinin küçük bir yüzdesi bırakarak, piramidal hücreler ve% 10 internöron olmak için bu nüfusun% 90 ile nöronlar. 8,17 olduğu tahmin edilmiştir Çalışmamızda 18 biz Fluoro yeşim özellikle beyin dokusunda yalnızca yaralandı nöronlar etiketler floresan boya kullanın. GFAP için bir belirteç olduğunu farklı bir leke mikroglia leke için gerekli olacaktır. Yalnızca Fluoro yeşim lekeli tek nöron gövdeleri Toplama 19 nöronların daha homojen bir nüfusa sağlar. Sorun giderme gerektirebilir Başka bir yaygın sorun bir daire hiçbir olmasıdırlazer ateşlendiğinde t tanımlanır. Bu durum ortaya çıkarsa, bu lazer ayarlarını kontrol edin ve gerekirse güç ve süresini ayarlamak için gereklidir. Ayrıca kapak dokusu düz yerleştirilir ve kol düzgün oturduğundan emin olmak için önemlidir. LCM teknik el kitabına atıfta bulunarak veya teknik desteği aramadan bazen gerekli olacaktır. LCM ve RNA izolasyonu sonra, RNA kalitesi her zaman önce herhangi bir gen ekspresyon analizi için bir Bioanalyzer ile değerlendirilmelidir. Lazer kesim (Life Technologies, Leica Microsystems) ve (Zeiss) araçların catapulting lazer dahil olmak üzere şu anda piyasada lazer yakalama araçları çeşitli türleri vardır. Bizim LCM sistemi hücrelerinin az sayıda yakalamak için iyi çalışır. Diğer yüksek verimlilik ve daha fazla otomasyon sistemleri genomik ve özellikle proteomik analizi için hücrelerin büyük sayılar elde etmek için daha uygun olabilir. Nitekim, bu otomatik sistemler kullanılarak LCM pr analizi için büyük bir potansiyele sahiptespit hücrelerin veya hücre popülasyonlarında zenginleştirilmiş otein ifadesi. 20. Ayrıca, LCM bize, en heterojen dokularda karmaşıklık bağımsız olarak tanımlanmış hücre tiplerinde in gen ekspresyonunu araştırmak için izin immunolabeled hücreleri, 21, gen ekspresyonunu analiz kolaylaştırabilir. Böylece, LCM hücrelerin tek veya zenginleştirilmiş popülasyonlarının üstün moleküler çalışmalar için mükemmel bir araçtır.

Heterojen dokuların gen ekspresyonu analiz her zaman sorunlu olmuştur;. Bu yaklaşık 5.000 farklı hücre tipleri vardır memeli beyninde, özellikle doğrudur önce lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) tekniği, TBI etkileri genomik çalışmaların gelişmesine 4 in vivo olarak farklı nöronal hücre tipleri, aynı zamanda glial ve immünomodülatör hücreleri destekleyen sadece oluşan beyin hücrelerinin karışık bir nüfus gen ekspresyon analizi, esas alınmıştır. Sonuçlanan karmaşık gen ekspresyon profilleri, bu heterojen dokularından elde edilen ve yaralanma indüklenen hücresel sinyalleri, genellikle çelişkili desen TBI. 5 pre-klinik çalışmalarda etkili kanıtlanmış terapötik stratejilerin insan klinik çalışmalarda başarısızlık için bir açıklama olabilir Sıçan kalça nöronların savunmasız nüfusları yaralanma indüklenen gen ifadesinin net bir anlayış elde etmek içinpocampus, biz ilk Emmert-Buck ve ark LCM tekniği. 3 Daha sonra, biz de kantitatif gerçek zamanlı PCR ve mikroarray analizi kullanılarak nöronlar ve mRNA profilleme için tek nöronların zenginleştirilmiş popülasyonlarının etkin yakalamak için bu mikrodiseksiyon tekniği modifiye ve optimize kabul . Genomik analiz için beyin dokusu frozenda mRNA bütünlüğünü korumak için, sabitleme, boyama ve donmuş sıçan beyin kesitleri nöronları hızlı yakalanması için mevcut protokoller güncellenmiştir. Tanımlama ve yaralı ve ölen hipokampal nöronların izolasyonu için, biz de LCM için Flor-Jade boyama tekniği optimize. Flor-Jade apoptotik ve nekrotik hücre ölümü arasında ayırım yapmaz. Böylece, dejenere olan nöronların bu tür tüm leke. 6,7 ile tespit edilebilir Burada, tek ölen veya hayatta kalan nöronların havuzların yanı sıra zenginleştirilmiş populati bozkırlarında elde etmek için laboratuarda kullanılan protokol açıklarfarklı nöronal hücre tipleri (TBI sonrası gen ekspresyon analizi için yani CA1-CA3 nöronlar) arasında ons. Laboratuarda yapılan sıvı perküsyon beyin yaralanması için prosedür Shimamura ve ark. 8&#39;de ayrıntılı olarak tarif edilen ve Alder ve arkadaşları tarafından yayımlanan Jüpiter fareler için lateral sıvı-perküsyon hasar protokol ile çok benzer. 9 LCM teknik sahip olduğu DNA bütünlüğü üzerinde çok az veya hiç etkisi olduğu gösterilmiştir, RNA ve dokularda protein, tanımlanmış olan bu hücre tiplerinin moleküler ve protein analizi için mükemmel bir araçtır.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PixCell IIe Laser Capture Microscope</td>
 <td>Life Technologies (Arcturus)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAqueous Micro- Kit</td>
 <td>Life Technologies (Ambion)</td>
 <td>AM1931 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capsure LCM caps</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>LCM0211/LCM0214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoro-Jade</td>
 <td>Histo-chem Inc.</td>
 <td>#1FJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cresyl Violet Acetate</td>
 <td>Sigma-aldrich</td>
 <td>C5042-10G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene (Histological grade)</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>X3P-1GAL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
 <td>UTMB pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase free barrier pipette tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)</a> 
 <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection The PALM family </a> 
 <a href="http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica DM6000 B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury

TBH sonrası uzun süreli zihinsel özürlü öğrenme, bellek ve yürütücü işlev için kritik olan medial temporal lobda hipokampus-bir bölgede yaralanma indüklenen nörodejenerasyon ile ilişkilidir. 1,2 Bu nedenle çalışmalarımızı spesifik nöronal gen ekspresyon analizi odaklanmak hipokampus farklı alt bölgelerinde nüfus. Emmert-Buck tarafından 1996 yılında gerçekleştirilen lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) tekniği, et al., 3 tek hücrelerde gen ekspresyonunu analiz açısından önemli gelişmeler için izin verilen ve zenginleştirilmiş olan bu tür içeren bir memeli beyin gibi heterojen bir doku hücre popülasyonları fonksiyonel hücre tipleri binlerce. 4. Biz LCM ve TBH patogenezinde altında yatan moleküler mekanizmalarının araştırılması travmatik beyin hasarı iyi kurulmuş bir sıçan modeli (TBI) kullanın. Sıvı-perküsyon TBI&#39;dan sonra, beyin, hemen kuru buz üstünde dondurulmuş, önceden belirlenmiş bir zaman travma sonrası da kaldırılırve kriyostat kesit için hazırlanmıştır. Sıçan beyinlerinde hemen OCT ve kesitli gömülü veya -80 birkaç ay saklanabilir ° C Lazer yakalama mikrodiseksiyon için kesit önce. Ayrıca, sirkadiyen ritimleri TBI etkilerini incelemek için LCM kullanın. Bunun için, biz memeli beynin ana saat içeren suprakiazmatik nukleus nöronları yakalamak. Burada, gerçek zamanlı PCR ve / tek tespit nöronlar (yaralı ve yozlaşan, Flor-Jade pozitif veya yaralanmamış, Flor-Jade-negatif) ve sonraki gen ekspresyon analizi için hipokampal nöronlar zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek LCM kullanımını göstermek veya tüm-genom mikroarrayler. Bu LCM-etkin çalışmalar sıçan hipokampus anatomik farklı bölgelerin seçici açığı bu farklı bölgelerden LCM elde nöronların farklı toplumlardaki farklı gen ekspresyon profilleri yansıtılır olduğunu ortaya koymuştur. Bizim tek hücre çalışmaları, nereden sonuçlarıBiz, boyama ve bitişik hipokampal nöronların hayatta transkripsiyonel profillerinin karşılaştırılması TBH sonrası hücre ölümü ve hayatta kalma düzenleyen bir hücre sağkalım reosta varlığını düşündürmektedir.

Bizim ilk LCM çalışmada TBI. 8 Şekil 1A-1C onların açığını yansıtan gen ekspresyon profilleri var sıçan hipokampus bu işlevsel farklı alt bölgeler (CA1 ve CA3) göstermek için başardık (hipokampal piramidal nöronları lazer yakalama gösterir CA1- CA3) önce, ve LCM sonra dentat girus nöronlar ve SCN nöron. Piramidal, granül veya sırasıyla SCN nöron, Temiz yakalar, makro kapaklar üzerinde gösterilmiştir. Şekil 2A-2B göstermektedir Flor-Jade pozitif piramidal nöronlar, ölüyor ve LCM önce ve sonra, Flor-Jade negatif piramidal nöronların hayatta. Ölen veya nöronların hayatta kalma temiz yakalama LCM kapaklar üzerinde yakalanan hücreleri inceleyen tarafından gösterilir. LCM sonra, toplam RNA TaqMan veya SYBR yeşil kimyaları (Şekil 3A), küçük focu kullanılarak gen ekspresyonunun kantitatif gerçek-zamanlı PCR analizi de dahil olmak üzere klinik çalışmalar çeşitli bir dizi için de kullanılabilirSYBR yeşil sondalar (Şekil 3B) veya tüm genom mikroarray çalışmalar (Şekil 3C) ile PCR diziler sed. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Şekil 1. Sıçan beyninden tanımlanmış hücre popülasyonlarının bozkırlarında Lazer yakalama mikrodiseksiyon. Sıçan beyinlerinin Dondurulmuş 10 mikron koronal kesitler, etanol sabit bir Nissl leke (cresyl mor) ile boyandı ve LCM için hazırlanmıştır. Gösterilen sıçan hipokampus ve suprakiazmatik nükleus resimlerini hipokampal dentat girus sıçan hipokampus CA1-CA3 altalanları gelen LCM ve makro kapaklar üzerindeki görselleştirildiği olarak yakalanan hücreleri. A. piramidal nöronlar önce ve sonra. B. Granül hücrelerdir. C. ikili suprakiazmatik nukleus üçüncü karıncığın her iki tarafında yer alanve optik kiazma üstünde yer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Şekil 2. Sıçan hipokampus tek nöronların Lazer yakalama mikrodiseksiyon. Gösterildi CA3 nöronlarının öncesi ve LCM sonra A. Dejenere, Flor-Jade-pozitif (lekeli) hipokampal CA3 nöronlar ve B. Yaşayan, Flor-Jade-negatif (boyanmamış) vardır. Yakalanan hücreleri görüntülenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Şekil 3,. Toplam RNA gen ekspresyonu analizi lazer yakalanan nöronların izole. HSN&#39;de sirkadiyen saat gen ekspresyonu A. kantitatif gerçek zamanlı PCR veriler. Odaklanmış PCR dizileri kullanarak apoptoz ile ilişkili genlerin ekspresyonu gösteren hipokampal nöronlar ölüyor ve hayatta gen ifadesinin B. İlgi haritası . C. Agilent TBI veya TBI sham yaralanma alınan fareler, artı beyin hasarı (nöronal nitrik oksit tarafından uyarılan genlerin knockdown ifadesi için tasarlanmış bir rekombinant adeno-ilişkili siRNA virüs hipokampal CA1-CA3 nöronlarında gen ifadesinin bütün-genom mikroarray analizi sentaz ve glutatyon peroksidaz-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Biz kantitatif gerçek zamanlı PCR ve / veya tüm genom mikroarrayler kullanan sonraki gen ekspresyon analizi için yaralı sıçan beyinlerinin frozen adlı hipokampal nöronlar veya tek nöronların zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) nasıl kullanılacağı açıklanmıştır.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

laser-capture-microdissection-enriched-populations-neurons-or-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.1K Görüntüleme.  University of Texas Medical Branch. Biz kantitatif gerçek zamanlı PCR ve / veya tüm genom mikroarrayler kullanan sonraki gen ekspresyon analizi için yaralı sıçan beyinlerinin frozen adlı hipokampal nöronlar veya tek nöronların zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) nasıl kullanılacağı açıklanmıştır.

Video: Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Nörobilim

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Ön Talamusun Çekirdek Derin Beyin Stimülasyon sonra Sıçan Hippocampus Gen İfade Değişim Analizi

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.