PLD, Protein Mühendisliğinde Kanada Araştırma Başkanı'na sahiptir. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden PLD'ye verilen bir hibe ile finanse edildi. Bu çalışma ayrıca Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS) (No. 23310171) ve Japonya Biyo-odaklı Teknoloji Araştırma İlerleme Kurumu'ndan (BRAIN) bilimsel araştırmalar için bir Grant-in-Aid tarafından desteklendi. Dr. Chris Marshall ve Mike Kuiper'e FIPA'ya yol açan öncü çalışmalar için minnettarız. Ayrıca, bu çalışmaların bazıları için olanak sağladığı için Dr. Sakae Tsuda'ya ve floresan ışık ekscitasyon ve emisyon filtrelerini kurduğu için Dr. Laurie Graham'a minnettarız.

1. Büyüyen Tek Buz Kristalleri
<ol><li>Etilen glikol soğutma banyosuna uyan ve üzerinde yüzebilen temiz bir metal tava (15 cm çapında, 4,5 cm yüksekliğinde) alın.</li>
	<li>Bir borudan kesitler keserek polivinil klorür (PVC) silindirik kalıplar (4,5 cm çapında, 3-4 cm yüksekliğinde, 4 mm kalınlığında) hazırlayın.<ol>
<li>Bir tarafta (1 mm genişliğinde, 2 mm yüksekliğinde) bir çentik kesin (Şekil 1A).</li>
		<li>Tavaya rahatça sığabilecek kadar kalıp hazırlayın (Şekil 1B). Not: Bir çalışma polivinil alkolün (PVA) buz çekirdeğini etkileyebileceğini göstermiştir22. Ancak açık kalıp PVC sistemimizde atipik buz oluşumu sorunları ile karşılaşmadık.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çentik kesilmiş yüzey olan her kalıbın alt yüzey halkasına hafif bir vakum gresi filmi uygulayın. Bu yağlanmış, çentikli yüzeyi, çentikler tavanın merkezinden uzağa yönlendirilmiş metal bir tavaya kapatın. Çentikleri gresle doldurmamaya veya engellememeye dikkat edin.</li>
	<li>Tava ortasına, ancak kalıpların dışına 0,22 μm filtrelenmiş ve gazsız/deiyonize su ekleyin ve suyun çentiklerden kalıplara yavaşça girmesini sağlar. Herhangi bir kabarcık tanıtmamaya dikkat edin. Su tabakası yaklaşık 5 mm derinliğinde olmalıdır.</li>
	<li>Tavayı -0,5 °C'ye kadar soğutulmuş sıcaklık kontrollü etilen glikol banyosuna yerleştirin. Tava mükemmel seviyede olmalı. Gerekirse tava kenarlarına balast ağırlıkları ekleyin.</li>
	<li>Tava ve su -0,5 °C'ye ulaştıktan sonra, tava ortasına kalıpların dışına küçük bir buz parçası ekleyin.<ol>
<li>Bu, tava boyunca ve kalıplara aşırı solumuş suda buz büyümesini çekirdekleyecektir. Her kalıbın altındaki küçük çentik, sadece bir buz kristalinin yayılmasına izin verir ve bu da her kalıpta tek bir buz kristali ile sonuçlanır.</li>
		<li>Bir buz tabakası oluşturmak için bir gecede kuluçkaya yaslanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sonraki üç gün boyunca her kalıba günde bir kez 13 ml 4 °C gazsız/deiyonize su ekleyin ve etilen glikol banyosunun sıcaklığını ilk gün -0,8 °C'ye, ikinci günde -1,1 °C'ye ve üçüncü günde -1,5 °C'ye düşürün.<ol>
<li>Gece boyunca bu sıcaklıklarda kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>Dördüncü güne kadar, kalıplar tamamen buzla doldurulmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalıpları tavadan çekin, buz kristallerini kalıplardan dışarı itin ve tartım teknesi gibi temiz bir yüzeyde, elleçlemeden önce yaklaşık 1 saat boyunca -20 ° C dondurucuda saklayın.</li>
	<li>Birçok küçük tek buz kristali hazırlamak yerine, knight23tarafından açıklandığı gibi sabit bir sıcaklık inkübatöründe hacim olarak birkaç litrelik büyük bir tek buz kristali hazırlanabilir. Büyük buz kristali -15 ila -20 ° C dondurucuda tutulursa bir yıl veya daha fazla saklanabilir. Tek kristalin kısımları gerektiğinde bir testere ile buz bloğundan kesilebilir.</li>
</ol>2. Buz Kristalinin Tekilliğinin ve Yönünün Belirlenmesi
<ol><li>Kalıptan atılan buzun, iki çapraz polaroid arasında bir dondurucu odasında gözlemleyerek tek bir kristal olup olmadığını belirleyin (Şekil 1D).<ol>
<li>Buz kristali tek ise, çatlak veya süreksizlik görülmemeli ve ışık yönü buz kristali içinde değişmemelidir. Not: Dondurucu oda yoksa, bunun yerine soğuk bir oda gerekli tüm adımlarda kullanılabilir, hızlı çalışmak ve buzları idareli bir şekilde işlemek için dikkatli olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Buz birefringence nedeniyle, kişi aynı anda cekseninin yönünü belirleyebilir. Yönlendirmeyi belirlemek için aşağıdaki bilgileri kullanın:<ol>
<li>Cekseni olay ışığına tam olarak paralel olduğunda, teoride, çapraz polaroidlerden hiçbir ışık geçmeyecek. Olay ışığı ceksenine paralel olarak hafifçe başlıklandırılırsa, çapraz polaroidler arasında döndürüldüğünde kristalden tek tip çok renkli bir ışık spektrumu iletilir. Bu düzgün geçirgenlik, cekseni24boyunca buz Ih'nin optik hareketsizliğinden kaynaklanır. Buz kristalinin bazal düzlemi ceksenine göre normaldir.</li>
		<li>Cekseni olay ışığına paralel olarak daha uzak olduğunda ve buz kristali çapraz polaroidler arasında döndürüldüğünde, iletilen ışık kristalin her 90° dönüşüyle% 0-100 geçirgenlik arasında değişir.</li>
		<li>En yaygın olarak, cekseni silindirik buz kristalinin dairesel düzlemine normal olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Buzkristalini alüminyum folyoya sıkıca sararak, bazal düzlemdeki buza bir iğne ile küçük bir delik açarak (ceksenine normal) ve 20 dakika boyunca vakumun altına yerleştirerek yapılan25 numaralı buz çukurluğu ile a -baltaların yönünü belirleyin.<ol>
<li>Bu tedavi, a -eksenlerin altı taraflı yıldızın köşelerinden geçtiği bazal düzlemde altıgen simetri ile birkazık üretecektir (Şekil 2A).</li>
		<li>İstenirse, buz kristali sırasıyla soğuk parmağa dik birincil veya ikincil prizma düzlemi ile monte etmek için altıgen bir tarafa paralel veya dik bir testere ile kesilebilir (Şekil 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Floresan Etiketli Antifriz Proteinlerinin Tek Bir Buz Kristaline Adsorpsiyonu
<ol><li>Önce kristalin tepesine bir boşluk sıkarak soğuk parmağa (Şekil 1C) tek bir buz kristali monte edin. Bunu yapmak için, buzun biraz farklı çapta iki alüminyum çubukla eritmesini değiştirin, ancak soğuk parmağın çapına benzer, soğuk parmağın sığabileceği boşluğu oluşturmak için.</li>
	<li>Soğuk parmağı -0,5 °C'ye soğutun, buz boşluğuna yerleştirin ve buz kristalini metale donana kadar yerinde tutun (Şekil 2B). Kristali parmağa bağlarken hava kabarcıklarından kaçının, çünkü parmaktan çubuğa etkili ısı transferini engeller.</li>
	<li>Buz kristalinin çapının yaklaşık iki katı olan yarım küre bir kabı filtrelenmiş deiyonize su veya tamponla doldurun, yaklaşık 4 °C'ye soğutun. Soğuk parmakla bağlanmış buz kristalini bardağa batırın ve fazla suyu veya tamponu, buz kristalinin üst kısmının sıvı tabaka ile yaklaşık olarak düz olması ve buzun fincan duvarlarına dokunmaması için çıkarın.<ol>
<li>Kabı yalıtımla örtün ve sıcaklığı -5 °C'ye düşürin.</li>
		<li>Buz kristalinin bir yarımküreye oluşması için yaklaşık 1 saat bekleyin ve durumunu yaklaşık her 20 dakikada bir kontrol edin (Şekil 2C).</li>
		<li>Buz, buz kristalini eriterek ve büyüterek yarım küre kabının şeklini alacaktır, ancak fincan duvarlarına dokunmak asla aşırı büyümemelidir. Duvar ve yarımküre arasında en az 1 cm boşluk olmalı ve soğuk parmak buzdan çıkıntı yapmamalı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kabı buz kristalinden çıkarın ve floresan protein çözeltisini 25-30 ml'lik son hacme ve istenen analiz konsantrasyonuna ekleyin, fincandaki toplam sıvı hacmini değiştirmemeye dikkat edin. Tipik bir AFP konsantrasyonu 0.1 mg/ml'dir.<ol>
<li>Buz kristalini bardağa yeniden yerleştirin, böylece buz kristalinin üstü sıvı ile aynı seviyededir ve buz kristali fincan duvarlarına dokunmaz (Şekil 2D).</li>
		<li>Soğuk parmak sıcaklığını -8 °C'ye bırakın ve protein çözeltisinin 2-3 saat boyunca buz kristaline donmasını ve çözeltiyi sık sık karıştırmasını bırakın. Protein çözeltisinden oluşan buz, buz büyümesini durdurmadan önce en az 5 mm olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Buz kristalini soğuk parmağa bağlıyken bardaktan çıkarın. Soğutucuyu soğuk parmaktan 0 °C'nin hemen üzerine ısıtarak buzu ikincisinden ayırın ve buz kristali eriyene kadar bekleyin.</li>
	<li>Kristal düz tarafı, yeni oluşan buza dokunmamaya dikkat ederek tartım kabı gibi temiz bir yüzeye yerleştirin ve teslim etmeden önce en az 20 dakika boyunca -20 ° C'de saklayın.</li>
</ol>4. Antifriz proteinine bağlı Buz Düzlemlerinin Görselleştirilmesi
<ol><li>Floresan görselleştirme, karanlık bir dondurucuda veya soğuk bir odada, buz kristali düz tarafını, floresan etiketi ve kamera emisyon filtrelerini diğer spesifik olmayan ışıkları engellemek için heyecanlandırmak için dalga boyuna özgü uyarılma filtrelerine sahip lambaların altına yerleştirerek yapılır. Desene göre, AFP'lere bağlı buz düzlemleri tahmin edilebilir (Şekil 4).</li>
	<li>Dalga boyuna özgü ışıklar mevcut değilse, bunun yerine bir UV ışık kutusu kullanılabilir.</li>
	<li>Geleneksel buz etches, buz yarımküresinin en az 3 saat boyunca -20 °C'de yüce olmasına izin vererek de gerçekleştirilebilir, bundan sonra artık protein tozu buz yüzeyinde görülebilir hale gelebilir (Şekil 5).</li>
	<li>2.3. adım, tamamlanmış buz yarımkürenin a-eksenlerinin yönünü belirlemek için tekrarlanabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+peptides+and+glycopeptides+in+cold-water+fishes.">Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes.</a> Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).</li><li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochemistry+-+heat-stable+antifreeze+protein+from+grass.">Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).</li><li>Tomczak, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+stabilization+of+membranes+at+low+temperatures+by+an+antifreeze+protein.">A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein.</a> Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).</li><li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.">Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+clathrate+waters+bind+antifreeze+proteins+to+ice.">Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).</li><li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+a+bacterial+antifreeze+protein+as+an+adhesin+with+ice-binding+activity.">Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity.</a> Plos One. 7 (11), (2012).</li><li>Raymond, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal+ice-binding+proteins+change+the+structure+of+sea+ice.">Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).</li><li>Raymond, J. A., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li><li>Baardsnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ice-binding+face+for+type+i+antifreeze+protein.">New ice-binding face for type i antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).</li><li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein.">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li><li>Garnham, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+ice-binding+site+of+an+antifreeze+protein+revealed+by+mutagenesis+and+fluorescent+tagging.">Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging.</a> Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).</li><li>Nutt, D. R., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+the+hydration+layer+around+an+antifreeze+protein+revealed+by+atomistic+molecular+dynamics+simulations.">Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal-surface+planes.">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li><li>Antson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+mechanism+of+ice+binding+by+type+iii+antifreeze+proteins.">Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins.</a> J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).</li><li>Graether, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-helix+structure+and+ice-binding+properties+of+a+hyperactive+antifreeze+protein+from+an+insect.">Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect.</a> Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).</li><li>Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+spruce+budworm+antifreeze+protein+interacting+with+ice+crystals:+Basal+plane+affinity+confers+hyperactivity.">Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity.</a> Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).</li><li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site.">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).</li><li>Scotter, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basis+for+hyperactivity+of+antifreeze+proteins.">The basis for hyperactivity of antifreeze proteins.</a> Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).</li><li>Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+biomolecules+to+ice+and+their+effects+upon+ice+growth.+1.+Measuring+adsorption+orientations+and+initial+results.">Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results.</a> Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).</li><li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+insect+antifreeze+protein+and+its+implications+for+ice+binding.">Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding.</a> J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).</li><li>Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+naturally+inactive+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein+into+one+that+can+stop+the+growth+of+ice.">Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice.</a> FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).</li><li>Holt, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+antifreeze+proteins+and+poly(vinyl+alcohol)+on+the+nucleation+of+ice:+A+preliminary+study.">The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study.</a> Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).</li><li>Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+growing+large,+optically+''perfect''+ice+crystals.">A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals.</a> J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).</li><li>Hobbs, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ice physics. , 200-248 (1974).</li><li>Knight, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+crystallographic+etch+pits+on+ice,+and+its+application+to+the+study+of+hailstones.">Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones.</a> J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).</li><li>Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+antifreeze+polypeptide+and+its+mechanistic+implications.">Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications.</a> Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).</li><li>Sicheri, F., Yang, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+structure+and+mechanism+of+an+antifreeze+protein+from+winter+flounder.">Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder.</a> Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).</li><li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+glycopeptides+and+peptides+in+inhibition+of+crystallization+of+water+in+polar+fishes.">Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes.</a> Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).</li><li>Pertaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces.">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).</li><li>Kondo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+site+of+snow+mold+fungus+antifreeze+protein+deviates+from+structural+regularity+and+high+conservation.">Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).</li><li>Mok, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+superior+activity+of+the+large+isoform+of+snow+flea+antifreeze+protein.">Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein.</a> Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).</li><li>Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+active+qae+isoform+confers+thermal+hysteresis+activity+on+a+defective+sp+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein.">Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein.</a> FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).</li><li>Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+ice+growth+and+melting+modifications+by+antifreeze+proteins.">New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins.</a> J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dimeric+beta-helical+model+of+an+ice+nucleation+protein+with+bridged+active+sites.">Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites.</a> BMC Struct. Biol. 11, (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması bildirilmedi.

AFP'ye bağlı buz uçaklarının belirlenmesi için Charles Knight tarafından buz aşındırma yönteminin geliştirilmesi, AFP'ler tarafından buz bağlama mekanizması üzerinde büyük ölçüde ileri çalışmalar. AFP'lerin yapıları X-ışını kristalografisi26,27 ile çözülebilirken, AFP'nin bağlı olduğu buz üzerindeki tamamlayıcı yüzeyi çıkarmak için belirgin bir yöntem yoktu. Kış flounder tip I AFP başlangıçta karakterize edildiğinde, buz birincil prizma düzlemleri bağlamak i?...

Antifriz proteinlerinin (AFP) üretimi, buz yüklü ortamlarda yaşayan bazı organizmaların önemli bir hayatta kalma mekanizmasıdır. Yakın zamana kadar, AFP'lerin tek işlevinin dolaşımı engelleyecek, doku hasarına ve ozmotik strese neden olacak iç buz kristallerinin büyümesini önlemek veya yavaşlatmak olduğu düşünülüyordu. Balık gibi herhangi bir donma derecesini tolere edemeyen organizmalar, buz kristali büyümesini tamamen engellemek için AFP'leri ifade eder1. Çim gibi diğerleri, donmaya karşı dayanıklıdır ve dokularında büyük buz kristallerinin oluşumunu azaltan buz rekristalizasyonunu inhibe etmek için AFP'leri ifade eder2. Düşük sıcaklıktaki membranların stabilizasyonu, AFP'ler için önerilen başka bir işlevdir3. Son zamanlarda, bir Antarktika bakterisinin AFP'si için yeni bir rol önerildi, Marinomonas primoryensis, buzla kaplı acı göllerden4. Bu AFP, oksijen ve besin maddelerine daha iyi erişim için bakteriyi buza tutturdığı düşünülen çok daha büyük bir adhesinproteini 5'inbir parçasıdır 6 . Diğer mikropların, içinde yaşadıkları buzun yapısını değiştirebilecek AP'leri salgıladığı bilinmektedir7.
AFP'ler bazı balıklarda, böceklerde, bitkilerde, alglerde, bakterilerde, diatomlarda ve mantarlarda bulunmuştur. Çeşitli durumlarda farklı soydaşlardan evrimleriyle tutarlı son derece farklı dizilere ve yapılara sahiptirler; ve yine de hepsi buza bağlanır ve adsorpsiyon-inhibisyon mekanizması ile büyümesini engeller8. AP'lerin her biri, buz bağlama bölgesi (IBS) görevi görür. Bunlar tipik olarak9-11yüzey kalıntılarının bölgeye yönlendirilmiş mutajenisi ile tanımlanmıştır. IBS, su moleküllerini belirli buz düzlemleriyle eşleşen buz benzeri bir desende düzenlemek için hipotezlenmiştir. Böylece AFP ligandını bağlamadan önce oluşturur5, 12. Buz uçakları Miller endeksleri tarafından tanımlanabilir ve farklı AFP'ler farklı düzlemlere bağlanabilir. Bu nedenle, kış flounder'ından tip I AFP, 20-21 piramit düzlemlerinebağlanır 13, tip III AFP, bileşik bir buz bağlayıcı yüzey11,14kullanarak hem birincil prizma hem de piramit düzlemlerini bağlar, hiperaktif bir AFP olan ladin budworm AFP ise hem birincil hem de bazal uçaklara aynı andabağlanır 15,16. MpAFP gibi diğer hiperaktif AFP'ler, tek buz kristali yarımkürelerinin tam kapsamı ile gösterildiği gibi birden fazla buz düzlemine bağlanır5,17. Hiperaktif AFP'lerin bazal düzlemi ve diğer uçakları bağlama yeteneğinin, orta derecede aktif AFP'ler18üzerinde 10 kat daha yüksek aktivitelerini hesaba katabileceği varsayılmaktadır. Hiperaktif AFP'lerin verimliliği iyi belgelenmiş olsa da, birden fazla buz düzlemine bağlanma yetenekleri hala anlaşılamamıştır.
AFP'ye bağlı buz uçaklarını belirlemek için orijinal yöntem Charles Knight13,19tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemde, makroskopik tek bir buz kristali içi boş bir metal çubuğa (soğuk parmak) monte edilir ve gazsız suyla dolu yarım küreye batırılarak yarımküreye oluşturulur. Daha sonra, yarımküre seyreltilmiş bir AFP çözeltisine batırılır ve AFP çözeltisinden buz kristali yarımküresine soğuk parmaktan dolaşan etilen glikolün sıcaklığı tarafından kontrol edilen birkaç saat içinde bir buz tabakası yetiştirilir. Buz kristali çözeltiden çıkarılır, soğuk parmaktan ayrılır ve -10 ila -15 ° C dondurucu odasına yerleştirilir. Yüzey, antifriz protein çözeltisinin donmuş yüzey filmini çıkarmak için keskin bir bıçakla kazınmıştır ve buz kristalinin en az 3 saat boyunca yüce olmasına izin verilir. Süblimasyondan sonra, AFP'ler tarafından bağlanan buz düzlemleri, artık proteinden elde edilen beyaz kazınmış desenler olarak görülebilir. Buz yarımküre, buzun bazal ve prizma düzlemlerini bulmak ve kazınmış yamaların Miller endekslerini belirlemek için ceksenine ve bir-eksenlerine yönlendirilebilir.
Burada, FLORESAN bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA)11olarak adlandırdığımız bir yöntem olan AFP'ye bağlı buz düzlemlerini belirlemek için orijinal yöntemin bir değişikliğini açıklıyoruz. AFP'ler, yeşil floresan protein (GFP)11,16,17,20gibi bir kimerik etiketle veya AFP5,21'eyaygın olarak bağlı bir floresan boya ile floresan olarak etiketlenmiştir. Floresan etiketli AFP'ler tek bir buz kristaline adsorbe edilir ve orijinal buz aşındırma deneyleriyle aynı deneysel prosedür kullanılarak büyür. AFP'nin büyüyen buz yarımküreye bağlanmasının boyutu, deney boyunca ultraviyole (UV) lamba kullanılarak izlenebilir. Deney tamamlandıktan sonra, yarımküre doğrudan soğuk parmaktan çıkarılabilir ve süblimasyon olmadan görüntülenebilir. Bununla birlikte, istenirse, yarımküre geleneksel bir buz kazımasını görselleştirmek için yüce bırakılabilir. FIPA metodolojisine getirilen değişiklikler, geleneksel buz aşındırma protokolünü birkaç saat kısaltır. Ayrıca, AFP'ye bağlı buz düzlemlerinin çakışan desenlerini görselleştirmek için her biri farklı bir floresan etikete sahip birkaç AFP'yi aynı anda görüntüleme potansiyeli vardır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:177px;">NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">RTE7</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:177px;">Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant</td>
			<td style="width:95px;">Certified</td>
			<td style="width:145px;">29-3037-0</td>
			<td style="width:189px;">Common automotive antifreeze</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:177px;">Cold finger</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:177px;">Hemispherical cup</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:177px;">High Dual Output Lighting System</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX</td>
			<td style="width:189px;">Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:177px;">Camera</td>
			<td rowspan="2" style="width:95px;">Canon</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">EOS 50D</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:177px;">Emission Filters</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG</td>
			<td style="width:189px;">Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity

Antifriz proteinleri (AFP'ler), iç buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için çeşitli soğuk sert organizmalarda ifade edilir. AP'ler buz bağlayıcı yüzeylerinden belirli buz düzlemlerine bağlanırlar. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AP'lerin bağlandığı buz düzlemlerini belirlemek için kullanılan değiştirilmiş bir tekniktir. FIPA, AFP'ye bağlı buz düzlemlerini belirlemek için orijinal buz aşındırma yöntemine dayanmaktadır. Kısaltılmış deneysel sürede daha net görüntüler üretir. FIPA analizinde, AFP'ler floresan olarak bir kimerik etiket veya kurvalent boya ile etiketlenir, daha sonra yavaşça bir yarımküreye önceden biçimlendirilmiş ve a ve ceksenlerini belirlemeye yönelik makroskopik tek bir buz kristaline dahil edilir. AFP'ye bağlı buz yarımküresi, spesifik olmayan ışığı engellemek için filtreler kullanarak AFP'ye bağlı düzlemleri görselleştirmek için UV ışığı altında görüntülenir. AFP'lerin floresan etiketlemesi, AFP adsorpsiyonunun buza gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Etiketlerin, AFP'lerin bağlandığı uçakları etkilemediği bulunmuştur. FIPA analizi ayrıca, bağlama düzlemlerini ayırt etmeye yardımcı olmak için aynı tek buz kristaline birden fazla farklı etiketli AFP bağlama seçeneği sunar. FIPA'nın bu uygulamaları, AFP'lerin büyümesini durdurmak için buza nasıl bağlanıp bağlanmasını ve birçok AFP üreten organizmanın neden birden fazla AFP izoformunu ifade ettiğini anlamamızı ilerletmeye yardımcı oluyor.

Tek buz kristalinin hazırlanması ve montajı, hataların en sık yapıldığı FIPA prosedürünün iki adımıdır. Hazırlanan buz kristalinin tek olup olmadığının belirlenmesi, protokol bölümünün 2.1. FIPA analizi için çok kanallı bir buz kristali kullanılırsa, sonuç, tutarlı bir bağlama deseni olmadan yarımküredeki AFP'lerin süreksiz bağlanması olacaktır (Şekil 6B). Buz kristali arayüzleri, AFP'nin bağlandığı buz düzlemlerinin etrafında bulunuyorsa, ni...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity at JoVE.com

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifriz proteinleri (AFP'ler) buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için belirli buz düzlemlerine bağlanır. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AFP'ye bağlı buz düzlemlerinin belirlenmesi için orijinal buz aşındırma yönteminin bir modifikasyonudur. AFP'ler floresan olarak etiketlenir, makroskopik tek buz kristallerine dahil edilir ve UV ışığı altında görselleştirilir.

Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

determining-ice-binding-planes-antifreeze-proteins-fluorescence-based

Research

JoVE Journal

Chemistry

8.9K Görüntüleme.  Queen's University. Antifriz proteinleri (AFP'ler) buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için belirli buz düzlemlerine bağlanır. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AFP'ye bağlı buz düzlemlerinin belirlenmesi için orijinal buz aşındırma yönteminin bir modifikasyonudur. AFP'ler floresan olarak etiketlenir, makroskopik tek buz kristallerine dahil edilir ve UV ışığı altında görselleştirilir.

Video: Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Ice binding proteins (IBPs), also known as antifreeze proteins, inhibit ice growth and are a promising additive for use in the cryopreservation of tissues. The main tool used to investigate IBPs is the nanoliter osmometer. We developed a home-designed cooling stage mounted on an optical microscope and controlled using a custom-built LabVIEW routine. The nanoliter osmometer described here manipulated the sample temperature in an ultra-sensitive manner.

Buz Bağlayıcı Protein İncelemelerde LabVIEW çalıştırılan Roman nanolitre Ozmometre

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Kimya

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic isotopes are typically incorporated metabolically to improve the sensitivity and allow for sequential resonance assignment. Reductive 13C-methylation is an alternative labeling method for proteins that are not amenable to bacterial host over-expression, the most common method of isotope incorporation. Reductive 13C-methylation is a chemical reaction performed under mild conditions that modifies a protein&#39;s primary amino groups (lysine &#949;-amino groups and the N-terminal &#945;-amino group) to 13C-dimethylamino groups. The structure and function of most proteins are not altered by the modification, making it a viable alternative to metabolic labeling. Because reductive 13C-methylation adds sparse, isotopic labels, traditional methods of assigning the NMR signals are not applicable. An alternative assignment method using mass spectrometry (MS) to aid in the assignment of protein 13C-dimethylamine NMR signals has been developed. The method relies on partial and different amounts of 13C-labeling at each primary amino group. One limitation of the method arises when the protein&#39;s N-terminal residue is a lysine because the &#945;- and &#949;-dimethylamino groups of Lys1 cannot be individually measured with MS. To circumvent this limitation, two methods are described to identify the NMR resonance of the 13C-dimethylamines associated with both the N-terminal &#945;-amine and the side chain &#949;-amine. The NMR signals of the N-terminal &#945;-dimethylamine and the side chain &#949;-dimethylamine of hen egg white lysozyme, Lys1, are identified in 1H-13C heteronuclear single-quantum coherence spectra.

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Two methods for assigning the &#945;- and &#949;-dimethylamine nuclear magnetic resonance signals of a reductively 13C-methylated N-terminal lysine are described. One method utilizes the pH-induced selectivity of the reductive methylation reaction, and the other uses aminopeptidase to selectively remove the N-terminal lysine.

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Kısa Peptidlerinin Self-meclisi tarafından Sıralı Biyomoleküler Yapıların Oluşumu

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the time-profile volume and enthalpy changes of light induced conformational changes in proteins on microsecond to millisecond time-scales that are not accessible using traditional stop-flow instruments. In addition, since overall changes in volume and/or enthalpy are probed, these techniques can be applied to proteins and other biomacromolecules that lack a fluorophore and or a chromophore label. To monitor dynamics and energetics of structural changes associated with Ca2+ binding to calcium transducers, such neuronal calcium sensors, a caged calcium compound, DM-nitrophen, is employed to photo-trigger a fast (&#964; &#60; 20 &#956;sec) increase in free calcium concentration and the associated volume and enthalpy changes are probed using photothermal beam deflection technique.

Here we report an application of the photothermal beam deflection technique in combination with a caged calcium compound, DM-nitrophen, to monitor microsecond and millisecond dynamics and energetics of structural changes associated with the calcium association to a neuronal calcium sensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator.

Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Pro-floresan alt madde analog ile PAD4 Faaliyet flüoresan&#39;a bağlı İzleme

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional units (e.g., domains). Traditional consensus-building models fail to account for interpositional dependencies &#8211; functionally required covariation of residues that tend to appear simultaneously throughout evolution and across the phylogentic tree. These relationships can reveal important clues about the processes of protein folding, thermostability, and the formation of functional sites, which in turn can be used to inform the engineering of synthetic proteins. Unfortunately, these relationships essentially form sub-motifs which cannot be predicted by simple &#8220;majority rule&#8221; or even HMM-based consensus models, and the result can be a biologically invalid &#8220;consensus&#8221; which is not only never seen in nature but is less viable than any extant protein. We have developed a visual analytics tool, StickWRLD, which creates an interactive 3D representation of a protein alignment and clearly displays covarying residues. The user has the ability to pan and zoom, as well as dynamically change the statistical threshold underlying the identification of covariants. StickWRLD has previously been successfully used to identify functionally-required covarying residues in proteins such as Adenylate Kinase and in DNA sequences such as endonuclease target sites.

Synthetic protein sequences based on consensus motifs typically ignore co-evolving residues, that imply interpositional dependencies (IPDs). IPDs can be essential to activity, and designs that disregard them may result in suboptimal results. This protocol uses StickWRLD to identify IPDs and help inform rational protein design, resulting in more efficient results.

Sentetik Proteinlerin Optimizasyon: interpozisyonel bağımlılıklar belirlenmesi Yapısal belirten ve / veya Fonksiyonel Bağlantılı tortular

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). The fibronectin protein film was immobilized on the silicon nitride (SiN) membrane that forms the SALVI detection area. During ToF-SIMS analysis, three modes of analysis were conducted including high spatial resolution mass spectrometry, two-dimensional (2D) imaging, and depth profiling. Mass spectra were acquired in both positive and negative modes. Deionized water was also analyzed as a reference sample. Our results show that the fibronectin film in water has more distinct and stronger water cluster peaks compared to water alone. Characteristic peaks of amino acid fragments are also observable in the hydrated protein ToF-SIMS spectra. These results illustrate that protein molecule adsorption on a surface can be studied dynamically using SALVI and ToF-SIMS in the liquid environment for the first time.

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work presents a protocol for liquid handling and sample introduction to a microchannel for in situ time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of protein biomolecules in an aqueous solution.

SALVI ve TOF-SIMS tarafından Su Sönmüş Proteinlerin In Situ Karakterizasyonu içinde

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins with the synthesis of a hydrophilic poly(oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) (POEGMA) homopolymer using reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization. Under mild visible light irradiation (&#955; = 460 nm, 0.7 mW/cm2), this macro-chain transfer agent (macro-CTA) in the presence of a ruthenium based photoredox catalyst, Ru(bpy)3Cl2 can be chain extended with a second monomer to form a well-defined block copolymer in a process known as Photoinduced Electron Transfer RAFT (PET-RAFT). When PET-RAFT is used to chain extend POEGMA with benzyl methacrylate (BzMA) in ethanol (EtOH), polymeric nanoparticles with different morphologies are formed in situ according to a polymerization-induced self-assembly (PISA) mechanism. Self-assembly into nanoparticles presenting POEGMA chains at the corona and poly(benzyl methacrylate) (PBzMA) chains in the core occurs in situ due to the growing insolubility of the PBzMA block in ethanol. Interestingly, the formation of highly pure worm-like micelles can be readily monitored by observing the onset of a highly viscous gel in situ due to nanoparticle entanglements occurring during the polymerization. This process thereby allows for a more reproducible synthesis of worm-like micelles simply by monitoring the solution viscosity during the course of the polymerization. In addition, the light stimulus can be intermittently applied in an ON/OFF manner demonstrating temporal control over the nanoparticle morphology.

This article describes a process for producing polymeric self-assembled nanoparticles using visible light mediated dispersion polymerization. Using low energy visible light to control the polymerization allows for the reproducible formation of self-assembled worm-like micelles at high solids content.

Photoredox Katalizörü kullanarak görünür ışık aracılığı ile dispersiyon polimerleştirilmesi ile solucan gibi miseller Facile sentezi

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, the focus is on metallic substrates immersed in acidic solutions containing organic corrosion inhibitors, as these systems can be particularly sensitive to oxidation following removal from solution. To minimize the likelihood of such degradation, samples are removed from solution within a glove box purged with inert gas, either N2 or Ar. The glove box is directly attached to the load-lock of the ultra-high vacuum X-ray photoelectron spectroscopy instrument, avoiding any exposure to the ambient laboratory atmosphere, and thus reducing the possibility of post immersion substrate oxidation. On this basis, one can be more certain that the X-ray photoelectron spectroscopy features observed are likely to be representative of the in situ submerged scenario, e.g. the oxidation state of the metal is not modified.

A protocol to avoid the oxidation of metallic substrates during sample transfer from an inhibited acidic solution to an X-ray photoelectron spectrometer is presented.

XPS ile Korozyon Önleyici / Metal Arayüz Kimyasal Bileşimi Belirlenmesi: En Aza İndirme Mesaj Daldırma oksidasyonu

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...