Name: in situ characterization of hydrated proteins in water by salvi and tof-sims
Uploaded: 2016-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS at JoVE.com

We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.

SALVI Mikrokanallı 1. Temizlik ve Sterilizasyon <ol><li> Salvi mikrokanal Sterilizasyonu <ol><li> , Bir şırınga içine% 70 etanol sulu çözeltisi 2 ml çizin salvi giriş ucuna sahip bir şırınga bağlayın ve yavaş yavaş 10 dakika içinde sıvının 1 ml enjekte edilir. enjeksiyon sonunda şırıngayı çıkarın. Sonra, bir polietereterketon (PEEK) birliği ile Salvi girişini ve çıkışını bağlayın. Alternatif olarak, aynı prosedürü gerçekleştirmek için bir şırınga pompası kullanın. Örneğin, 100 ul / dakika akış hızını ayarlamak. </li><li> 4 saat oda sıcaklığında% 70 etanol çözeltisi ile dolu SALVI mikrokanalı tutun. </li></ol></li><li> Salvi içine Deiyonize (DI) Su tanıtmak <ol><li> , Bir şırınga içine sterilize DI su 2 ml çizin Salvi girişi ile şırınga bağlayın ve yavaşça 10 dakika içinde sıvı 1 ml enjekte edilir. şırıngayı çıkarın ve bir PEEK birliği ile Salvi girişini ve çıkışını bağlayın. belirtildiği gibi Alternatif olarak, bir şırınga pompası kullanımıadım 1.1.1. </li></ol></li></ol> Salvi Protein Film 2. İmmobilizasyonu <ol><li> Salvi Protein Film Immobilize <ol><li> bir şırınga içine (fosfat tamponlu tuzlu su içinde 10 ug / ml, PBS) çözeltisi fibronektinin 2 ml çizme, yavaş yavaş 10 dakika içinde sıvının 1 ml enjekte edilir, Salvi girişi ile şırınga bağlayın şırınga kaldırmak, ve giriş bağlantı ve Salvi çıkışı bir PEEK birliği ile. </li><li> Temiz bir kültür kabı içinde fibronektin çözeltisi ile doldurulmuş salvi inkübe 12 saat oda sıcaklığında kaputu çanak tutmak. </li><li> bir şırınga içine sterilize DI su 2 ml çizin ve Salvi girişi ile şırınga bağlayın. Yavaşça, 10 dakika su 1 ml enjekte şırınga kaldırmak ve Salvi girişini ve çıkışını bağlayın. Not: Bir ışık mikroskobu ile donatılmış ise, SİN membran TOF-SIMS analizden önce sağlam olduğundan emin olmak için mikroskop altında Salvi kontrol edin. Şimdi SALVI cihaz hazır ToF-SIMS biralysis. </li></ol></li></ol> 3. TOF-SIMS Loadlock Odası içine Salvi yükleyin Not: SALVI kotarma ve yüzey analizi sırasında olası kirlilikleri önlemek için TOF-SIMS sahneye takarken Eldiven her zaman giyilmelidir. <ol><li> Sahne üzerine Dağı SALVI <ol><li> düz ve temiz bir zemine TOF-SIMS sahne yatırın. silikon gofret ve SiN zar yukarı bakacak şekilde sahneye SALVI cihazı koymak. dört metal sıkma parçaları kullanarak Salvi Fix ve dört vida ile metal plakanın içine cihazın köşe tutan metal parçalar vida. </li><li> Yavaşça mikroakışkan kanala bağlı PFTE boruyu döndürün. sert bir bölümünü basılı tutun dört metal parçalar ve dört vidayı kullanın. bu analiz sırasında birincil iyon ışını ile karışmaz, böylece cihazın SIMS sahnede açık alanda yerleştirildiğinden emin olun. Ek resim ve SALVI fabricat ve illüstrasyoniyon ve kurulum önceki yayınlarda mevcuttur. 8,9,11 </li></ol></li><li> Sahne Alanı&#39;na Faraday Kupası monte edin <ol><li> bir vida ile sahnede Faraday fincan sabitleyin. </li></ol></li><li> içine Stage yükleyin ToF-SIMS Loadlock Odası <ol><li> , TOF-SIMS loadlock açın tutun ve yükleme platformu üzerine yatay olarak sahne ve loadlock kapağını kapatın. </li></ol></li></ol> 4. TOF-SIMS Veri Toplama <ol><li> (10 -6 mbar veya Torr emriyle, örneğin) Vakum pompası açın ve uygun vakum sağlamak loadlock odasına ulaşılır. </li><li> Vakum 30 dakika sonra kararlı bir kez ana hazneye salvi taşıyın. Not: Vakum veri toplama sırasında ana odasında daha düşük 5 x 10 -6 mbar vakum olmalıdır. Aksi takdirde, daha yüksek vakum SALVI sisteminde bir sızıntı göstergesidir. </li><li> Bir ile TOF-SIMS birincil iyon ışını ve analizörü ayarlamaüretici tavsiyelerine göre, yaklaşık 400 nm uzaysal çözünürlüğü. çevrim süresi DC modunda 30 mikro-sn iken primer ışın akımı 1200 pA olduğunu. Not: Bu işlem, büyük ölçüde üreticinin tavsiyelerini takip ediyor. </li><li> optik mikroskop kullanarak mikroakışkan kanal bulun. bir referans olarak optik görüntü merkezini kullanabilir ve ikincil iyon görüntü merkezi ile tutarlı olacak şekilde hizalayın. </li><li> Her ölçümden önce, yüzey kontaminasyonu gidermek için ~ için 500 x 500 mm 2 alana sahip SiN penceresinde 15 sn taramak için 1 KeV O 2 + ışını (~ 40 nA) kullanın. Ayrıca, tüm ölçümler sırasında yüzey şarj telafi etmek için bir elektron taşkın tabancası kullanın. Bu adım için varsayılan modda sel silahın otomatik işlevini kullanın. </li><li> veri toplama önce pozitif veya negatif modunu seçin. Tüm ölçümlerde birincil iyon ışını olarak 25 keV Bi 3 + ışını kullanın. Not: adımlar benzer f vardırya da pozitif ve negatif veri satın almalar. alanı ilgi için, pozitif mod burada ayrıntılı olarak tarif edilmektedir. <ol><li> Derinlik Profil <ol><li> 32 piksel çözünürlükte 32 piksel ~ 2 mikron çapında yuvarlak bir alanda Bi 3 + ışını tarayın. </li><li> Punch-aracılığıyla SiN membranı gereken süreyi en aza indirmek için, uzun bir darbe genişliği kullanımı (yani, 180 NSEC, 100 mikro saniye olduğu bir döngü sırasında demet akımı ~ 1,0 pA) Bi 3 + kiriş. sıvı yüzey artış ikincil iyonlar temsilcisi şiddetleri yumruk-through ulaşıldığında. yumruk-through zaman SiN membran toplu bağlı olarak 300 sn 500 sn arasında değişir. Not: Bu fark bizim deneyimine göre edinilen SiN membranların toplu ilişkili görünmektedir. Ancak, yumruk-through zaman gerçekten veri analizi etkilemez. </li><li> SİN membranı sonra-through yumruk yaklaşık 200 saniye boyunca aynı akım tutmak2D görüntü rekonstrüksiyon için yeterli veri elde. </li><li> Daha iyi kitle çözünürlük ile spektrumları elde etmek veri toplama 80 nsaniye için darbe genişliğini azaltır. hakkında başka bir 200 saniye bu satın devam edin. Şekil 1 &#39;de gösterilen spektrum verileri bu bölgeden elde edilir. </li></ol></li><li> 2D Görüntüleme ve Kütle Spektrumu <ol><li> Derinlik profil verilerini ölçerken aynı anda 2D görüntüleme ve kütle spektrumları verilerini toplamak. TOF-SIMS enstrüman deney sırasında her yerinde bütün bilgileri kaydeder. (- Spectra, FPanel - Profiller ve FPanel - ayrı Görüntüler FPanel) dijital kontrol yazılımı veri farklı pencerelerde gösterilir. mantıklı veri toplama sırasında her panelde verileri kontrol edin. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. TOF-SIMS Veri Analizi Not: Veri analizi ilk IonToF TOF-SIMS enstrümantal yazılımını kullanarak gerçekleştirilmektedir. <ol><li> Açık birDaha sonra SIMS (Ölçme Explorer) ve alysis yazılım derinliği profili, m / z spektrumu ve görüntü verilerini işlemek için sırasıyla, &quot;profilleri &#39;,&#39; spektrumları &#39;ve&#39; imaj &#39;düğmelerini tıklatın. </li><li> uzantısı &quot;.ita&quot; sahip veri dosyalarını açın. </li><li> Ilgi doruklarına Seç &quot;iyon&quot; kutusuna tür adını yazın ve spektrumları farklı renkleri ile etiketlemek. x ekseni boyunca sürüklemek için farenin kaydırma tekerleğini kullanın. pik yükseklikleri ve genişlikleri ayarlamak için Ctrl ve kaydırma tekerleğini kullanın. y-ekseni boyunca doğrusal ve Log modları arasında mektup &quot;L&quot; geçer. </li><li> Kitle kalibrasyon önce veri yeniden yürütün. Aksi takdirde, bu kütle kalibrasyon aşamasında tepeler arasındaki aralığı tercih zordur. <ol><li> ilgi derinliği profil verilerini seçin ve derinlik profili zamansal seriye göre spektrumları yeniden. </li><li> rekonstrüksiyon düğmesini tıklayın. int bir tarama aralığı &quot;Başlat Yeniden&quot; penceresinde,erest. Derinlik profili verilerini yeniden &quot;Tamam&quot; a tıklayın. </li></ol></li><li> Bir kitle kalibrasyonu gerçekleştirin. Basın &quot;F3&quot; &quot;kitle kalibrasyon&quot; penceresini açmak için. Belirli bir örneğe dayalı olarak kalibrasyonu için tepe seçin. 21, bu çalışmada, aşağıdaki tepe noktalarını kullanmak CH3 + (m / z 15) H, 3 O + (m / z 19), C2-H 5 + (m / z 29 ) H, 5 O 2 + (m / z 37), C3, H 7 + (m / z 43) H, 7 O 3 + (m / z 55) H, 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) ve pozitif mod için 13 konumundaki H atomu O 6 + (m / z 109). Aşağıdaki zirveler CH kullanın - (m / z 13), O - (m / z 16) OH, - (m / z 17), C2-H - (m / z 25), C3 H - (m / z 37) ve Cı 4H - (m / z 49), negatif mod. <ol><li> Bir tepe seçinaşağı ok penceresinin sol alt köşesindeki zirvesinde işaret olduğundan emin olun. O zirveyi tıklayın ve &quot;kitle kalibrasyon&quot; penceresinde zirve adını yazın, &quot;Ekle&quot; yi tıklayın ve ilgi iyon kütle kalibrasyonu dahildir. </li><li> Son olarak, &quot;yeniden kalibre&quot; butonuna tıklayın. piklerin alanları oranlarını şarj etme kütlesine göre doğru yerlere olup olmadığını kontrol edin. &quot;Spectrum&quot; menüsünde, seçmek ve yürütülen belirli analizlere göre &quot;Uygula Mass Kalibrasyon&quot; &quot;Tüm Spectra&quot; veya &quot;Seçilmiş spektrumları&quot;, tıklayın. </li></ol></li><li> tepe değer seçme örnek analiz için gerekli olan gibi, literatürde diğer önceki bulgulara göre, numunenin karakteristik tepeler belirler. m / z spektrumlarında ilgili maksimum yoğunluğu karşılaştır. Gerekirse, zirve listesinde gereksiz zirveleri yeni zirveleri eklemek ya da silmek. <ol><li> tepe ekleyin. Bir tepe üzerine tıklayın sol alt pencerede kırmızı çizgileri bulmak. Hold &quot;Ctrl&quot; tuşuna, otomatik zirve listesine bir pik ekler tepe genişliği tanımlamak için yatay fareyi kaydırın. zirveye eklemek için başka bir yolu penceresinin üstündeki &quot;zirve ekle&quot; düğmesine tıklayın sonra ana spektrum penceresinde bir tepe seçin ve etmektir. Yeni açılan pencerede ilgili özelliklere, &quot;Spectrum&quot; menüsünde, eklemek &quot;arama doruklarına&quot; seçeneğini kontrol etmek için pek çok zirveler varsa gerektiği gibi, daha sonra doruklarına ekleyin. </li><li> &quot;Tepe List&quot; menüsündeki, bir tepe listesini vermek, seçmek &quot;itmil&quot; biçiminde tepe listesi &quot;Kaydet ...&quot;. spektrum boyunca sürüklemek için Ctrl ve sol düğmesini kullanın. spektrumları penceresinde, ilgi bir tepe seçmek ve arzu edilen pozisyonlara iki kesik çizgileri sürükleyin. </li><li> Bir tepe listesini almak için, &quot;Kitle aralığı List&quot; menüsündeki, &quot;İthalat ...&quot;, dosya uzantısı &quot;.ITPL&quot; ile varolan zirve listesi dosyasını bulun seçin. &quot;Aç&quot; ı tıklayın. </li><li> olarak, bir &quot;itmil&quot; zirve listesini kullanmak için&quot;Kitle Aralığı Listesi&quot; menüsünden &quot;Aç ...&quot; seçeneğini tıklayın, dosyayı bulmak, ardından &quot;Aç&quot; a tıklayın. </li></ol></li><li> daha fazla veri analiz etmek için bir zirve listesi uygulayın. &quot;Spectra&quot; penceresinin sol-alt kısmında, &quot;Kitle Aralığı Listesi&quot; adı verilen bir pencere vardır. ithal pik listesi burada gösterilir. <ol><li> , Kullanılacak zirve listesi dosyasını sağ tıklatın &quot;aktif spektrumunun&quot; veya &quot;tüm spektrumları&quot; uygulamak. </li></ol></li><li> Veri profillerini görüntülemek. &quot;Profil&quot; penceresinde, kullan &quot;M&quot; harfi y eksenine uyacak şekilde pencereye (dizi) ve harfi &quot;N&quot; ile sığdırmak için. Ctrl kullanın ve profil genişliğini ayarlamak için kaydırma tekerleği. Veya y ekseni aralığını ve yüksekliğini değiştirmek için anahtar gemide &quot;*&quot; &quot;/&quot; kullanın ve. </li><li> ayrıca ilk analizden sonra diğer grafik yazılımı kullanarak komplo için İhracat verileri. <ol><li> &quot;Dosya&quot; menüsünden tıklayın &quot;Profil&quot; penceresinde, bir derinlik profili vermek için, daha sonra &quot;Export &amp; # seçin34 ;, seçin ve sonra bir &quot;.txt&quot; dosyası &quot;Farklı kaydet&quot;. </li><li> &quot;Spectra&quot; penceresinde, bir m / z spektrum dosyasını dışa &quot;Dosya&quot; menüsünden tıklayın, ardından &quot;Gönder&quot; i seçin ve ardından &quot;.txt&quot; dosyası &quot;olarak kaydet&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Görüntü&quot; penceresi, baskı ekranında, bir görüntü dosyasını dışa ve görüntü dosyası olarak kaydedin. </li></ol></li></ol> 6. TOF-SIMS Veri çiziliyor ve Tanıtım Not: SIMS veriler enstrümantal yazılımı kullanılarak işlenir sonra verileri çizmek için bir grafik aracı kullanın. <ol><li> veri almak için bir grafik aracı kullanın. </li><li> yeniden dağılım gösterir y ekseni olarak, x-ekseni ve pik yoğunluğu, m / z kullanarak bir arsa sağlayın. Bir örnek, Şekil 1 &#39;de verilmiştir. </li><li> yeniden derinlik profili zamansal dizi göstermek için y ekseni olarak x-ekseni ve tepe yoğunluğu olarak püskürtme zamanı kullanarak bir komplo yapın. Bir örnek figu verilmiştir2 yeniden. </li><li> Farklı m / z yeniden 2D birleştirir ve iyon eşleştirme göstermek için bir matris oluşturur. Bir örnek, Şekil 2&#39;de verilmiştir. </li></ol>

<ol>
	<li>Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+rotation+barriers+on+protein+molecular+surfaces.">Water rotation barriers on protein molecular surfaces.</a> Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).</li><li>Maruyama, Y., Harano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+water+drive+protein+folding?.">Does water drive protein folding?.</a> Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).</li><li>Chaplin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion+-+Do+we+underestimate+the+importance+of+water+in+cell+biology.">Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hydration+dynamics+around+a+protein+surface.">Mapping hydration dynamics around a protein surface.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).</li><li>Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry+analysis+of+conformational+changes+in+adsorbed+protein+films.">Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films.</a> Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).</li><li>Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+proteins+with+solid+surfaces.">The interaction of proteins with solid surfaces.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).</li><li>Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+structure+of+binary+and+ternary+adsorbed+protein+films+using+electron+spectroscopy+for+chemical+analysis,+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry,+and+radiolabeling.">Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling.</a> Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).</li><li>Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+liquid+surfaces+under+vacuum+using+SEM+and+and+ToF-SIMS.">Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).</li><li>Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+hybrid+microfluidic+platform+compatible+for+in+situ+imaging+by+vacuum-based+techniques.">Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques.</a> J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).</li><li>Yu, X. -. Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+aqueous+surfaces+by+ToF-SIMS.">Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS.</a> LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).</li><li>Yu, X. -. Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+and+methods+for+analyzing+liquids+under+vacuum.">Systems and methods for analyzing liquids under vacuum.</a> US patent. , (2013).</li><li>Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electrochemical+device+and+process+for+chemical+imaging+and+electrochemical+analysis+at+the+electrode-liquid+interface+in+situ.">Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ.</a> US patent. , (2014).</li><li>Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -. Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+microfluidic+device+for+in+situ+ToF-SIMS+analysis+of+selected+organic+molecules+at+aqueous+surfaces.">Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces.</a> Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+SEM+and+ToF-SIMS+analysis+of+IgG+conjugated+gold+nanoparticles+at+aqueous+surfaces.">In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces.</a> Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+molecular+imaging+of+hydrated+biofilm+in+a+microfluidic+reactor+by+ToF-SIMS.">In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS.</a> Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+and+three-dimensional+dynamic+imaging+of+live+biofilms+in+a+microchannel+by+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry.">Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry.</a> Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chemical+probing+of+the+electrode-electrolyte+interface+by+ToF-SIMS.">In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).</li><li>Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+at+a+glance.">Fibronectin at a glance.</a> J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).</li><li>Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+the+cell-attachment+site+in+fibronectin+with+monoclonal+antibodies+and+proteolytic+fragments+of+the+molecule.">Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule.</a> Cell. 26 (2), 259-267 (1981).</li><li>Engvall, E., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+soluble+form+of+fibroblast+surface+protein,+fibronectin,+to+collagen.">Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen.</a> Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).</li><li>Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOF-SIMS:+Accurate+mass+scale+calibration.">TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).</li><li>Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liquids+using+microfluidic+cells.">Imaging liquids using microfluidic cells.</a> Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).</li><li>Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailing+into+uncharted+waters:+recent+advances+in+the+in+situ+monitoring+of+catalytic+processes+in+aqueous+environments.">Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments.</a> Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).</li><li>Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+biophysical+tools+to+investigate+lipid+specificity+in+the+interaction+between+bioactive+molecules+and+the+plasma+membrane:+A+review.">Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review.</a> Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).</li><li>Kraft, M. L., Klitzing, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+lipids+with+secondary+ion+mass+spectrometry.">Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry.</a> Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).</li><li>Gilmore, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMS+of+organics-Advances+in+2D+and+3D+imaging+and+future+outlook.">SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook.</a> J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).</li><li>Muramoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToF-SIMS+Analysis+of+Adsorbed+Proteins:+Principal+Component+Analysis+of+the+Primary+Ion+Species+Effect+on+the+Protein+Fragmentation+Patterns.">ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns.</a> J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).</li><li>Br&#252;ning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+interpretation+of+ToF-SIMS+measurements+on+adsorbed+proteins+using+PCA.">Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA.</a> Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).</li><li>Gustavsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensor+applications.">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications.</a> J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).</li><li>Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+plasma+proteins+and+fibronectin+on+poly(hydroxylethyl+methacrylate)+brushes+of+different+thickness+and+their+relationship+with+adhesion+and+migration+of+vascular+smooth+muscle+cells.">Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells.</a> Regen Biomater. , 17-25 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

SALVI gibi TOF-SIMS ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) olarak vakum temelli araçların dinamik sıvı yüzey ve sıvı-katı ara analizine olanak sağlayan bir mikroakışkan arabirimdir. Küçük delikler kullanımı doğrudan vakum sıvı açığa nedeniyle SALVI herhangi bir değişiklik olmadan birçok ince odaklı spektroskopi ve görüntüleme teknikleri için uygundur; 22 taşınabilirlik ve Mikroakiskan çok yönlülüğü gerçek bir multimodal görüntüleme platformu yapmak. Farklı özellikle...

Hidrasyon yapısı, 1 konformasyon, 2 ve proteinlerinin biyolojik aktivitesi 3 için çok önemlidir. onları çevreleyen su molekülleri olmaksızın Proteinler canlı biyolojik aktiviteleri olmazdı. Özellikle, su molekülleri yüzey ve proteinlerin iç yapısı ile etkileşim ve proteinlerin farklı hidrasyon durumları farklı tür etkileşimleri yapmak. 4 katı yüzeyler ile proteinlerin etkileşim nanoteknoloji, biyomalzeme ve doku mühendisliği süreçlerinde etkileri olan temel bir olgudur. Çalışmalar, uzun bir protein, bir yüzey ile karşılaştığında olarak yapısal değişiklikler meydana gelebilir göstermiştir. TOF-SIMS protein katı arayüzü çalışma potansiyeline sahip teknik olarak tasavvur edilmiştir. 5-7 Potansiyel kendi yapısının mekanizmasının temel bir anlayış sağlar katı yüzeyler, proteinlerin hidrasyon anlamak önemlidir, konformasyon ve biyolojikark aktivitesi. Bununla birlikte, ana yüzey analitik teknikler çoğunlukla vakum tabanlıdır ve uçucu sıvı çalışmalar için doğrudan uygulamalar bağlı vakum ortamında uçucu sıvı hızlı buharlaştırma zordur. Biz sıvı yüzeyler ve sıvı-katı etkileşimleri (TOF-SIMS) zaman-of-flight ikincil iyon kütle spektrometresi kullanarak doğrudan gözlemler sağlamak için, sıvı Vakum Arabirimi (SALVI) at Analiz, uyumlu mikroakışkan arayüz Sistemi bir vakum geliştirdi. 8- 2) yüzey gerilimi, diyafram içinde sıvı tutmak için kullanılan 1) tespit penceresi sıvı yüzeyinin doğrudan görüntüleyebilen ve çapı 2-3 mikron bir açıklık ve 3) SALVI: 11 benzersiz özellikleri aşağıdakileri içerir birden fazla analitik platformlar arasında taşınabilir. 11,12 SALVI algılama alanı ve polidimetilsiloksan (PDMS) yapılmış bir mikrokanal bir silisyum nitrür (SİN) membran oluşur. Bu Fabr olduğunuTemiz oda gili ve imalat ve temel tasarım faktörleri önceki gazetelerde ve patent ayrıntılı edilmiştir. 8-12 analitik bir araç olarak TOF-SIMS uygulamaları bazı sulu çözeltilerde ve karmaşık sıvı karışımlarının, kullanarak çeşitli gösterildi hangi nanopartiküller içeriyordu. 13-17 Özellikle, SALVI sıvı TOF-SIMS yerinde yoğunlaştırılmış aşamasında yeni fırsatlar açarak, canlı biyolojik sistemlerin (yani, biyofilm), tek hücreler ve katı-elektrolit arayüzünün sıvı-katı arayüzü sondalama dinamik veriyor TOF-SIMS kullanarak sıvılar dahil çalışmalar. Bununla birlikte, mevcut tasarım henüz gaz-sıvı etkileşimleri izin vermez. Bu gelecekteki gelişimi için bir yönüdür. SALVI ilk kez bu çalışmada hidratlanmış bir protein filmi incelemek için kullanılmıştır. Fibronektin iki hemen hemen aynı disülfid bağları bir çift bağlı monomerler, 18 oluşan bir yaygın olarak kullanılan protein dimeri olan Ihücreleri bağlanma yeteneği için iyi bilinmektedir. Bu bir model sistem olarak seçildi 19,20 hidratlanmış bir protein filmi dinamik SALVI sıvı TOF-SIMS yaklaşımı kullanılarak sondalanabilir ki göstermek için. Protein çözeltisi, mikrokanal sokuldu. 12 saat inkübe edildikten sonra, bir hidratlı bir protein filmi SıN membran arka tarafında oluşturulmuş. Deiyonize (DI) su, protein girmesinden sonra kanal durulayın kullanıldı. Bilgi dinamik TOF-SIMS kullanarak SALVI mikrokanalda hidratlı fibronektin protein molekülleri toplanmıştır. DI su da hidrate fibronektin ince film elde edilen sonuçlarla karşılaştırmak için bir kontrol olarak çalışıldı. Belirgin farklılıklar sulandırılmış protein film ve DI su arasında gözlendi. Bu çalışma, sıvı ortamda yüzeyde protein adsorpsiyon roman salvi ve sıvı TOF-SIMS yaklaşımı kullanarak okudu edilebileceğini göstermektedir. video protokol ilgilenen kişiler için teknik rehberlik sağlamak için tasarlanmıştırTOF-SIMS ile Salvi farklı uygulamalar için bu yeni analitik aracı kullanan ve TOF-SIMS veri toplama ve analiz yanı sıra sıvı taşıma gereksiz hatalar azaltmak içinde.

<table><tbody><tr><td>ToF-SIMS</td><td>IONTOF</td><td>TOF.SIMS 5</td><td>Resolution: &gt;10,000 m/&amp;Delta;m for mass resolution; &gt;4,000 m/&amp;Delta;m for high spatial resolution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)</td><td>Pacific Northwest National Laboratory</td><td>N/A</td><td>SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.</td></tr><tr><td>PEEK Union</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td><td>for connecting the inlet and outlet of SALVI</td></tr><tr><td>5 Axes Sample Stage</td><td>IONTOF</td><td>N/A</td><td>Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure Water Purification System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11921</td><td>ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-377-821</td><td>Range: 100 to 1,000 ml</td></tr><tr><td>Pipette Tip</td><td>Neptune</td><td>2112.96.BS</td><td>1,000 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S25310A</td><td>95% Denatured</td></tr><tr><td>Gibco PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>pH 7.4</td></tr></tbody></table>

in situ characterization of hydrated proteins in water by salvi and tof-sims

Bu çalışma Sıvı Vakum Arabirimi (SALVI) ve (TOF-SIMS) zaman-of-flight ikincil iyon kütle spektrometresi de Analiz Sistemi kullanılarak sulu çözeltide protein biyomoleküllerin yerinde karakterizasyonu göstermektedir. fibronektin, protein filmi SALVI algılama alanı oluşturan silisyum nitrür (SİN) zar üzerinde hareketsizleştirildi. TOF-SIMS analizi sırasında, analizin üç modu, yüksek uzaysal çözünürlüğü kütle spektrometresi, iki boyutlu (2D) görüntüleme ve derinlik profilleme dahil yapılmıştır. Kütle spektrumları pozitif ve negatif modda hem de elde edildi. Deiyonize su, bir referans örnek olarak analiz edildi. Bizim sonuçları suda fibronektin filmi tek başına suya göre daha belirgin ve güçlü su küme zirveleri olduğunu göstermektedir. amino asit parçalarının karakteristik zirveleri de sulandırılmış protein TOF-SIMS spektrumları içinde gözlemlenebilir. Bu sonuçlar, bir yüzey üzerine bir protein molekülünün adsorpsiyon Dynamica incelenebilir olduğunu göstermektedirLly ilk kez sıvı ortamda Salvi ve TOF-SIMS kullanarak.

Örnek sonuçlar bir çift önerilen protokolün avantajlarını göstermek için sunulmaktadır. SALVI mikroakışkan arabirimini kullanarak, birincil iyon ışını (Bi 3 +) doğrudan DI su hidratlı fibronektin film üzerinde bombardımanına. Böylece sıvı yüzeyinin moleküler kimyasal haritalama başarıyla elde edilebilir. Şekil 1a ve sırasıyla hidratlı fibronektin film ve DI...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS at JoVE.com

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

Bu işlem, bir sulu çözelti içinde, protein biyomoleküllerin yerinde time-of-flight sekonder iyon kitle spektrometrisi analizi için bir mikrokanal sıvı kullanım ve numune girişi için bir protokol sunulur.

SALVI ve TOF-SIMS tarafından Su Sönmüş Proteinlerin In Situ Karakterizasyonu içinde

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

in-situ-characterization-hydrated-proteins-water-salvi-tof

Research

JoVE Journal

Chemistry

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

8.2K Görüntüleme.  Pacific Northwest National Laboratory.  Bu işlem, bir sulu çözelti içinde, protein biyomoleküllerin yerinde time-of-flight sekonder iyon kitle spektrometrisi analizi için bir mikrokanal sıvı kullanım ve numune girişi için bir protokol sunulur. 

Video: In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

İdrar Örneklerinin Hücre-Free DNA Bütünlüğü Analizi

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Kanser Araştırmaları

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the time-profile volume and enthalpy changes of light induced conformational changes in proteins on microsecond to millisecond time-scales that are not accessible using traditional stop-flow instruments. In addition, since overall changes in volume and/or enthalpy are probed, these techniques can be applied to proteins and other biomacromolecules that lack a fluorophore and or a chromophore label. To monitor dynamics and energetics of structural changes associated with Ca2+ binding to calcium transducers, such neuronal calcium sensors, a caged calcium compound, DM-nitrophen, is employed to photo-trigger a fast (&#964; &#60; 20 &#956;sec) increase in free calcium concentration and the associated volume and enthalpy changes are probed using photothermal beam deflection technique.

Here we report an application of the photothermal beam deflection technique in combination with a caged calcium compound, DM-nitrophen, to monitor microsecond and millisecond dynamics and energetics of structural changes associated with the calcium association to a neuronal calcium sensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator.

Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Kimya

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using conventional synthesis techniques. Coupling soft landing with in situ characterization using secondary ion mass spectrometry (SIMS) and infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS) enables analysis of well-defined surfaces under clean vacuum conditions. The capabilities of three soft-landing instruments constructed in our laboratory are illustrated for the representative system of surface-bound organometallics prepared by soft landing of mass-selected ruthenium tris(bipyridine) dications, [Ru(bpy)3]2+ (bpy = bipyridine), onto carboxylic acid terminated self-assembled monolayer surfaces on gold (COOH-SAMs). In situ time-of-flight (TOF)-SIMS provides insight into the reactivity of the soft-landed ions. In addition, the kinetics of charge reduction, neutralization and desorption occurring on the COOH-SAM both during and after ion soft landing are studied using in situ Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR)-SIMS measurements. In situ IRRAS experiments provide insight into how the structure of organic ligands surrounding metal centers is perturbed through immobilization of organometallic ions on COOH-SAM surfaces by soft landing. Collectively, the three instruments provide complementary information about the chemical composition, reactivity and structure of well-defined species supported on surfaces.

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of novel materials. Coupled with analysis by in situ secondary ion mass spectrometry (SIMS) and infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS), soft landing provides unprecedented insights into the interactions of well-defined species with surfaces.

Kütle-Seçilen İyonlar Yumuşak İniş Hazırlayan İyi tanımlanmış Yüzeyler Yerinde SIMS ve IR spektroskopisi

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. Their functionality critically depends on their specific organization within large and elaborate multisubunit transmembrane protein complexes. In order to understand at the molecular level how these complexes facilitate solar energy conversion, it is essential to understand protein-pigment, and pigment-pigment interactions, and their effect on excited dynamics. One way of gaining such understanding is by constructing and studying complexes of Chls with simple water-soluble recombinant proteins. However, incorporating the lipophilic Chls and BChls into water-soluble proteins is difficult. Moreover, there is no general method, which could be used for assembly of water-soluble proteins with hydrophobic pigments. Here, we demonstrate a simple and high throughput system based on water-in-oil emulsions, which enables assembly of water-soluble proteins with hydrophobic Chls. The new method was validated by assembling recombinant versions of the water-soluble chlorophyll binding protein of Brassicaceae plants (WSCP) with Chl a. We demonstrate the successful assembly of Chl a using crude lysates of WSCP expressing E. coli cell, which may be used for developing a genetic screen system for novel water-soluble Chl-binding proteins, and for studies of Chl-protein interactions and assembly processes.

This manuscript describes a simple and high-throughput method for assembling water-soluble proteins with hydrophobic pigments that is based on water-in-oil emulsions. We demonstrate the effectiveness of the method in the assembly of native chlorophylls with four variants of recombinant water-soluble-chlorophyll binding proteins (WSCPs) of Brassica plants expressed in E. coli.

Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended solvent window, low background currents, corrosion resistance, etc., arise from the catalytically inert nature of the surface. However, if during the growth process, non-diamond-carbon (NDC) becomes incorporated into the electrode matrix, the electrochemical properties will change as the surface becomes more catalytically active. As such it is important that the electrochemist is aware of the quality and resulting key electrochemical properties of the BDD electrode prior to use. This paper describes a series of characterization steps, including Raman microscopy, capacitance, solvent window and redox electrochemistry, to ascertain whether the BDD electrode contains negligible NDC i.e. negligible sp2 carbon. One application is highlighted which takes advantage of the catalytically inert and corrosion resistant nature of an NDC-free surface i.e. stable and quantifiable local proton and hydroxide production due to water electrolysis at a BDD electrode. An approach to measuring the local pH change induced by water electrolysis using iridium oxide coated BDD electrodes is also described in detail.

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

A protocol is described for the characterization of the key electrochemical parameters of a boron doped diamond (BDD) electrode and subsequent application for in situ pH generation experiments.

Bor Katkılı Elmas Elektrot Kalite ve Uygulamaya değerlendirilmesi<em&gt; In Situ</em&gt; Su Elektroliz ile Yerel pH Modifikasyonu

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Biyokimya

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American bullfrog, has become a mainstay of auditory and vestibular research. Studies of this organ have revealed how sensory cells hair can actively detect signals from the environment. Because of these studies, we now better understand the mechanical gating and localization of a hair cell&#39;s transduction channels, calcium&#39;s role in mechanical adaptation, and the identity of hair cell currents. This highly accessible organ continues to provide insight into the workings of hair cells. Here we describe the preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies on its hair cells. We include the complete dissection procedure and provide specific protocols for the preparation of the sacculus in specific contexts. We additionally include representative results using this preparation, including the calculation of a hair bundle&#39;s instantaneous force-displacement relation and measurement of a bundle&#39;s spontaneous oscillation.

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

The American bullfrog&#39;s (Rana catesbeiana) sacculus permits direct examination of hair-cell physiology. Here the dissection and preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies is described. We show representative experiments from these hair cells, including the calculation of a bundle&#39;s force-displacement relation and measurement of its unforced motion.

SALVI ve TOF-SIMS tarafından Su Sönmüş Proteinlerin In Situ Karakterizasyonu içinde

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler