Name: fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog at JoVE.com

This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4 Dönüşüm, Expression ve Arıtma <ol><li> PAD4 Dönüşüm için, kimyasal olarak, yeterli E. içine PAD4 GSTfüzyonunu içeren pGEX plazmid dönüşümü Aşağıdaki prosedür kullanılarak protein ifadesi için E. coli (E. coli türü BL21 (DE3) &#39;) hücreleri. Kimyasal yetkili (kalsiyum klorür) hazırlayın E. Standart protokollere göre coli (E. coli türü BL21 (DE3) &#39;) hücreleri. <ol><li> Önceden hazırlanan kimyasal yetkili BL21 (DE3) hücreleri buz üzerinde 50 ul çözülme ve 5 ml kültür tüpü içinde PAD4 genini içeren pGEX plazmidin 1 ul ile karıştırılır. Yavaşça her 2 dakikada çalkalayarak 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe karışımı. </li><li> Isı 40 sn için 42 ° C su banyosu içinde karışımın yerleştirerek hücreleri şok. Hemen hücrelerinin iyileşmesi için verilen 2 dakika geri buz üzerinde hücreye plazmid karışımı yerleştirin. Karışıma steril LB et suyu 1 ml ilave edilir ve 1 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. </li><li> 1 250 rpm&#39;de çalkalanarak, 37 ° C&#39;de hücreler şok ısı inkübehr. Pipet 75 bir ampisilin dayanıklı agar plakası üzerinde dönüştürülmüş hücrelerin ul ve 15 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. 4 ° C&#39;de muhafaza plaka. </li></ol></li><li> PAD4 ifadesi. <ol><li> 1x ampisilin içeren LB 5 ml ampisilin agar plaka ve yerden BL21 (DE3) hücreleri 1 koloni seçin. Küvöze ve 37 ° C&#39;de O / N sallayın. </li><li> 1x amfisilin trihidrat içeren steril LB (MW 403,45 g / Mol) 1 L LB (başlangıç) ve 5 ml aktarın. 37 ° C&#39;de çalkalama inkübatöründe yer büyüme. Büyüme OD 600 izler. Büyüme 600 0.3 bir OD ulaştığında, inkübatör sallayarak 16 ° C içine büyüme taşıyın. </li><li> OD 0.6 600, 0.3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / Mol) ile hücrelerin uyarılması ulaştıktan sonra. Hücreler 16 ° C&#39;de 15 saat boyunca çalkalanır izin verin. </li><li> 0 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 4000 x g&#39;de santrifüj ile hasat hücreleri. -80 ° C&#39;de süpernatant ve mağaza pelet kapalı dökün. </li></ol></li><li> PAD4 saflaştırma <ol><li> Yeniden askıya 50 mM NaCI (MA 58.44 g / Mol), bir tampon maddesi içinde hücreleri BL21 (DE3) &#39;de ifade edilen PAD4 içeren pelet, 300 mM NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / Mol), 10 mM imidazol (MW 68,077 g / mol), 0.1 mM fenilmetilsülfonil flüorür (PMSF, MW 174,94 g / Mol) ve 1 mM ditiyotretol (DTT, 154,25 g / Mol), pH = 8.0. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika süreyle sese tabi tutularak ile lizleyin hücreleri. Sonikasyonun ardından, 0 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de hücre lizat santrifüj. Dökün ve süpernatant kaydedin. Toplu, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca glutatyon (GSH) agaroz boncuklar ile yüzer. </li><li> Gravite ile GST boncuk / sütundan süpernatant boşaltın. Oda sıcaklığında 1 x PBS&#39;de (fosfat tamponlu tuz çözeltisi, pH = 8.0) ve 4 x 25 ml boncuk yıkayın. </li><li> Zehir PAD4 2 x 10 mi elüsyon tamponu ile, 50 mM tris (hidroksimetil) aminometan (Tris baz, MW 121.14 g / mol), 10 mM glutatyon (GSH, MW 307,32 g / Mol), pH = 8.0. </li><li> 100k MW kesme o kullanarak PAD4 Konsantreff santrifüj tüpleri ve santrifüj 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 4000 x g&#39;de. -80 ° C&#39;de kısım 1.0 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 200 ul hacim içinde, protein saklayın. </li></ol></li></ol> Tamponlar 2. hazırlanması Stok Çözümleri <ol><li> Sodyum klorür (NaCI, MA 58.44 g / mol) tartıldı ve 2M solüsyon hazırlanır. Berrak kadar çözüm karıştırın. </li><li> Tris (hidroksimetil) aminometan (Tris baz, MW 121,14 g / Mol) tartın ve = 8.0, 2 M çözelti, pH hazırlar. Berrak kadar çözüm karıştırın. </li><li> Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2 2H 2, O, MW 147,01 g / Mol) tartılır ve 500 mM&#39;lik çözelti hazırlayın. Berrak kadar çözüm karıştırın. </li><li> Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP, MW 250,19 g / Mol) tartılır ve 200 mM&#39;lik çözelti hazırlayın. -20 ° C&#39;de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. </li><li> Ditiyotretol (DTT, MW 154,25 g / mol) tartıldı ve 1 M solüsyon hazırlanır. -20 ° C&#39;de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. </li><li> HazırlamakTriton X-100% 0.5 çözeltisi. </li><li> Etilendiamintetraasetik asit (EDTA, MW 292,24 g / Mol) tartılır ve 100 mM&#39;lik çözelti hazırlayın. Berrak kadar çözüm karıştırın. </li><li> Hidroklorür (ZRcoum MW 621,69 g / Mol) metilkumarin Z Arg- Arg- -7- amido- 4- tartın ve dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM&#39;lik bir çözelti hazırlayın. </li></ol> 37 ° C&#39;de 3 PAD4 Deneyi <ol><li> 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 125 uM solüsyon hazırlanır. Bu 125 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak </li><li> 62.5 mM NaCI, 62.5 mM Tris, 12.5 mM CaCI2, 6.25 mM DTT tamponu ve 5 uM PAD4 (pH = 8.0) hazırlayın. Bu çözelti olacak B. </li><li> 62.5 mM NaCI, 62.5 mM Tris, 12.5 mM CaCI2, ve 6.25 mM DTT (pH = 8.0) &#39;in bir tamponu hazırlayın. Bu çözelti C olacak </li><li> (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. Berrak kadar çözüm karıştırın ve -20 ° C&#39;de saklayın° C. Bu çözelti, D olacak </li><li> 96 oyuklu bir plaka elde edilir ve bir kontrol için kuyu numarasına (PAD4) ve test kuyuları (+ PAD4) işaret etmektedir. </li><li> Pipet testi kuyular ve pipet kontrol kuyulara Çözüm C 160 ul içine Solüsyon B 160 ul. 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Pipet 40, tüm oyuklara Eriyik A ul ve 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Test kuyularının kontrol kuyuları yarısı ve yarısı dH 2 O Pipet 10 ul. Kontrol bölümlerinin ve test kontrolleri, bir pipet, 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca Çözelti D inkübe 10 ul diğer yarısına. </li><li> 345 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir. </li></ol> Oda sıcaklığında 4 PAD4 Deneyi <ol><li> 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 50 uM solüsyon hazırlanır. Bu 50 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak </li><li> 100 mM Na bir tampon hazırlayınCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 ve 8 uM PAD4 (pH = 8.0). Bu çözelti olacak B. </li><li> 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 (pH = 8.0) &#39;in bir tamponu hazırlayın. Bu çözelti C olacak </li><li> (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C&#39;de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti, D olacak </li><li> 384 oyuklu plaka elde edilir ve kontrol (hiçbir PAD4) ve test deliklerine (+ PAD4) için kuyu işaret etmektedir. </li><li> Pipet testi kuyular ve pipet kontrol kuyulara Çözüm C 25 ul içine Solüsyon B 25 ul. Oda sıcaklığında 20 dakika oyuklarda kuluçkalanması PAD4 olmadan / tampon izin verir. </li><li> Tüm kuyulara C çözeltisi pipetle 25 ul ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. </li><li> Test kuyularının kontrol kuyuları yarısı ve yarısı dH 2 O Pipet 10 ul. Kontrol bölümlerinin ve test kontrollerin diğer yarısı, pipett için10 dakika boyunca oda sıcaklığında Çözelti D inkübe e 10 ul. </li><li> 345 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir. </li></ol> 37 ° C&#39;de ve oda sıcaklığında 5. PAD4 saat Sahası Tahliller <ol><li> 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 125 uM solüsyon hazırlanır. Bu 125 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak </li><li> 62.5 mM NaCI, 62.5 mM Tris, 12.5 mM CaCI2, 6.25 mM DTT tamponu ve 5 uM PAD4 (pH = 8.0) hazırlayın. Bu çözelti olacak B. </li><li> (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C&#39;de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti C olacak </li><li> (Kaç zaman noktalarında bağlıdır kuyuların #) 2 96-iyi plakaları ve pipet kuyuların # miktarda içine Solüsyon B 160 ul edinin. </li><li> 37 ° C&#39;de bir 96 oyuklu plaka inkübe edin. Oda sıcaklığında, diğer 96 plaka inkübe edin. </li><li> Ölmekette hemen 40 hem 96 oyuklu plakalar içinde, tüm oyuklara Eriyik A ul ve t = 0 dakika kuyulara çözelti C, 10 ul pipetle. Tüm kuyuları söndürüldü edilinceye kadar belirli zaman noktalarında Çözüm C 10 ul ekleyerek devam edin. </li><li> 345 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir. </li></ol> RT&#39;de 6 PAD4 Engelleme Deneyi: <ol><li> 10 mM ZRcoum stoktan, su ZRcoum bir 83 uM solüsyon hazırlanır. Bu 83 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak </li><li> Cı-amidin (MW 424,8 g / Mol) tartıldı ve 100 uM stok solüsyonu hazırlanır. Bu çözelti olacak B. </li><li> 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 ve tampon ve 8 uM PAD4 (pH = 8.0) hazırlayın. Bu çözelti C olacak </li><li> 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 (pH = 8.0) &#39;in bir tamponu hazırlayın. ThÇözüm D. olacak olan </li><li> (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C&#39;de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti, E. olacak </li><li> 384 oyuklu plaka elde edilir ve kontroller için kuyu (Resim PAD4) Test oyuklarını (+ PAD4) ve inhibisyon kuyu (PAD4 + CI-amidin) işaret etmektedir. </li><li> Pipet testi kuyular ve pipet kontrol kuyulara Çözüm D 25 ul içine Çözüm C 25 ul. Oda sıcaklığında 20 dakika oyuklarda kuluçkalanması PAD4 olmadan / tampon izin verir. </li><li> Inhibisyon kuyulara Çözelti B&#39;nin pipetle 10 ul ve RTE&#39;nin 20 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Tüm kuyulara Çözelti A&#39;nın Pipet 15 ul ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. </li><li> Pipet tüm kuyulara Çözüm E 10 ul. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 345 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir. </li></ol> 7. ham hücre lizatının DeneyiRT&#39;de <ol><li> 50 mM Tris, 50 mM NaCI, 0.1 mM fenilmetilsülfonil flüorür (PMSF, MW 174,94 g / Mol) ve 1 mM ditiyotretol (DTT, 154,25 g / Mol), pH, 10 ml PAD4 1 L gelişme gelen süspansiyon hücreleri hücrelerin hasat edilmesinden sonra, = 8.0. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika süreyle sese tabi tutularak ile lizleyin hücreleri. 0 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de hücre lizatı santrifüjleyin. 100k MA kesme santrifüj tüpleri kullanılarak 4 ° C&#39;de 4,000 rpm&#39;de santrifüjleme ile yarım hacme berrak bir aktif madde konsantre edilir. </li><li> 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 250 uM solüsyon hazırlanır. Bu 250 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak </li><li> 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, ve 2 mM TCEP (pH = 8.0) &#39;in bir tamponu hazırlayın. Bu çözelti olacak B. </li><li> (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C&#39;de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti C olacak </li><li> Siyah, 384 oyuklu plaka ve tasarım elde edilirkontroller (hiçbir hücre dağılma) ve test kuyuları (+ hücre dağılma) için kuyu yedik. </li><li> Pipet testi kuyulara bütün kuyuları ve hücre lisatından pipet 60 ul içine Çözüm B 100 ul. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Tüm kuyulara Çözelti A&#39;nın Pipet 40 ul ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. </li><li> Pipet tüm kuyulara Çözüm C 10 ul. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 345 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyunda olan çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+protein+language+using+proteomics.">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li><li>Sims, R. J., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications.">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).</li><li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+to+study+genes+and+genomes.">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405, 837-846 (2000).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription.">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447, 407-412 (2007).</li><li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+switches+and+modification+cassettes+in+histone+biology+and+beyond.">Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond.</a> Nature. 425, 475-479 (2003).</li><li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications:+lessons+from+professional+pocket+pickers.">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li><li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+protein+modifications+with+interaction+domains.">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403, 41-45 (2000).</li><li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD,+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes:+genes,+features+and+involvement+in+disease.">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).</li><li>Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullination:+a+posttranslational+modification+in+health+and+disease.">Citrullination: a posttranslational modification in health and disease.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).</li><li>Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+of+peptidylarginine+deiminase+V+and+histone+deimination+in+granulocytes.">Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).</li><li>Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+of+histone+H2A+and+H4+at+arginine+3+in+HL-60+granulocytes.">Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes.</a> Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).</li><li>Kearney, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+characterization+of+protein+arginine+deiminase+4:+a+transcriptional+corepressor+implicated+in+the+onset+and+progression+of+rheumatoid+arthritis.">Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis.</a> Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).</li><li>Christophorou, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin.">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).</li><li>Wang, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminases+in+citrullination,+gene+regulation,+health+and+pathogenesis.">Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).</li><li>Trouw, L. A., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+serological+gap:+promising+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+rheumatoid+arthritis.">Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis.</a> Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).</li><li>Chang, X., Fang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PADI4+and+tumourigenesis.">PADI4 and tumourigenesis.</a> Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).</li><li>Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+peptidylarginine+deiminase+type+4+in+ovarian+tumors.">Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors.</a> Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).</li><li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+pathogenic+role+of+PADI4+in+oesophageal+cancer.">Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer.</a> Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+PADI4+cooperates+with+Elk-1+to+activate+c-Fos+expression+in+breast+cancer+cells.">Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li><li>Tanikawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+histone+modification+and+chromatin+structure+by+the+p53-PADI4+pathway.">Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway.</a> Nat. Commun. 3, 676 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest.">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li><li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4+(PAD4):+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential.">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4.">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+peptidylarginine+deiminase+(PAD)+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity.">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li><li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

Memeli proteinlerinin bir çok sayıda ağır ribozom tarafından proteinlerin sentezi, aşağıdaki enzimlerin etkimesi ile modifiye edilir. Bu post-translasyonel modifikasyonlar, (PTMS) büyük ölçüde protein 1-3 arasında (diğer özellikleri yanı sıra) boyut, yük, yapı ve oligomerizasyon durumunu değiştirerek Proteome fonksiyonel çeşitliliği artırabilir. Bunun bir sonucu olarak, protein yapısındaki bir değişiklik, örneğin protein bozulması, hücre farklılaşması, iletimde, gen ekspresyonunda modülasyonu ve protein-protein etkileşimleri gibi fizyolojik sonuçlara yol açabilir. Bu değişiklikler tüm insan proteinlerinin büyük bir yüzdesi görülürken histon proteinler kovalent modifikasyonlar 4 alışılmadık derecede yüksek sayıda geçmesi üzerine, terminal biter. Histon proteinler genomik DNA yoğunlaştırılmasını kolaylaştırır, yapısal proteinlerin bir ailesidir. Yapılandırılmamış histon kuyrukları Kovalent modifikasyonlar bir seride tarafından yürütülen ve düzenlenir, artıkları (yazarlar) ve kovalent modifikasyonunu katalize aynı değişiklikleri (silgiler), ters ve değişiklikler arasında ayrım enzimlerin s histon kuyrukları (okuyucu) 5-7 üzerine basılmış olan. Aslında, bilinen PTMS en metilasyon, fosforilasyon, asetilasyon, sumoylation, ubikitinasyon ve sitrülinlenmesine 8 de dahil olmak üzere histonun bu kısa segmenti içinde görülmektedir. Sitrülinlenmesine olmayan T RNA kodlanmış peptidil-sitrulin (Şekil 1A) peptidil-argininin dönüştürülmesini kapsar. Bu yan zinciri nötrleştirme sorumlu proteinleri, PAD üyesi olan kalsiyum-bağımlı enzimler olması her biri. 9,10, protein ailesini (s rginine D eiminase peptit). Bugüne kadar, PAD ailesinin beş üyesi (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 ve PAD6) &#39;de tarif edilmiştir. Bu ailenin her üyesi farklı hücresel proteinleri hedef görünür ve aynı zamanda uni görüntülerque doku dağılımı profilleri. PAD4 bir nükleer lokalizasyon dizisi 11 ile çekirdek içinde lokalize olduğu bilinmektedir, bu protein ailesinin tek üyesidir. Bu duruma göre, histon H2A arginin kalıntısının 3, PCR&#39;ın N-terminal kuyrukları arginin yan zincirler (H2R3), H + 3 (H3R2, H3R17 ve H3R26) ve H4 (H4R3) 12 nükler hedeflerin bir dizi deiminate gösterilmiştir, 13. PAD izozimlerinin, her özel ve kritik fizyolojik işlevlere sahip olsa da, PAD4 dolayı hastalıklı ve sağlıklı hücrelerinin her ikisinde de, insan gibi bir dizi işlem rolünü önemli ölçüde daha fazla ilgi çekmektedir. Son zamanlarda, PAD4 Pluripotency transkripsiyonel ağı 14 üye olduğu gösterilmiştir. Her iki PAD4 sentezleme seviyeleri ve aktivite, farelerde yeniden programlama ve taban durumu, pluripotent durumlarında yüksek olduğu gösterilmiştir. Kök hücre genlerin düzenlenmesini kontrol edilerek, PAD4 hücre yeniden programlama veriminde önemli bir rol tutabilirler. PAD4 de implike edilmiştirüzerine patojenlerin bağlanmasını nötrofil hücre dışı tuzakları, oluşumu kendi sistem açıklığı sağlar. PAD4 histon proteinleri hypercitrullination dolayısıyla bakteriyel enfeksiyonların 15,16 sakınma, hücre dışı tutucusu ile, patojen bakterilerin kapsüllenmesi için taban malzemesi olarak hizmet eden kromatin yoğunluk azaltılmasından neden olur. Buna ek olarak, PAD4 insan hastalıklarının bir dizi aktif bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Daha önce PAD4 anormal ekspresyon romatoid arteritin başlamasında ve şiddeti ile ilişkili olduğu gösterilmiştir, Alzheimer, Parkinson hastalığı ve multipl skleroz 17. Aslında, bir anti-sitrülin proteinin antikorların varlığı romatoid artrit 18 arasında en güvenilir ve kesin bir teşhis ve prognostik biyolojik biridir. Benzer şekilde, bozulmuş PAD4 aktivitesi en son yumurtalık, meme, akciğer, bir de dahil olmak üzere insan kanserlerinin bir dizi gözlenmiştird özofagus kanserleri 19-22. PAD4 ve kanser arasındaki bağlantı, p53 tümör bastırıcı bir protein 22,23 ELK1 onkogen üzerinden veya yoluyla aracılık ettiği gösterilmiştir ve önceki iş PAD4 bir yeni anti-kanser terapötik hedef 17,24,25 olabileceğini öne sürdü. Ilke çalışmanın bir kanıtı olarak, kolorektal kanser hücre çizgisi, HCT116 olarak shRNA ile PAD4 tükenmesi apoptoz ve hücre döngü yakalanmasını 26 uyarılması için yeterli olduğu bulundu. Son yıllarda geliştirilmiş olan geri dönüşü olmayan bir PAD4 inhibitörünün farelerde 27 tümör kütlesinde bir yetmiş oranında azalmaya yol açmıştır. Oldukça önemli ölçüde, PAD4 inhibisyon dönüştürülmemiş hücreleri ayırarak, kanser hücrelerinin seçici ölümüyle sonuçlanan bir hedefe yönelik bir tedavi olarak hareket ortaya çıktı. PAD4 işlevini kapatmak için küçük moleküllerin kullanımı, kanser hücrelerini hedef veya mevcut kanser, kemoterapi 28 artırmak için yeni ve güçlü bir strateji olduğu ispat edebilir. Ne yazık ki, POÇadır geri dönüşümlü PAD4 inhibitörü henüz keşfedilmeyi etti. Kovalent önleyicileri bir dizi alt-tabakanın arginin 27,29,30 taklit ile sağlıklı ve hastalıklı durumu hücrelerinin her ikisinde de PAD4 rolünü anlamak için pratik araçlar olduğu kanıtlanmıştır kloro / floro dj pirimidin kolu kullanarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu molekül, benzer etki ile, aktif pedlerin her inhibe eder. Bu nedenle, PAD4 aktivitesine ilişkin raporlar, basit bir deneme için olan ihtiyaç çok önemlidir. Bugüne kadar, PAD4 deneyler, kolorimetrik bir okuma 31 ile reaksiyondan amonyağın serbest bağlantı tarif edilmiştir, floresan polarizasyon tahlili için 32 flüoresan chloroamidine alt-tabaka analog kullanmaktadır glioksal ve sitrulline 33 arasındaki asit yardımlı reaksiyon üzerine dayanır ve bağlanma aşamasının 34 dequenching bir floresan PAD4 faaliyet. Bunlardan sadece kovalent değiştirici haloacetamidine stratejisi, yüksek verimli Scre ile uyumlu olduğu kanıtlanmıştırsürmesi gelen platformlar 32,35,36. Biz güvenilir PAD4 aktivitesini ölçen basit floresan dayalı tahlil açıklar. Güçlü bir sinyal-gürültü oranı, analiz hızı ve ölçüm sağlamlık gösterir deneyi, gerçekten kuvvetli ve seçici PAD4 inhibitörü keşfetmek için potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.amresco-inc.com/&quot;&gt;http://www.amresco-inc.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/&quot;&gt;http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/&quot;&gt;http://www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>All Buffer Salts&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td></tr><tr><td>Protino Glutathione (GSH) agarose&amp;nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Store at 4 &amp;deg;C; http://www.mn-net.com/</td></tr><tr><td>Chloroamidine&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemical&amp;nbsp;</td><td>10599</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td><td></td><td></td><td>Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.tecan.com/&quot;&gt;www.tecan.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.perkinelmer.com/&quot;&gt;http://www.perkinelmer.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

Başlangıçta ZRcoum 96 oyuklu bir plaka biçiminde, PAD4 aktivitesi rapor göstermiştir edilmiştir. Wells, alt-tabaka ZRcoum ve PAD4 varlığında / yokluğunda inkübe edildi. 475/15 nm filtre (Şekil 2A), - 37 ° C &#39;de 45 dakikalık bir inkübasyon döneminden sonra, floresan, bir 340/40 ile ölçüldü. Beklendiği gibi, floresans seviyesi ZRcoum (veya sitrülin ZRcoum) içindeki florofor olarak düşük kalmıştır kilitli ...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog at JoVE.com

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Pro-floresan alt madde analog ile PAD4 Faaliyet flüoresan&#39;a bağlı İzleme

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

fluorescence-based-monitoring-pad4-activity-via-pro-fluorescence

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.8K Görüntüleme.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Video: Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and biochemically verified was opsin, the apoprotein of the photoreceptor rhodopsin. Rhodopsin is a G protein-coupled receptor localized in rod photoreceptor disc membranes of the retina where it is responsible for the perception of light. Rhodopsin&#39;s scramblase activity does not depend on its ligand 11-cis-retinal, i.e., the apoprotein opsin is also active as a scramblase. Although constitutive and regulated phospholipid scrambling play an important role in cell physiology, only a few phospholipid scramblases have been identified so far besides opsin. Here we describe a fluorescence-based assay of opsin&#39;s scramblase activity. Opsin is reconstituted into large unilamellar liposomes composed of phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and a trace quantity of fluorescent NBD-labeled PC (1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine). Scramblase activity is determined by measuring the extent to which NBD-PC molecules located in the inner leaflet of the vesicle are able to access the outer leaflet where their fluorescence is chemically eliminated by a reducing agent that cannot cross the membrane. The methods we describe have general applicability and can be used to identify and characterize scramblase activities of other membrane proteins.

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Biyokimya

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Endotel Hücrelerinde Proteaz ile aktive olan reseptör ligandlarının incelenmesi

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding dyes and imaging instruments that can measure fluorescent emissions from up to 1,536 wells simultaneously. However, these instruments are much more expensive and can be challenging to maintain relative to widely available plate readers that scan wells individually. Described here is an optimized plate reader assay for use with an endothelial cell line (EA.hy926) to measure the protease-activated receptor (PAR)-driven activation of G&#945;q signaling and subsequent calcium mobilization using the calcium-binding dye Fluo-4. This assay has been used to characterize a range of PAR ligands, including the allosteric PAR1-targeting anti-inflammatory "parmodulin" ligands identified in the Dockendorff lab. This protocol obviates the need for an automated liquid handler and permits the medium-throughput screening of PAR ligands in 96-well plates and should be applicable to the study of other receptors that initiate calcium mobilization.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Enflamasyon Kontrolü için Proteaz ile Aktive Edilen Reseptörleri Hedeflemek için Parmodulinlerin Geliştirilmesi

An improved protocol for a calcium mobilization assay with endothelial cells, used to identify ligands of protease-activated receptors (PARs), has been developed. The new protocol reduces total assay time by 90-120 min and yields reproducible concentration-response curves.

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Pro-floresan alt madde analog ile PAD4 Faaliyet flüoresan'a bağlı İzleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme