Biz flow sitometri ve hücre sıralama deneyler sırasında uzman teknik yardım için E. Massicotte.H ve J. Tanrıya teşekkür ediyorum. Ayrıca, biz kan örnekleri sağlamak için IRCM klinik personeli ve tüm bağışçılara teşekkür etmek istiyorum. Periferik kan örnekleri Institut de Recherches cliniques de Montreal (IRCM) araştırma etik inceleme kurulu tarafından onaylanmış araştırma protokolleri altında Helsinki Bildirgesi uyarınca yazılı bilgilendirilmiş onam alındı ​​sağlıklı yetişkin donörlerden elde edildi. Aşağıdaki reaktifler NIH AIDS Reaktif Programı, AIDS, NIAID, NIH Bölümü ile elde edilmiştir: Dr. Douglas Richman gelen MT4 hücreleri; ve İnsan rlL-2 Dr. Maurice Gately, Hoffmann den - La Roche A.Ş. Cohen İnsan Retrovirology Kanada Araştırma Başkanı sahibidir. Bu çalışma Cohen&#39;e CIHR (CIHR 111.226) dan ve Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) Dr. Bego ve Cohen&#39;e AIDS şebekesinden hibe ile desteklenmiştir.

Genel Notlar Hatta kontrol bakteriyel enfeksiyonlar PBMC tarafından algılanabilen, çünkü herhangi bir antibiyotik olmaksızın kültür içinde hücreleri tutmak önemlidir. Bakteriyel bileşenlerin Böyle algılama belirli bir HIV-1 algılama ile tetiklenen ayırt edilemez bir plan interferon üretimini uyaracaktır. Ayrıca, tüm hücre rutin mikoplazma kontaminasyonu olmadığını anlamak için test edilmesi gerekir. Mümkün daima endotoksin içermeyen çözümleri kullanın. Farklı hücrelerin akış sitometrik karakterizasyonunu ko-kültürlerde kullanılmak üzere (PBMC, PDC, MT4 ve CD4 + T hücreleri) isteğe bağlı bir adımdır, ancak, belirli bir deney yorumlanabilir için gerekli olan değerli bilgiler sağlar çünkü çok tavsiye edilir. Bulaşmış hedef hücrelere hazırlanması 1. <ol><li> RPMI 1640 medi insan CD4 + T hücre soyu MT4 bakımıBir RPMI-1640 ortamı olarak artık ifade% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. </li><li> Primer CD4 + T hücrelerinin izolasyonu. <ol><li> Yoğunluk gradyan santrifüjü ile, insan periferal kanından mononükleer hücreler izole edin. </li><li> Üreticinin tavsiyelerine izlenerek, CD4 + T hücreleri, negatif seçim kiti kullanılarak, CD4 + T lenfositleri izole edin. </li><li> RPMI-1640 ortamı içinde 48 saat için PHA-L (5 ug / ml) ile CD4 + T lenfositleri etkinleştirme ve muhafaza hücreler, rekombinant IL-2 (100 U / ml) ile takviye edilmiştir. Birincil T hücreleri 5 gün sonrası izolasyonu bulaştırmak. </li></ol></li><li> Hedef hücreler (MT4 T hücre soyu ya da heterolog primer CD4 + T hücrelerinde) enfeksiyonu. <ol><li> HIV-1 virüsü ile T hücrelerinin, kültür-co enfekte iki gün önce. Burada tarif edilen spesifik örnekte pNL4.3-GFP_ires_Nef vahşi tip (WT) ya da pNL4.3-GFP_ires_Nef ö Vpu (dVpu) virüsleri kullanılmıştır. Bu viral suşlar gre temsilfloresan protein (GFP) grafik işlemcisinden ifade etme kabiliyetleri bakımından farklılık izogenik enfeksiyöz moleküler klonların -işaretli en. </li><li> Enfeksiyon (Mois) farklı çokluklarını kullanın ve ko-kültürler için enfeksiyon benzer seviyelerde kültürleri seçin. Eş-kültür, günün sitometrisi enfeksiyonun göstergesi olarak akışı ile GFP + hücrelerinin yüzdesini belirlemek. Ko-kültürler için% 20-50 enfekte olmuş hücrelerin bir dizi tek kültürleri kullanın. </li></ol></li></ol> İsteğe bağlı adımlar: Böyle BST2 ve CD4 gibi ilgi molekülleri / ligandların yüzey ifadesini değerlendirmek için bu noktada akım sitometri boyama yapın. Hücre yüzeyi boyama, anti-CD4_PerCP / Cy5.5 1 ul ve anti-BST2_A660 1 ul, yıkama çözeltisi 100 ul, 0.5 x 10 6 T hücreleri, yeniden süspanse edin. Yıkama çözeltisi akış sitometrisi ile yıkanmasından önce, 4 ° C &#39;de 45 dakika boyunca inkübe edin. Çalışmalar Vpu aracılı BST2 düşmanlık rolünü değerlendiren hedefleyen ise, HIV-1 parçacık gerçekleştirmekŞu anda salınım testi daha önce 15 nitelendirdi. Hücreleri (Tüm PBMC&#39;ler veya Zenginleştirilmiş PDC) Algılama 2. İzolasyon ve Zenginleştirme Not: PBMC&#39;Ier algılama kullanıldığında, kan alımından sonra yarım saat içinde izolasyon başlatmak ve zamanında bunu yapmak. Ko-kültürler veya pDC zenginleştirme için hemen PBMC&#39;leri kullanın. <ol><li> Yoğunluk gradyan santrifüjü ile, insan periferal kanından mononükleer hücreler izole edin. İsteğe bağlı adım: o taze izole PBMCler fizyolojik oranlarda farklı hücre soyları ihtiva onaylamak için çoklu-parametrik akış sitometri boyama yapın. Hücre yüzeyi boyama için Fc bloke edici çözelti 100 ul 10 6 PBMC&#39;ler tekrar süspansiyon ve 4 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. Bloke edildikten sonra, anti-CD3_Pacific Mavisi (miyeloid hücreleri), anti-CD14-PE_Texas Red 1 ul anti-BDCA2_APC 4 ul ve (pDC&#39;lerde için), anti-ILT7_PE 1 ul (T hücreleri için) 1 ul ekle. Tasarlamakyıkama çözeltisi akış sitometrisi ile yıkama öncesinde 4 ° C&#39;de 45 dakika boyunca borular. </li><li> Üreticinin önerilerine ardından pDC negatif seçim kiti kullanarak PDC zenginleştirin. Bu, hızlı çalışması, soğuk hücreler tutmak ve önceden soğutulmuş çözümleri kullanmalarını tavsiye edilir. Bu maksimal pDC aktivitesi sağlamak yanı sıra, hücre yüzeyi ve spesifik olmayan hücre etiketleme üzerindeki antikorların kuafajı önleyecektir. <ol><li> Saflığı, zenginleştirme yüzdesini ve (örneğin ILT7 ve BDCA2 gibi) pDC- özel yüzey belirteçlerinin nispi miktarlarını onaylamak için taze izole pDC&#39;lerde multi-parametrik akım sitometri analizi yapın. Hücre yüzeyi boyama için Fc bloke edici çözelti 100 ul 10 4 PDC tekrar süspansiyon ve 4 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. Bloke edildikten sonra, anti-CD3_Pacific Blue 1 ul anti-CD14_PE_Texas Red 1 ul anti-BDCA2_APC 4 ul ve anti-ILT7_PE 1 ul ekle. (PBS, 5, yıkama çözeltisi akış sitometrisi ile yıkanmasından önce, 4 ° C &#39;de 45 dakika boyunca inkübe edinmM EDTA,% 5 FBS). % 40 pDC saflıkta bir minimum (başlangıç ​​malzemesi% 0.4 PDC sahip ise, bu bir 100 katlık bir zenginleşmeye eşdeğer olacaktır) tavsiye edilir. </li></ol></li></ol> Enfekte CD4 + T hücrelerinin ve Algılama Hücreleri (Tüm PBMC&#39;leri veya Zenginleştirilmiş pDC&#39;lerde) 3. Co-kültür <ol><li> Oyuk başına (10 6 hücre / ml&#39;de seyreltilmiş) enfekte olmuş T hücrelerinin 30 ul PBMC&#39;lerin 220 ul veya pDC&#39;lerde 220 ​​ul (850,000 hücre / ml yoğunlukta seyreltilir) (100,000 500,000 hücre arasında değişen bir konsantrasyonda / ml) karıştırın Bir U tabanlı 96 oyuklu plaka. <ol><li> Tek başına kontroller, levha PBMC&#39;ler veya pDC&#39;lerde ve T hücreleri gibi. RPMI 1640 tam orta iyi 250 ul ses seviyesini ayarlayın. </li><li> TLR7 ve TLR9 yolların bilinen agonist hücresel yanıtları değerlendirin. Bu amaçla, PBMC&#39;lerin plakası 220 ul, U tabanlı, 96 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına ya da (100,000 ila 500,000 hücre / ml arasında değişen bir konsantrasyonda) pDC&#39;lerde 200 ul (850,000 hücre / ml yoğunlukta seyreltilir) ve (TLR7 agonisti ekleme Imiquimod, nihai konsantrasyon: 2.5 ug / ml) ya da TLR9 agonisti (ODN 2216 CpG-A, nihai konsantrasyon: 5 uM). 37 ° C de inkübe hücreleri ve% 5 CO Şubat 18-22 saat ve aşağıda tarif edilen ko-kültürler benzer bir şekilde işler. </li></ol></li><li> 37 ° C &#39;de ko-kültürler inkübe ve% 5 CO Şubat 18-22 saat boyunca ve daha sonra V-tabanlı 96 çukurlu levhaya transfer edin. 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. <ol><li> Düz dipli, 96 gözlü plakaya süpernatantlar aktarın. Süpernatanlar -80 ° C&#39;de saklanır veya hemen tip I IFN tespiti için de kullanılabilir. </li><li> % 2 lik paraformaldehid içinde eş-kültürlenen hücrelerin yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi kullanılarak analiz eder. Boyut ve granülasyonda farkı nedeniyle, MT4 hücreleri ileri dağılım (FS) profilleri ile kendi yan dağılım (SS) göre PBMC&#39;ler veya pDC&#39;lerde kolayca ayırt edilir. Primer T hücreleri, hedef enfekte hücreler olarak kullanılır, bu, örneğin CSFE gibi herhangi bir hücre izleyici boya ile önce birlikte kültür boyandı. </li></ol></li><li> HEK-Blue IFN-α / β raportör hücreleri kullanılarak biyo-aktif tip I IFN ölçümü. Not: Bu hücreler I IFN sinyal yolunun bir tam aktif türü elde etmek için, insan STAT2 ve IRF9 genleri ile HEK293 hücrelerinin kararlı transfeksiyonu ile oluşturulmuştur. Bunlar aynı zamanda, uyarılabilir promoter ISG54 beta / IFN-a kontrolü altında salgılanan alkalin fosfataz (SEAP) raportör geni içerir. Tip I IFN ile bu hücrelerin uyarılması, JAK / STAT / ISGF3 yolunu aktive ve SEAP üretilmesine neden olmaktadır. <ol><li> % 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM içinde HEK-Blue IFN-α / β hücreleri koruyun. 180 ul nihai hacim içinde, düz dipli 96 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 50,000 hücre olan bir yoğunlukta bunları Plate. </li><li> Iki kopya halinde her oyuğa ko-kültür süpernatant 20 ul ekle. Her bir plaka, aynı zamanda, iç standart bir kontrol seti (insan IFNa, 2500 U / ml ila 100 U / nihai konsantrasyonu) gerektirir. 18 için 37 ° C ve% 5 CO2 de inkübe edin-22 Saat. </li><li> Enzimin varlığında mavi / mora dönerken pembeden değişir Quanti-Blue çözeltisi kullanılarak alkalin fosfataz aktivitesi, seviyelerini belirlemek. Üreticinin önerilerine aşağıdaki Quanti-Mavi hazırlayın. Düz dipli, 96 gözlü plakanın her bir oyuğuna, bu çözeltinin 180 ul ekle. Her birine de indüklenmiş HEK-Blue IFN-α / β hücrelerinin süpernatanlarında 20 ul ekle ve renk standardı IFN kontrol oyuklarında gelişene kadar bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edilir. </li><li> 620-655 nm&#39;de bir spektrofotometre kullanılarak SEAP seviyelerini değerlendirmek ve IFN standart eğrinin doğrusal kısmından ekstrapolasyonla tip I IFN konsantrasyonunu belirler. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Colonna, M., Trinchieri, G., Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+immunity.">Plasmacytoid dendritic cells in immunity.</a> Nature immunology. 5, 1219-1226 (2004).</li><li>Lepelley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+sensing+of+HIV-infected+cells.">Innate sensing of HIV-infected cells.</a> PLoS pathogens. 7, e1001284 (2011).</li><li>Beignon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+HIV-1+activates+plasmacytoid+dendritic+cells+via+Toll-like+receptor-viral+RNA+interactions.">Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptor-viral RNA interactions.</a> The Journal of clinical investigation. 115, 3265-3275 (2005).</li><li>Martinelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+gp120+inhibits+TLR9-mediated+activation+and+IFN-{alpha}+secretion+in+plasmacytoid+dendritic+cells.">HIV-1 gp120 inhibits TLR9-mediated activation and IFN-{alpha} secretion in plasmacytoid dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3396-3401 (2007).</li><li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TLR7/9+responses+in+plasmacytoid+dendritic+cells+by+BST2+and+ILT7+receptor+interaction.">Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction.</a> The Journal of experimental medicine. 206, 1603-1614 (2009).</li><li>Bego, M. G., Mercier, J., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-activated+interferon+regulatory+factor+7+upregulates+expression+of+the+interferon-regulated+BST2+gene+independently+of+interferon+signaling.">Virus-activated interferon regulatory factor 7 upregulates expression of the interferon-regulated BST2 gene independently of interferon signaling.</a> Journal of virology. 86, 3513-3527 (2012).</li><li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu.">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li><li>Miyagi, E., Andrew, A. J., Kao, S., Strebel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpu+enhances+HIV-1+virus+release+in+the+absence+of+Bst-2+cell+surface+down-modulation+and+intracellular+depletion.">Vpu enhances HIV-1 virus release in the absence of Bst-2 cell surface down-modulation and intracellular depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2868-2873 (2009).</li><li>McNatt, M. W., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpu+binds+directly+to+tetherin+and+displaces+it+from+nascent+virions.">Vpu binds directly to tetherin and displaces it from nascent virions.</a> PLoS pathogens. 9, e1003299 (2013).</li><li>Manel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryptic+sensor+for+HIV-1+activates+antiviral+innate+immunity+in+dendritic+cells.">A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells.</a> Nature. 467, 214-217 (2010).</li><li>Yan, N., Regalado-Magdos, A. D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M. A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytosolic+exonuclease+TREX1+inhibits+the+innate+immune+response+to+human+immunodeficiency+virus+type+1.">The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to human immunodeficiency virus type 1.</a> Nature immunology. 11, 1005-1013 (2010).</li><li>Fonteneau, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+activates+plasmacytoid+dendritic+cells+and+concomitantly+induces+the+bystander+maturation+of+myeloid+dendritic+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells.</a> Journal of virology. 78, 5223-5232 (2004).</li><li>Ankel, H., Capobianchi, M. R., Frezza, F., Castilletti, C., Dianzani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+induction+by+HIV-1-infected+cells:+a+possible+role+of+sulfatides+or+related+glycolipids.">Interferon induction by HIV-1-infected cells: a possible role of sulfatides or related glycolipids.</a> Virology. 221, 113-119 (1996).</li><li>Schmidt, B., Ashlock, B. M., Foster, H., Fujimura, S. H., Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-infected+cells+are+major+inducers+of+plasmacytoid+dendritic+cell+interferon+production,+maturation,+and+migration.">HIV-infected cells are major inducers of plasmacytoid dendritic cell interferon production, maturation, and migration.</a> Virology. 343, 256-266 (2005).</li><li>Bego, M. G., Dube, M., Mercier, J., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+calcium-modulating+cyclophilin+ligand+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+particle+release+and+cell+surface+expression+of+tetherin.">Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of tetherin.</a> Journal of virology. 83, 13032-13036 (2009).</li><li>Grouard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+plasmacytoid+T+cells+develop+into+dendritic+cells+with+interleukin+(IL)-3+and+CD40-ligand.">The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand.</a> The Journal of experimental medicine. 185, 1101-1111 (1997).</li><li>Fitzgerald-Bocarsly, P., Jacobs, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+HIV+infection:+striking+a+delicate+balance.">Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection: striking a delicate balance.</a> Journal of leukocyte biology. 87, 609-620 (2010).</li><li>Bego MG, ., C&#244;t&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;., Aschman, N., Mercier, J., Weissenhorn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohen+&#201;A.+Exploits+the+Cross-Talk+between+BST2+and+the+ILT7+Receptor+to+Suppress+Anti-HIV-1+Responses+by+Plasmacytoid+Dendritic+Cells.">Cohen &#201;A. Exploits the Cross-Talk between BST2 and the ILT7 Receptor to Suppress Anti-HIV-1 Responses by Plasmacytoid Dendritic Cells.</a> PLoS Pathog. 11 (7), e1005024 (2015).</li></ol>

Burada anlatılan protokollerin son raporunda 18 de tarif edildiği gibi, grafik işlemcisinden ifade etme kabiliyetleri bakımından farklılık GFP etiketli HIV-1 virüs ile enfekte olmuş T hücrelerinin algılama ölçer. Bununla birlikte, bu yöntemler, kolayca potansiyel doğuştan gelen algılamayı ayarlayabileceğini diğer viral genleri eksik olan etiketlenmemiş virüsleri gibi virüslerden algılanmasını incelemek için modifiye edilebilir. GFP ifade yoktur kullanılan virüsler, enfekte hedef hücre yüzdesi p24 (kapsid) halinde, hücre içi boyama-kültür co ve sitometrisi veya p24 ELISA ile akış önce başka bir şekilde tespit edilmelidir. Bundan başka, bu protokoller mevcut hücre hatları ve primer çeşitli hücreler de dahil olmak üzere çeşitli hedef T hücreleri, birlikte kullanılabilir. HIV-1 algılama çalışma için kullanılan ilk yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu metin içinde tarif edilen yöntemler bir dizi avantaj vardır. Birinci ve en önemlisi, bu gruplar bir dizi hücre içermeyen, HIV-1 p tarafından kurulmuşturMakaleleri tip-I IFN 2,13,14 kötü indükleyicileridir. Ayrıca, erken çalışmalarda üretilen tip-I IFN miktarını ölçmek için eski IFNa ELISA tabanlı yöntemler dayanıyordu. Bu algılama tekniğinin bir sınırlama IFNa&#39;nın ve IFNβ diğer tip bakan iken eski IFNa ELISA kitleri çoğu sadece, IFNa&#39;nın bir tür ölçmek olmasıdır. Tarif edilen raportör hücre çizgilerinin kullanımı aynı anda ölçülebilir insan tip I IFN&#39;lerin tüm biyoaktif formları konsantrasyonu olarak, bu sınırlama üstesinden gelmektedir. Tekniği IFN ELISA kitinin yeni nesil daha ve tip-I IFN büyük miktarlarda kolayca tespit edilebilir birçok bağışçılar için daha ucuz, son derece duyarlıdır. Bununla birlikte, bu protokol kolayca ELISA gibi diğer tip I IFN Okuması yöntemlerle kullanım için adapte edilebilir. Kritik adımlar: Tüm hücresel bileşenleri (hedefler ve etkileyiciler ikisi) kalitesi sıkı kontrol edilmesi önemlidir. Potansiyel kirlenme bile asymptomatic, izlenmesi ve kontrol edilmesi gerekmektedir. Daha önce de belirtildiği gibi, asemptomatik bakteriyel kontaminasyonu antibiyotik kontrol ve mikoplazma gibi potansiyel olarak diğer hücre içi patojenler, HIV-1 enfeksiyonu, tip I IFN yani üretim sonrası görülen benzeyen bağışıklık karşılıklarını üretir. Ayrıca, tüm reaktifler LPS veya diğer olası endotoksinlerin serbest olması gerekir. İnsan örnekler sıklıkla normal algılama etkileyebilir yatan devam eden enfeksiyonlar ile astarlanabilir yana Benzer şekilde, PBMC&#39;ler ve pDC&#39;lerde izlenmesi önemlidir. Her zaman, önerilen negatif kontroller, sözde-enfekte edilmiş hücreler ile bu hedef hücrelerin yokluğu gibi ortak kültürler de dahil olmak üzere önerilir. Enfekte olmuş hücrelerin canlılığı, aynı zamanda, tip-I IFN apoptotik hücrelerin 2,14 sahip ortak-kültür, aşağıdaki üretilmediği yana doğru pDC algılamak için önemlidir. Tekniğin önemli bir sınırlama, taze izole edilmiş primer hücrelerde ihtiyacıdır. Bu prosedür değildiya da önceden doldurulmuş ya da kültür içinde tutuldu PBMC&#39;ler veya PDC kullanılarak test edilmiştir. PBMC izole emek yoğun bir iştir ve bu hücreler çok sınırlı bir ömrü vardır. Insan kanı ile çalışırken Ayrıca, kan yoluyla bulaşan patojene karşı korumak için, standart protokoller kullanılmalıdır. Taze izole insan hücreleri içeren çalışmaları ile ilgili değişkenlik çeşitli kaynaklar genellikle vardır. Aralarında donör-to-donörden karşılaşılan bu hücreleri izole etmek için uygulanan farklı yöntemler ve kalıtsal değişkenlik vardır. O vericinin arasında değişkenlik kaçınmak mümkün olsa da, bu tür TLR7 ve TLR9 yolların bilinen agonistleri yanıt ölçüm olarak öne pozitif kontroller, kullanımı, bu deneyler için önemli bir iç kontrol sağlayacaktır. Bir yanıt TLR7 yolu HIV-1 3 karşı uygun bir cevap için gerekli olan süre TLR9 yolunun agonistleri için sağlam bir yanıt sağlıklı pDC yanıt ile ilişkili gözlemlenmiştir. 2 dayanarak ss = &quot;jove_content&quot;&gt;. Deneysel tasarım gerektiriyorsa hücreler seçim sürecinin ardından antikorun serbest kalması Ancak, negatif seleksiyon (belirli pDC yüzey belirteçlerinin tükenmesi gereken bağlamda örneğin), pozitif seçimi üzerinde tercih edilir. İzole PDC kültürde hızlı bir şekilde apoptoza girerler. Bu hücreleri gerektiren deneyler zaman uzun süre boyunca kültüre olması için, kültür ortamı, IL-3 ile takviye edilebilir. Bu sitokin pDC proliferasyon ve apoptozu 16 inhibe eder. Bu pDC olgunlaşma veya farklılaşmasına yol açabilir Bununla birlikte, IL-3, kullanım sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerekmektedir. Burada anlatılan yöntem doğuştan algılama sırasında yer alan ilk adımları yeniden amacıyla taze izole edilmiş PBMC&#39;ler veya pDC&#39;lerde hedef HIV-1 ile enfekte hücreleri birleştirir. Bu yöntem, kuşkusuz explor faydalı olacaktırHIV enfeksiyonu ile ilgili e erken doğuştan gelen bağışıklık olaylar. Ilgili protokolleri tip I IFN ölçmeye yönelik olmasına rağmen, bunlar, enfeksiyonlu hücrelerde tanınması üzerine pDC&#39;lerde salınan diğer biyoaktif molekülleri ölçmek için modifiye edilebilir. Bunlar: tip-III IFN (IFN-λ) ve kemokinler CXCL10, CCL4 ve CCL5 17 (örneğin, TNF-a ve IL-6 gibi) pro-enflamatuar sitokinler.

Tip-I IFN-üreten PDC viral enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattını temsil ve gibi doğal ve kazanılmış bağışıklık 1 arasında hayati bir bağ olarak hizmet vermektedir. Hücre içermeyen, HIV-1, bahsedilen parçacıkların zayıf doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından tespit edilir ise, HIV-1 ile enfekte olan CD4 + T hücrelerinin etkili bir pDC&#39;lerde 2 tarafından algılanır. Sensör mekanizması daha sonra pDC virüs yakalama ve içselleştirme izlemektedir pDC, enfekte T hücresi ve CD4 moleküllerin yüzeyinde viral zarf glikoproteininin (gp120) arasında, bir ilk temas gerektirmektedir. TLR7 tarafından aktarılan HIV-1 RNA müteakip tanıma MyD88 / IRF7 yolağının aktivasyonunu tetikleyen ve sonuçta IFN üretimi 3-I tip yol açar. Önemli olarak, TLR9 aracılık pDC&#39;lerde mevcut ikinci algılama yol, pDC-özel yüzey işaretleyicisi olabilir BDCA2 4, viral glikoprotein gp120 etkileşimi ile engellenir. 5 olarak adlandırılan diğer bir pDC-spesifik yüzey önleyici reseptörü ile (aynı zamanda, tetherinin veya CD317 adlandırılır) BST2 geçmesi ile modüle edilebilir. BST2 pDC&#39;lerde ve bazı kanser hücrelerinin yüzeyinde yüksek seviyelerde ifade ancak, B hücreleri, makrofajlar ve T hücreleri gibi diğer hücre tiplerinde nispeten daha düşük seviyelerde olduğu. Önemli olarak, BST2 dönüştürülmüş hücre hatları, bir dizi ve ayrıca insan ve kemirgen kökenli 6 primer hücre kültürlerinde tip I IFN ile uyarılan edilebilir. Yanı sıra, bağışıklık düzenleyici işlevi, BST2 son HIV-1 salınımını inhibe ettiği bulundu ve diğer enfekte hücre yüzeyi 7 üzerinde çapraz bağlama oluşmakta olan virüs partikülleri tarafından viral partikülleri kapladı. HIV-1 durumunda, virüs kodlu yardımcı protein U (Vpu) bir BST2 antagonisti olarak hareket gösterilmiştir. Bu Vpu, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrenin hücre yüzeyinden ipten site BST2 aşağı doğru düzenleyen inanılmaktadıraktivite ile, bu kavramı 8,9 meydan olmasına rağmen, bir sonuç olarak, viral tahliyesini artırır ve 7 yayıldı. Vpu, çok sayıda yokluğunda tam olarak oluşmuş ve olgun projeni, HIV-1 partikülleri hücre yüzeyinde tutulur. Bu gergin parçacıklar bağışıklık algılama etkili hedefler temsil edebilecek olsun hala açık bir soru kalır. Buna ek olarak, bu Vpu Yüzeye BST2 seviyeleri modüle ederek pDC&#39;lerde gelen tip I IFN üretimi disregüle olabilir olup olmadığı açık değildir. HIV-1 algılama değerlendirmek için tasarlanmış İlk çalışmalar, genellikle tip I IFN 3,10-12 zayıf indükleyicileri olarak kabul edilir hücre içermeyen, HIV-1 parçacıkları kullanılarak yapıldı. Son çalışmalar PBMC&#39;ler ve PDC verimli HIV ile enfekte CD4 + T limfositleri 2,13,14 anlamda olduğunu göstermektedir göz önüne alındığında, burada in vitro olarak HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerin tanınması üzerine pDC&#39;lerde ile tetiklenen doğal tepkilerini ölçmek için basit bir yöntem tarif eder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="652">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">MT4 cells</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">120</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-Blu IFN-&#945;/&#946; reporter cells </td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">HKB-IFNAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">RPMI</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">FBS</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Ficoll-P&#226;que Plus</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CD4+ T cell isolation kit II</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-091-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II </td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-097-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">PHA-L</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">O2769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">Human rIL-2</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">136</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Imiquimod</td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">TLRL-IMQS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ODN 2216 CpG-A</td>
			<td style="width:87px;">Hycult Biotec</td>
			<td style="width:103px;">HC4037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Human IFN&#945;</td>
			<td style="width:87px;">PBL Interferon source</td>
			<td style="width:103px;">11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QUANTI-Blue </td>
			<td style="width:87px;">Cedarlane</td>
			<td style="width:103px;">REP-QB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Flow cytometry (Antibodies/reagents)</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Fc blocking solution (composition below):</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td style="width:260px;">Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Goat serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">G 9023</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Rabbit serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">R 9133</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Mouse serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M 5909</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">2.5 mg/ml human IgG</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">I 4506</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD3_Pacific Blue</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">anti-CD14_PE-TxRed</td>
			<td style="width:87px;">Life Technologie</td>
			<td style="width:103px;">MHCD1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BDCA2_APC</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-090-905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-ILT7_PE</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">326408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD4_PerCP/Cy5.5</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">317427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BST2_Alexa 660</td>
			<td style="width:87px;">eBioscience</td>
			<td style="width:103px;">50-3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Paraformaldehyde </td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">P 6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:87px;">BD Falcon </td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyan ADP instrument </td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:103px;">CY20030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the innate sensing of hiv-1 infected cd4+ t cells by plasmacytoid dendritic cells using an ex vivo co-culture system.

HIV-1 doğuştan gelen algılama plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ile enfekte CD4 + T hücrelerinin doğrudan temas olmasını gerektirmektedir. Bu işlemi incelemek için, burada açıklanan protokoller T hücre (MT4) ya da heterolog olan primer CD4 + T hücrelerinde ya enfeksiyonları algılamak için taze yalıtılmış insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ya da plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) kullanın. Uygun algılama sağlamak amacıyla, PBMC, kan toplama ve kullanılan enfekte T hücrelerinin optimal yüzdesi hemen sonra izole edilir esastır. Bundan başka, çok-parametrik akış sitometrik boyama PBMC örnekleri, fizyolojik oranda farklı hücre soyları içeren teyit etmek için kullanılabilir. Kontrollerin bir dizi de canlılığı ve pDC&#39;lerde işlevselliğini değerlendirebilmek için dahil edilebilir. Bunlar Toll benzeri reseptörler bilinen agonist (TLR) yolları, hücresel yanıtları değerlendirmek ve Spon eksikliğini teyit, özel yüzey belirteçlerinin varlığı,Spontan tip-I interferon (IFN) üretimi. Bu sistemde, yeni izole edilmiş PBMC&#39;ler veya PDC 18-22 st için 96 yuvalı plakalar içinde, HIV-1 ile enfekte hücreler ile birlikte kültürlenmiştir. Bu ko-kültürlerinden alınan üst sıvılar, sonra HEK-Blue IFN-α / β hücrelerinde ISGF3 yolundaki aktivasyonu izleyerek biyoaktif tip I IFN&#39;lerin düzeylerini belirlemek için kullanılır. Önceki ve ko-kültür koşulları sırasında hedef hücreler enfekte olmuş hücrelerin yüzdesi, spesifik yüzey markerlerinin düzeyi ve enfekte olmuş hücrelerin ayırıcı öldürülmesi de dahil olmak üzere bir dizi parametre belirlemek için flow sitometri yöntemi tabi tutulabilir. Bu protokoller başlangıçta tip-I IFN üretimini takip etmesi için geliştirilmiştir rağmen, potansiyel pDC&#39;lerde salınan diğer bağışıklık refleksinin-modülatör moleküllerini incelemek ve HIV-1 doğuştan algılama düzenleyen moleküler mekanizmaları içine daha fazla fikir edinmek için kullanılabilir.

Şekil 1 &#39;de tarif edilen ko-kültür sistemi, HIV-1 doğuştan gelen algılama kontrol edilen bir çalışma sağlar. Primer hücre değişken doğası nedeniyle, myeloid ve T hücreleri (sırasıyla CD14 + ve CD3 +) normal oranları örneğin Şekil 2A&#39;da gösterilen örnekte olduğu gibi, görülmektedir ki önemlidir. Bundan başka, (non-aktive edilmiş T hücreleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek FS ve daha yüksek seviyelerinin, CD3), aktive edilmiş T hücrelerinin sadece düşük sayıda taze izole edilmiş PBMC&#39;ler kültürlerinde tercih edilir. Çeşitli hücre tipleri arasındaki anormal oranları PBMC devam etmekte olan bir enfeksiyonun bir sonucu olarak, aktif bir fenotipe genellikle in vitro, muhtemelen uygun bir doğuştan gelen bağışıklık karşılığının ortaya çıkartılma mümkün değildir. En önemlisi, pDC&#39;lerde nispi yüzdesi, Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu oran 0.2 ila% 1.2 arasında değişir, ancak, anormal algılama fenotipi extre hem görülmektedirBu aralığın mes. Şekil 2B (92 ve% 72%) olarak iki örneklerde görüldüğü gibi negatif seçimi kullanarak pDC&#39;lerde zenginleştirilmesi, genellikle% 50-95 pDC saflıkta elde edilir. Genel deney için bir prototip örneği, Şekiller 3 ve 4 &#39;de gösterilmiştir. Bu örnekte, MT4 hücreleri ko-kültür (Şekil 3A) zamanında 30% enfeksiyon elde etmek için pNL4.3-GFP_ires_Nef WT veya delta Vpu ile enfekte edilmiştir. Daha önce açıklandığı gibi, yalnızca WT virüsü enfeksiyonları yüzey BST2 önemli bir aşağı doğru düzenlenmesi (Şekil 3B) ile sonuçlanmıştır. Nedeniyle boyut ve ayrıntı onların farklılıklarına, MT4 hücreleri akış sitometri (Şekil 4A) tarafından PBMC&#39;lerden kolaylıkla ayırt edilebilir. Ko-kültür inkübasyondan sonra, tip-I IFN (Şekil 4B), HIV-1 ile enfekte edilmiş hücreleri, serbest önemli miktarda temas bilinen TLR7 veya TLR9 agonist ve PBMC ile temas halinde, sadece PBMC&#39;ler. Resim IFN PBMC ko-cu, yalnız olarak ölçülerek saptandısahte-enfeksiyonlu MT4 hücreleri ile ltured, ya da tek başına enfeksiyonuna maruz MT4 hücreleri (Şekil 4B). Burada verilen örnekte, PBMC&#39;ler tarafından HIV-1 ile enfekte MT4 hücrelerinin doğal algılama anlamlı Vpu varlığında indirgenebilir bulunmuştur. <img alt="Figür 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> Şekil 1:. Deneysel tasarım şematik bakış SUP: süpernatant <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">büyük resim görüntülemek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> Şekil 2: Taze izole edilmiş PBMC&#39;ler ve ENR fenotipik nitelendirilmesiiched PDC (A). miyeloid hücreler ve sağlıklı bir vericiden izole PBMC&#39;ler gözlenen T hücrelerinin normal dağılım (miyeloid hücrelerin yüzdesi% 55-65 ila% 10-20 T-hücreleri arasında olmalıdır). PBMC&#39;leri örnek yüzey CD14 (miyeloid soy işaretleyici) ve CD3 (T hücre işaretleyici) tanımak fluorofor-konjuge antikorlar kullanılarak boyandı. (B) pDC&#39;lerde fenotipik karakterizasyonu. Zenginleştirme pDC&#39;lerde önce PBMC&#39;ler içindeki hücrelerin toplam sayısı (gösterilen örnekte% 0.99) arasında 0,2-1,2% arasında temsil etmektedir. Bu hücreler, hücre yüzeyinde mevcut gibi BDCA2 ve ILT7 gibi özel belirteçler, ekspresyonu göre tespit edilebilir. Negatif seçim önemli ölçüde pDC&#39;lerde sayısını ettirecek ve CD14 + miyeloid hücrelerin (zenginleştirme gösterilen iki örnek 92 ve% 72,% ulaşan) gibi potansiyel olarak zararlı kirletmesini ortadan kaldırmak için kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">Cli</a>Daha büyük resmi görmek için buraya ck. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> Şekil 3:. PNL4.3-GFP_ires_Nef WT veya dVpu ile enfekte MT4 kültürleri içinde enfekte hücrelerin HIV-1 ile enfekte edilmiş hedef MT4 hücrelerinin Karakterizasyonu (A) yüzde GFP pozitif hücrelerin yüzdesi ile belirlenmiştir. Enfekte olmuş hücreler (B) BST2 hücre yüzey ifadesi yüzeyi boyama sonra değerlendirilmiştir. Gri dolu histogramlar Bağışıklık öncesi tavşan serumu (lekesiz kontrol) ile boyandı sözde-enfekte edilmiş hücreler temsil eder; Kalan histogramlar, anti-BST2 poliklonal tavşan serumu ile boyanan hücrelerin temsil etmektedir. Katı hatları ile Histogramlar kontrol GFP negatif (neg) hücreleri temsil eder; noktalı çizgiler ile histogram enfekte GFP pozitif (pos) hücrelere karşılık ise. Grip ortalamaorescence yoğunluğu (MFI) değerleri, her bir örnek için belirtilmiştir. Flow sitometri Şekil 2&#39;de açıklandığı gibi yapılır ve analiz edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görmek için tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> Şekil 4:. Taze izole edilmiş PBMC&#39;ler ve enfeksiyonuna maruz MT4 T hücrelerinin ko-kültür PBMC&#39;ler ve MT4 T hücreleri arasında, tek başına MT4 T hücreleri için de gözlenmiştir FS / SS profilleri tek başına PBMC&#39;ler, ya da ko-kültürler akış sitometrisi (A) karşılaştırması. Boyut ve taneciklilik bakımından farklılıklar nedeniyle, MT4 T ​​hücreleri akış sitometrisi ile ko-kültürlerde PBMC&#39;lerden kolaylıkla ayırt edilebilir. (B) TLR PBMC&#39;lerin uyarılmasından sonra serbest tip I IFN miktarının Örnek Örnek7 ya da TLR9 agonisti (önce) veya yalancı veya pNL4.3-GFP_ires_Nef WT veya dVpu ile enfekte belirtilen MT4 hücreleri ile birlikte-kültürler sonra. Ham veri OD olarak 650 değerleri gösterilir ve bunlara karşılık gelen converseion. / Ml U ifade IFN konsantrasyonunu-ı yazın <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">büyük resim görüntülemek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System. at JoVE.com

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Hücre içermeyen HİV-1 parçacıklarına farklı olarak, enfekte olmuş CD4 + T hücrelerinin etkili bir plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ile algılanır. Bu yazıda tip I IFN serbest bırakılması ile değerlendirilen periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ya da izole edilmiş bir PDC pDC&#39;lerde ile doğuştan gelen algılamayı değerlendirmek için, HIV-1 ile enfekte edilmiş T hücreleri ile birlikte-kültür, bir yöntem tarif eder.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

assessing-innate-sensing-hiv-1-infected-cd4-t-cells-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

8.6K Görüntüleme.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM).  Hücre içermeyen HİV-1 parçacıklarına farklı olarak, enfekte olmuş CD4 + T hücrelerinin etkili bir plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ile algılanır. Bu yazıda tip I IFN serbest bırakılması ile değerlendirilen periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ya da izole edilmiş bir PDC pDC'lerde ile doğuştan gelen algılamayı değerlendirmek için, HIV-1 ile enfekte edilmiş T hücreleri ile birlikte-kültür, bir yöntem tarif eder. 

Video: Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

HIV-1 enfekte olmuş hücrelerden eksozom SILAC Bazlı proteomik Karakterizasyon

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...