Bu çalışma BT Hayvan ve Kuş Bilimleri Bölümü fonları tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri USDA Hayvan Bakım ve Kullanım Kılavuzu uyarınca Beltsville&#39;daki Bölgesi Hayvan Bakım ve Kullanım Comittees (BAACUC 11-015) tarafından onaylanmıştır. 1.. Anestezi ve Analjezi (Cerrahi Prosedürleri İkisi için ortak) <ol><li> Fare tartılır ve 27 G iğne ile iki 1 ml şırınga aşağıdaki anestezik ve analjezik yük: <ol><li> Ketamin (0.1 mg / g: 0.01 ml / a 10 mg / ml çözelti g) ve ksilazin (0.01 mg / g: 2 mg / ml çözeltisi 0.005 ml / g). </li><li> Buprenorfin (0.1 ug / g: bir 0.01 mg / ml çözeltisi 0.01 mi) eklenmiştir. </li></ol></li><li> Başparmak ve işaret parmakları ile mümkün olduğunca çenelerine kadar yakın da boyun ense toplayıp, küçük ve yüzük parmakları arasında kuyruk tutarak fare hareketsiz. </li><li> Intraperitoneal ketamin-Xylazine karışımı enjekte edilir. Iç organları delinmesiyle önlemek için, fareyi tutunhafifçe kalça seviyesinin altındaki merkez (Şekil 1A) </li><li> Başparmak ve işaret parmakları (Şekil 1B) arasındaki boyun beklemeye ense Buprenorphine subkutan enjekte edilir. </li><li> Sıcak bir sahnede kafes (temiz ve başka bir hayvan olmadan) fareyi bırakın. </li><li> Bilinçsiz bir kez, (ayak tutam tarafından kontrol) arka ayak refleksinin olmaması için kontrol edin. Göz kuruluğu önlemek için ve palpebral refleks (Şekil 1C) yokluğunda kontrol etmek için göz merhemi sürün. </li><li> Bu protokol, aşağıda tarif edilen prosedürleri gerçekleştirmek için yeterli, 30 dakika içinde en az bir cerrahi anestezi düzlemi içerir (Protokoller 2 ve 3). Daha uzun süreler gerekirse, 1.1.1 &#39;de tarif edilen dozajın yarısı ketamin + ksilazin enjeksiyonu ek 30 dakika sonra uygulanabilir. Daha hızlı ve düzensiz bir desen için, solunum bir değişiklik gösterir loUygun anestezi düzleminin ss. </li></ol> 2. Meni kanalı ameliyatı <ol><li> Kanıtlanmış bir çiftleşme performans ile bir erkek kullanın. </li><li> , Cerrahi aletlerin sterilize ameliyatı yapılacak yüzeyleri temizlemek ve% 70 etanol ile silin. </li><li> Önceden reflekslerin kaybı için kontrol, (Protokol 1) ayrıntılı olarak anestezi gerçekleştirin. </li><li> Kaldırmak, sıcak bir sahnede fare yerleştirin iki hayali enine çizgi arasındaki ventral alanından elektrik kesme makineleri ile kürk 0.5 cm ve penis üzerinde 2.5 cm (Şekil 2A) yerleştirildi. </li><li> % 10 povidon iyot ve% 70 etanol ile sıralı silinerek traş alanı sterilize. </li><li> Traş bölgesini açıkta bir delik steril bir havlu ile cerrah ve kapağına doğru kuyruğu ile yatar pozisyonda fare yerleştirin. Cerrahi alanını aydınlatır. </li><li> 10-15 mm boyuna cilt incisio gerçekleştirinn, yaklaşık 1 cm penis üzerinde karın, medial tutulmaktadır. Dişli forseps pansuman ve sonra, (Şekil 2A ve 2B) makasla kesme ile cilt tutun. </li><li> Linea alba, 5-10 mm boyuna kesi yapmak. Tırtıklı forseps Microdissecting ile kas tutun ve makas (Şekil 2C) ile kesti. </li><li> Tırtıklı diseksiyon forseps ile mikro bir tarafta testis yağ pedi kapmak ve testis maruz çekin, vaz deferens ve epididimis. Vas deferens testis medial bulunan ve bu gibi testis duvara bağlı değil açıkça ayırt ücretsiz tüp (bir Bir kan damarı, bir tarafta (Şekil 2D) birlikte çalışan epididimis). </li><li> Onlar kırmızı açmak kadar mikro diseksiyon tırtıklı forseps, alev soyunma forseps ile vas deferens Holding (Şekil 2E </st)&gt; Rong, ve sonra (Şekil 2F) aynı anda iki noktada vaz deferens kesmek ve dağlamak için bunları kullanın. Kesilen yaklaşık 5 mm bir bölümünün ayrılması ve iki net bir şekilde ayrı dağlanmış uçları (Şekil 2G) geride bırakmak gerekir. </li><li> Geri karın boşluğuna testis, epididim ve vas deferens taşıyın. </li><li> Diğer testis adım 9 geçin. </li><li> 5/0 emilebilir sütür (Şekil 2H) ile yapılan bir ya da iki yatay yatak dikiş ile kas dikin. </li><li> Bir ya da iki yara kesme makineleri (Şekil 2I) ile cildi dikin. </li><li> , Vasectomised erkek (kulak yüzük, parmak dövme ...) tanımak bir sıcak sahnede yerleştirilen kafes taşımak ve anestezi kurtarır kadar gözlemlemek (bilinçli ve sternum yatma korumak). Sıcak bir tuzlu su çözeltisinden 0.5-1 ml deri altı enjeksiyon yeniden artırırPasa. , Vazektomi aktarımı sırasında meydana gelen olası olaylar kaydedin içme suyuna antibiyotik ekleyin. </li><li> Yara klipleri 10 gün bir yara kesme çıkarıcı ya da diş forseps bir çift ile vazektomi sonrası kaldırılabilir. Vazektomize erkek ameliyattan 2 hafta sonra çiftleşmeye hazır olacaktır. </li><li> Alıcıları elde etmek için kullanmadan önce bereketli dişilerle çiftleşme tarafından vazektomize erkek infertilite sınayın. </li></ol> 3. Utero-tubal Embriyo Transferi <ol><li> Fare morulları veya blastosistleri 2.5 DPC bir yalancı alıcı kadın için bu teknikle transfer edilebilir. </li><li> Embriyo manipülasyon cam pipet hazırlayın: <ol><li> Pipet tutucu zarar görmesini önlemek amacıyla cam kılcal damarların ipuçlarını parlatın. </li><li> Hafifçe dönerken iyi bir alev ile ısıtılarak cam kılcal bir orta parça yumuşatıreşzamanlı iki elinizle kılcal. Kılcal bölüm yumuşak ve (açık kırmızı renkli) dövülebilir olduktan sonra, alevden hızla çekilme ve 130-150 um dış çapını daraltmak için iki ucunu çekin. </li><li> Cam soğuması ve sonra hafifçe bir elmas nokta kalem, aşındırıcı taş veya tırnak törpüsü ile dar kısmını puanlama ve her iki taraftan çekerek onu kesmek için bekleyin. Mola temiz ve dik olmalıdır </li></ol></li><li> Bir 100-130 mikron diyafram bırakarak, çok hızlı yanan tarafından ucu parlatın. Pipetler daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. </li><li> Sıcak embriyo manipülasyon medya (CZBH veya M2, tartışmaya bakınız). </li><li> , Cerrahi aletlerin sterilize ameliyatı yapılacak yüzeyleri temizlemek ve% 70 etanol ile silin. </li><li> Önceden reflekslerin kaybı için kontrol, (Protokol 1) ayrıntılı olarak anestezi gerçekleştirin. </li><li> T tutulmasıO sıcak bir sahnede fare, diz ve distal kaburga (Şekil 3A ve 3B) arasındaki sırt bölgesinde elektrik kesme makineleri ile kürk çıkarın. </li><li> % 10 povidon iyot ve% 70 etanol ile sıralı silinerek traş alanı sterilize. </li><li> Prewarmed embriyo manipülasyon medya inkübatör embriyolar taşıyın. </li><li> Stereomicroscope altında sıcak bir aşamaya alıcıyı taşımak ve (başını sağa veya cerrahın sol tarafına bakan) cerraha yanal yüzükoyun pozisyonda yerleştirin. </li><li> Traş bölgesini açıkta bir deliği olan bir steril havluyla alanı kapsayacak ve cerrahi alanını aydınlatır. </li><li> Son kaburga ile kalça ve arka ve karın (Şekiller 3A, arasındaki hattın dorsal ⅓ arasındaki hattın kafatası ⅓ üzerinde bulunan bir nokta deride bir 1 cm enine (dikey) bir kesi yapınnd 3B). Tırtıklı forseps pansuman ile cildi tutun ve makas (Şekil 3C) ile kesti. </li><li> Cilt kesilmiş sonra, yumurtalık (kırmızı / turuncu) veya yumurtalık (beyaz) çevreleyen adipoz ped gövde duvarından görselleştirilebilir. Kesi herhangi bir büyük kan damarı kesmez bir nokta olarak yumurtalık ya da yağ pedi üzerinden gövde duvarında bir 0.3-0.5 cm enine (dikey) bir kesik yapın. Mikro diseksiyon dişli forseps ile kas tutun ve makas (Şekil 3D) ile kesti. </li><li> Onun baş cerrah doğru bakan olması için fareyi hareket ettirin. </li><li> Embriyo manipülasyon pipet (Şekil 3E) yükleyin: <ol><li> CZBH ortam daha geniş olan kısmı yaklaşık olarak 5 mm kadar manipülasyon pipet dar kısmı boyunca kapilarite ile yükselmeye izin verir. </li><li> Küçük bir hava kabarcığı (0.2-0.5 mm) kadar sürebilir. </li><li> Embriyolar (5-10) tanıtmakmedya az miktarda (2-4 mm). </li><li> Başka küçük bir hava kabarcığı (0.2-0.5 mm) ve medya küçük bir miktar (0.5-1 mm) kadar sürebilir. </li><li> Ağız aspiratör tutucu ya da adım 3.17 hazır elle çalıştırılan cihaza takılı cam pipet bırakın. </li></ol></li><li> Mikro diseksiyon dişli forseps ile yumurtalık çevreleyen yağ pedi tut ve yumurtalık, yumurta kanalının, ve karın boşluğundan dışarı üst rahim küçük bir bölümünü (Şekil 3F ve 3G) maruz fare kafasına doğru çekin. </li><li> Yumurta kanalının taşımak ve (yumurtalığa rahim karşılayan yani) utero-tubal kavşak maruz mikro diseksiyon tırtıklı forseps ile yağ pedi kapmak, kullanıma hazır, ağızda aspiratör ağız parçasını tutan. </li><li> Erişilebilir utero-tubal kavşak tutulması, (sağ elini ise) sol elinizle hafif kavisli mikro diseksiyon forseps almak ve hemen altına yerleştirmeko kısmı Yukarıda 2 mm hakkında yumurta kanalının kapma utero-tubal kavşak. </li><li> Hafif kavisli mikro diseksiyon forseps ile utero-tubal kavşak Holding, 27 G iğne (Şekil 3H) ile forseps yakın yumurtalığa bölümü delinme. </li><li> Utero-tubal kavşağı ile rahim iğne ve peşin ile yapılan deliğine embriyo manipülasyon pipet takın (3I ve 3J Şekiller). Pipet utero-tubal kavşak (Şekil 3K) geçtikten sonra kolayca kayar. Enkaz endometrial hasarı (en fazla 3 mm) ve pipet engelleme önlemek için rahim içine çok uzak ilerleme yok. </li><li> Yavaşça (Şekil 3L) üfleme ile rahim içine embriyo bırakın. Hem hava kabarcıkları rahim geçmelidir. İlk baloncuk yukarıdaki ortamın BazıAyrıca rahim içine salınan, ancak implantasyonu engelleyebilir gibi, daha fazla hava tanıtan önlemek olabilir. </li><li> Embriyolar rahim içine serbest bırakıldı hemen sonra pipet çıkarın. </li><li> Yumurta kanalının Taşı ve adipoz ped kapma geri karın boşluğuna yumurtalık. </li><li> 5/0 emilebilir sütür (Şekil 3M) ile yatay bir yatak dikiş ile kas dikin. </li><li> Bir yara makası (Şekil 3N) ile cildi dikin. </li><li> Gerekirse diğer tarafta aşama 10 devam edin. </li><li> , Alıcı (kulak halkası, parmak dövme ...) tanımlamak (sıcak sahnede yerleştirilen) kafesine taşımak ve anestezi kurtarır kadar gözlemlemek (bilinçli ve sternum yatma korumak). </li><li> Embriyo transferi sırasında meydana gelen olası olaylar açıklama ve içme suyuna antibiyotik ekleyin. Sıcak SalI bir 0.5-1 ml deri altı enjeksiyonne çözelti kurtarma geliştirir. </li><li> Yara klipleri 10 gün bir yara kesme çıkarıcı ya da forseps (Şekil 3O) iki çift embriyo transferi sonrası kaldırılabilir. Alıcı gebelik değerlendirmek ve yavruların sayısını tahmin etmek için o gün tartılır olabilir. 15 gün embriyo transferinden sonra alıcıya yavru malzeme sağlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effect+of+in+vitro+culture+of+mouse+embryos+with+serum+on+mRNA+expression+of+imprinting+genes,+development,+and+behavior.">Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).</li><li>Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glucose+concentration+during+in+vitro+culture+of+mouse+embryos+on+development+to+blastocyst,+success+of+embryo+transfer,+and+litter+sex+ratio.">Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio.</a> 79, 329-336 (2012).</li><li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+development+of+isolated+blastomers+of+mouse+eggs.">Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs.</a> Nature. 184, 1286-1287 (1959).</li><li>Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+mouse+eggs+in+vitro.">Fertilization of mouse eggs in vitro.</a> Nature. 220, 592-593 (1968).</li><li>McLaren, A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+development+and+birth+of+mice+cultivated+in+vitro+as+early+as+early+embryos.">Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos.</a> Nature. 182, 877-878 (1958).</li><li>McLaren, A., Michie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transfer+of+fertilized+mouse+eggs+to+uterine+foster-mothers.+I.+Factors+affecting+the+implantation+and+survival+of+native+and+transferred+eggs.">Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs.</a> J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).</li><li>Goto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+embryos+transferred+into+the+uterus.">The fate of embryos transferred into the uterus.</a> J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Chin, H. J., Wang, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utero-tubal+transfer+of+mouse+embryos.">Utero-tubal transfer of mouse embryos.</a> Genesis. 30, 77-81 (2001).</li><li>Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stem+cell+activation,+culture+media+of+manipulated+embryos,+and+site+of+embryo+transfer+in+the+production+of+F0+embryonic+stem+cell+mice.">Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice.</a> Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).</li><li>Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+abdominal+and+scrotal+approach+methods+of+vasectomy+and+the+influence+of+analgesic+treatment+in+laboratory+mice.">A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice.</a> Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).</li><li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Animal Anaesthesia. , (2009).</li><li>Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+with+various+anesthetics+in+mice+(pentobarbitone+ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate).">A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate).</a> Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).</li><li>Tarin, D., Sturdee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+anaesthesia+of+mice:+evaluation+of+tribromo-ethanol,+ether,+halothane+and+methoxyflurane+and+development+of+a+reliable+technique.">Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique.</a> Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).</li><li>Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+effects+of+tribromoethanol+as+used+in+the+production+of+transgenic+mice.">Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice.</a> Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).</li><li>Lieggi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+stored+and+newly+prepared+tribromoethanol+in+ICR+mice.">Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice.</a> Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).</li><li>Lieggi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+preparation+methods+and+storage+conditions+of+tribromoethanol.">An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol.</a> Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).</li><li>Meyer, R. E., Fish, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+tribromoethanol+anesthesia+for+production+of+genetically+engineered+mice+and+rats.">A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats.</a> Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).</li><li>Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+1-cell+embryos+from+different+strains+of+mice+in+CZB+medium.">Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium.</a> Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).</li><li>Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+hamster+oocytes+to+assay+the+fertilizing+capacity+of+human+spermatozoa.">Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa.</a> J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).</li><li>Dios Hourcade, d. e., Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A, B., Pintado, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+development+of+mice+morulae+after+storage+in+non-frozen+conditions.">In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Vazektomi büyük zorluklar içermeyen nispeten düz ileri bir cerrahi tekniktir. Povidon iyot ve etanol ile sterilize zaman periton tahriş olabilir (etanol) ile son yıkama, povidon iyot kaldırır emin olun. Vas deferens için erişimi de skrotum veya karın 8 bir çapraz kesi gerçekleştirerek elde edilebilir. Skrotal kesi nedeniyle gerekli nispeten daha küçük insizyon ve biraz daha iyi postoperatif davranış 11 abdominal kesi transversal tavsiye edilmiştir. Iki kez aynı vaz...

Embriyo transferi muhtemelen fare modelinde yapılan en sık cerrahi prosedürdür. Bu teknik, in vitro manipülasyon tekniklerine tabi embriyolardan yavrular elde etmek için gerekli olan ve bu nedenle, pro-nükleer enjeksiyon, transdüksiyon lentiviral ya da kimera formasyonu ile genetik olarak modifiye edilmiş modellerin geliştirilmesi için gerekli bir adım teşkil etmektedir. Bunun yanı sıra, teknik preimplantasyon gelişimi sırasında meydana gelen akıntılar çeşitli gelişimsel etkileri çalışma sağlar. Yapay üreme teknikleri 1 ya da farklı maddelerin veya metabolitlerinin 2 anormal konsantrasyonlara maruz kalma kullanılması implantasyon veya plasenta başarısızlıkları ve yavrular uzun vadeli etkileri sonucu embriyo gelişimini etkileyebilir. A, güvenilir ve tekrarlanabilir bir embriyo transfer tekniği tutarlı bir insanda emplantasyon ve fetus gelişimi üzerindeki deneysel tedavinin olası olumsuz etkilerini test etmek için çok önemlidirner. Mürin preimplantasyon embriyolar 0.5 gün sonrası coitum ve ampülleri (DPC) psödopregnant alıcıları (yumurtalığa transferi) 3,4 veya 2,5 DPC psödopregnant alıcının rahim içine (rahim transferi) 5,6 vasıtasıyla yumurta kanalına ya alıcı bir dişiye transfer edilebilir onların gelişim evresine bağlı. Embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök hücrelerin enjeksiyonu ile kimerik farelerin üretilmesi için kullanılanlar gibi blastosit aşamasında Embriyolar, genellikle rahim transferi ile aktarılır. Blastosistler, aynı zamanda bir 0,5 DPC alıcının tuba kanalından aktarılabilir, ancak embriyo implantasyonu gerçekleşmeden önce boşaltım kurtarmak için 2 gün diapause uğrar ve sahip olduğu için, gelişim bozucular için daha az fizyolojik testi oluşturmaktadır. Uterus Transfer rahim lümenine bir embriyo manipülasyon pipet erişim sağlayan bir açıklık oluşturmak için dar bir iğne ile delinmesi rahim duvarına içerir. Although bu tekniği iyi sonuçlar verebilir vadede hayatta kalma (yani bir yavru geliştirmek transfer edilen embriyo yüzdesi) genellikle düşük ve 7,8 önceden kestirilemez. Rahim duvarının delici bazı zararlı yan etkileri gerektirir. İlk olarak, oldukça yüksek oranda damarlanmış bir miyometriyum dokusu ve delinme genellikle küçük bir kanama ile sonuçlanır. Kan embriyo transfer pipet engellemek ya da embriyonik ölüm ve / veya implantasyon başarısızlığı neden uterus lümen istila edebilir. Kan hücreler ve döküntüler, blastomerlerin eklemek gibi zona olmayan embriyolar, aktarılır, bu özellikle önemlidir. Embriyoların aktarıldıktan sonra, İkinci olarak, gerçekleştirilen açılış mühür etmez, bu nedenle de menfezi içinden geri akabildiği için ve bir çok büyük hacimli rahim içine tanıtmak edildiğinde karın boşluğuna ihraç edilebilir. Açıklanan utero-tubal embriyo transfer Burada embr teslim utero-tubal kavşak yararlanmakrahim duvarına delinmesi ve böylece olumsuz etkileri 9 önleme gerek kalmadan rahim içine yolar. Embriyo transferi için kullanılan yalancı Alıcı dişiler erkeklerin vasektomize 8, doğal çiftleşme ile elde edilir. Steril erkek tarafından üretilen seminal salgıları embriyo transferi için açık olmak için rahim için gereklidir. Bir alıcı almak için, 6 aylıktan 8 hafta 2 kadın maksimum öğleden sonra bir vazektomize erkek ile yerleştirilir. Sonraki sabah, kadınlarda vajinal birleşme fiş, erkek seminal sıvıdan pıhtılaşmış protein bir yığın varlığı için kontrol edilir. Çiftleşme genellikle gece yarısı sırasında ortaya olarak, vajinal fiş algılama gün DPC 0.5 olarak kabul edilir. Vasektomize erkek bir satıcılardan satın alınabilir, ancak burada tarif edilen bir cerrahi prosedür nispeten kolaydır ve embriyo transferi için gerekli olan başka ilave bir araçları gerektirmez.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1234">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:232px;">Ketamine</td>
			<td style="width:111px;">VEDCO</td>
			<td style="width:203px;">Ketaved ANADA 200-257</td>
			<td style="width:691px;">To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:232px;">Xylazine</td>
			<td style="width:111px;">Lloyd laboratories</td>
			<td style="width:203px;">Anased NADA #139-236</td>
			<td style="width:691px;">To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:111px;">Generic</td>
			<td style="width:203px;">NDC 400-42-010-01</td>
			<td style="width:691px;">To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Eye ointment</td>
			<td style="width:111px;">Novartis</td>
			<td style="width:203px;">Genteal</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:232px;">Antibiotic</td>
			<td style="width:111px;">Pfizer</td>
			<td style="width:203px;">Clavamox NADA #55-101.</td>
			<td style="width:691px;">Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Dressing serrated forceps</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-8120</td>
			<td style="width:691px;">Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Micro dissecting serrated forceps</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-5137</td>
			<td style="width:691px;">These ones are curved at a 90&#186; angle. Straight forceps can be used if preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Slight curved micro dissection forceps</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-5136</td>
			<td style="width:691px;">This model is particularly useful to hold the oviduct.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Scissors</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-5880</td>
			<td style="width:691px;">Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">27G needles</td>
			<td style="width:111px;">Beckton-Dickinson</td>
			<td style="width:203px;">305136</td>
			<td style="width:691px;">Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:232px;">Clip applier</td>
			<td style="width:111px;">MiKRon</td>
			<td style="width:203px;">42763</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:232px;">9 mm Clips</td>
			<td style="width:111px;">MiKRon</td>
			<td style="width:203px;">427631</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Clip remover</td>
			<td style="width:111px;">MiKRon</td>
			<td style="width:203px;">7637</td>
			<td style="width:691px;">Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:232px;">Suture needle holder</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-7820</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Suture</td>
			<td style="width:111px;">Dowist Gell</td>
			<td style="width:203px;">5-0 Dexon S 7204-21</td>
			<td style="width:691px;">Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:232px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">100 ul calibrated pipettes 53432-921</td>
			<td style="width:691px;">It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:232px;">Burner</td>
			<td style="width:111px;">KISAG AG</td>
			<td style="width:203px;">Typ 2002</td>
			<td style="width:691px;">Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:232px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;">MZFLIII</td>
			<td style="width:691px;">This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Fiber optics ilumination</td>
			<td style="width:111px;">Dolan Jenner</td>
			<td style="width:203px;">Fiber lite</td>
			<td style="width:691px;">To iluminate the surgical area. There are different systems available.</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:232px;">Warm stages</td>
			<td style="width:111px;">American scope</td>
			<td style="width:203px;"><a href="https://exch.mail.umd.edu/owa/redir.aspx?C=1qTJKejamUSfudeYG_MlZHvTY3dsJM9Iaqr2SnwGD4ECWGzB8e8Rpg--_L7u0vJmyatXQJzGQ0k.&amp;URL=http%3a%2f%2fstore.amscope.com%2ftcs-100.html" target="_blank">http://store.amscope.com/tcs-100.html</a></td>
			<td style="width:691px;">These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Culture dishes for embryo manipulation</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td style="width:203px;">353001</td>
			<td style="width:691px;">351008 may be also used, they made narrower drops.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model

Bir taşıyıcı dişi preimplantasyon embriyo transferi epigenetik değişiklikler etkisi takip eden fetal gelişim ve yetişkin sağlığına preimplantasyon gelişimi sırasında kökenli incelemek için genetik olarak modifiye edilmiş fare veya üretimi için gerekli bir adımdır. Etkin ve tutarlı bir embriyo transfer tekniğin kullanılması, genetik olarak tadil edilmiş hayvanların üretimi artırmak ve emplantasyon oranlarının ve dönemde hayatta kalma farklı tedavilerin etkisini tespit etmek önemlidir. Blastokist aşamasında embriyolar genellikle embriyo manipülasyon pipet tanıtmak için rahim duvarında bir delinme performans, rahim transferi ile aktarılır. Pipet geri çekilmesinden sonra, rahim içinde gerçekleştirilen menfez kapatmaz ve bağlı rahim pozitif basınca karın boşluğuna embriyolar çıkış olabilir. Delinme de, implantasyon kanaması bozar üretmek blok transferi pipet ve embriyo d etkileyebilir olabilirzona olmayan embriyolar aktarılır özellikle evelopment. Sonuç olarak, bu teknik genellikle çok değişken ve genel düşük embriyo sağkalım oranları ile sonuçlanır. Bu olumsuz etkileri önledikleri, utero-tubal embriyo transferi, embriyo çıkışı engelleyen doğal bir engel olarak utero-tubal kavşak yararlanmak ve rahim duvarının delinmesi kaçının. Vasektomize erkek yalancı alıcıları elde etmek için gereklidir. Vazektomi gerçekleştirmek için bir teknik utero-tubal embriyo transferi bir tamamlayıcısı olarak tarif edilir.

Utero-tubal embriyo transferi rahim embriyo transferi 2,9,10 ilişkili komplikasyonlar bazı kaçınarak rahim embriyo transferi için bir olanak sağlar. Tablo 1 &#39;de, biz tarif edilen protokol takip CD1 alıcıya manipülasyonlar farklı tabi CD1 blastosist transfer edilen bazı temsili bir sonuç göstermektedir. Dönem (bir yavru elde embriyoların%) ya da (lentivirüs maruz durumunda) E15 hayatta kalma hayatta kalma zigot aşama (IVC) in vitro olarak kültürlenmiş embriyola...

Watch this Scientific Journal Video about Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model at JoVE.com

Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

Utero-Tüp embriyo transferi rahim transferinin gerçekleştirilmesi oluşabilecek embriyo akışını önlemek için bir bariyer olarak utero-tubal kavşak kullanır. Vasektomize erkek embriyo transferi için yalancı alıcıları almaları gerekmektedir. Her iki teknikler tartışılacaktır.

Fare Modelinde utero-tubal Embriyo Transferi ve Vazektomi

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects ...

utero-tubal-embryo-transfer-and-vasectomy-in-the-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

47.2K Görüntüleme.  United States Department of Agriculture.  Utero-Tüp embriyo transferi rahim transferinin gerçekleştirilmesi oluşabilecek embriyo akışını önlemek için bir bariyer olarak utero-tubal kavşak kullanır. Vasektomize erkek embriyo transferi için yalancı alıcıları almaları gerekmektedir. Her iki teknikler tartışılacaktır. 

Video: Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Fare Oosit içine Nükleer Transfer

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Biyoloji

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Yardımlı üreme için farelerde servikal manipülasyona bağlı yalancı gebelik

Inducing Pseudopregnancy in Female Mice Without the Need for Vasectomized Males Prior to Non-Surgical Embryo Transfer or Artificial Insemination

For successfully maintaining pregnancy with embryo transfer or artificial insemination,&#160;female recipient mice must be induced into a pseudopregnant state. Female mice are traditionally paired overnight with vasectomized males, and the following morning, the presence of a copulation plug is assessed. To increase the efficiency of producing pseudopregnant females, a cervical manipulation technique has been standardized to be used in combination with non-surgical embryo transfer or artificial insemination techniques in mice. The blunt end of a small plastic rod is inserted vaginally to contact the cervix and is vibrated for 30 s by contact with a trimmer. The procedure is quick and does not require anesthesia or analgesia. This technique increases the reliability and predictability of producing pseudopregnant females and entirely eliminates the requirement for vasectomized males. For CD1 mice, the efficiency of pseudopregnancy induction using cervical manipulation was 83% for females in estrus (N = 76) but only 38% of females in estrus were plugged by vasectomized males (N = 24). Artificial insemination in CD1 mice was performed by estrus synchronization with hormones, cervical manipulation, and the uterine transfer of sperm. Artificial insemination recipients receiving cervical manipulation (N = 76) had a pregnancy rate of 72% and an average litter size of 8.3 pups. This method can also be used to produce pseudopregnant females for non-surgical embryo transfer. Therefore, inducing pseudopregnancy by cervical manipulation is a convenient and efficient alternative to mating with a vasectomized male when performing non-surgical assisted reproduction techniques. Using cervical manipulation provides 3Rs (replacement, reduction, and refinement) benefits for assisted reproduction techniques by reducing the number of animals required and eliminating the necessity for surgically altered males.

Yazar Spot Işığı: Cerrahi Olmayan Embriyo Transferi veya Suni Tohumlamadan Önce Vazektomize Erkeklere İhtiyaç Duymadan Dişi Farelerde Yalancı Gebeliğin İndüklenmesi  

The cervical manipulation method presented can induce pseudopregnancy in mice without the need for breeding females with vasectomized males. The induction of pseudopregnancy is required for the success of non-surgical embryo transfer and non-surgical artificial insemination, both of which are also presented.

Cerrahi olmayan embriyo transferi veya suni tohumlamadan önce vazektomize erkeklere ihtiyaç duymadan dişi farelerde yalancı gebeliğin indüklenmesi

For successfully maintaining pregnancy with embryo transfer or artificial insemination,&#160;female recipient mice must be induced into a pseudopregnant ...