Yazarlar metodolojik eğitim ve tahlil rehberlik için Bay Richard Zink ve Todd Wiernicki kabul etmek istiyorum. Biz de dikkatli okuma ve editoryal önerileriniz için John Paul Spence teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık MH 060.397, Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı, ve Eli Lilly Enstitüsü ve Lilly Araştırma Ödülü Programı (LRAP) ile Şirket tarafından desteklenmiştir.

1.. Deneyi Hazır Hücreleri Genişleme ve Kryoprezervasyon <ol><li> Kültür CHO-K1-DRD 2L 1.0 uM L-glutamin, 800 ug / ml G418, 300 ug / ml higromisin, 100 U / ml ile takviye edilmiş Ham F12 ortamı içinde, 15 cm 2 hücre kültürü tabağına (CHO-D 2L) hücreleri penisilin, 100 / ml streptomisin ug ve% 10 fetal sığır serumu (FBS). </li><li> Hücreler% 90-95 konfluent olana kadar% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. 10 | il fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca hücre ayrışma tampon 3 ul ekleyerek hücreleri hasat Kültür ortamı 12 ul kullanarak hücrelerin tekrar süspansiyon ve tripan mavisi dışlama kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatan aspire ve dondurucu ortam içinde 5 ul (% 10 dimetil sülfoksit,% 90 F hücre pelletiniBS). Istenilen hücre konsantrasyonu (örneğin, 1-20 x 10 6 hücre / ml) elde etmek için hücre süspansiyonu seyreltin. </li><li> Her bir dondurarak saklama viali hücre çözeltisi alikosu 1.0 ul. -80 ° C sıcaklıkta gece boyunca bir hücre dondurma kapta cryovials inkübe edin. Uzun süreli depolama için bir sıvı N 2 tankına cryovials aktarın. </li></ol> 2. Deneyi Hazır Hücreleri (ve Ters Transfection Seçeneği) Kaplama <ol><li> Hızla 37 ° C su banyosu içinde hücreleri donmuş cryovial eritin. Hücreler çözündürüldü sonra, Opti-MEM 9 ul ihtiva eden bir 15 ul konik tüp hücreleri transferi ve boru 3-5x ters çevirerek karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Süpernatan aspire ve 1 ul Opti-MEM içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Hücre canlılığı belirlenmesi ve gerekirse (örneğin,. 3 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon) &#39;de canlı hücreler seyreltilmesi için mavi Tripan çıkışı ile hücre sayımıOpti-MEM. Plaka, bir doku kültürü hücre 10 ul / oyuk, çok kanallı pipet kullanarak 384-plaka işlemden geçirildi. </li><li> (Önerileri üretmektedir göre - Bölüm 7) hücreleri tarafından cAMP üretimi tahmin etmek için bir standart eğri oluşturmak için Opti-MEM içinde cAMP seri seyreltmeleri yapın. Plakaya 10 ul / çukur cAMP standartların ekleyin Not:. Tek bir standart eğri, deney plakalarının birinde ayrı bir levha ya da boş bir kuyu üzerinde hazırlanabilir. </li><li> Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 x g&#39;de santrifüj plaka ve 1 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 3. * SiRNA Transfection Seçeneği ters Bu bölümde Şekil 3&#39;e isteğe ve alakalı. <ol><li> RNase içermeyen GKD 2 O (örneğin, 0.4 pmol / ul) siRNA içinde bir çözeltisi hazırlandı. 384 oyuklu plakanın her bir gözeneğine 5 ul ekleyin ve 15 se boyunca 100 xg&#39;de plaka santrifüjOda sıcaklığında, c. </li><li> (Örneğin, Opti-MEM 1000 ul Lipofektamin 2000 6 ul ekle) ve aşağı ve yukarı pipetlenerek karıştırın 0,006 bir faktör ile Opti-MEM içinde Lipofectamine 2000 seyreltin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Lipofectamine 2000/Opti-MEM çözelti inkübe edin. Zaten siRNA içeren 384 oyuklu plakanın her bir gözeneğine seyreltilmiş 2000/Opti-MEM Lipofectamine çözeltisi 5 ul ekle. Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 xg&#39;de plaka santrifüj. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> (Bölüm 2), yukarıda tarif edildiği gibi plaka deney hazır hücreleri. Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 xg&#39;de plaka santrifüj. </li><li> (Tartışmaya bakınız) yıkmak hedef geni için tespit edildiği üzere 48-96 saat boyunca 37 ° C&#39;de (% 5 CO2) de nemlendirilmiş inkübatör deney plakası geri dönün. </li></ol> 4. Küçük Molekül Eleme <ol><li> Opti ilgi konusu ilaç (örneğin,. Küçük molekül inhibitörleri) seyreltin-MEM arzu edilen nihai konsantrasyonları 6x. Seri seyrelmeler el pipet veya bir sıvı taşıma istasyonu kullanılarak tamamlanabilir. </li><li> Test bileşiği 2.5 ml / kuyu ekleme veya bir çok kanallı pipet kullanarak kuyu tarafına araç (örneğin, DMSO) ihtiva eden tampon eklendi. </li><li> Oda sıcaklığında (kuluçka isteğe bağlı) 15 saniye boyunca 100 xg&#39;de plaka santrifüj. </li></ol> 5. Kalıcı Agonist tedavi <ol><li> 600 nM Opti-MEM içinde quinpirole solüsyonu (100 nM arasında, yani. 6 kez arzu edilen nihai konsantrasyonu) hazırlanır. </li><li> 2.5 ul / oyuk bir çok kanallı pipet kullanarak kuyu tarafına 600 nM quinpirole solüsyonu ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 x g&#39;de santrifüj plaka ve 2 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 6. CAMP Birikiminin uyarılması <ol><li> 2 saat inkübasyon sırasında, uyanm hazırlamakOpti-MEM içinde çözelti on. Stimülasyon çözelti, 40 uM forskolin, oluşan 2 uM 3-izobutil-1-methyxanthine (IBMX), ve 4 uM spiperon (aşama 6 Tüm konsantrasyonları, arzu edilen nihai konsantrasyon 4x edilmiştir.) </li><li> 5 ul / oyuk bir çok kanallı pipet kullanarak kuyuların tarafına uyarım solüsyonu ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 x g&#39;de santrifüj plaka ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol> 7. CAMP Birikim söndürülmesi ve Tahmini <ol><li> Hücreler tarafından cAMP üretimi, üreticinin talimatlarına uygun olarak cAMP dinamik 2 kiti kullanılarak ölçülmüştür. Kısaca, damıtılmış su içinde bir anti-cAMP-kriptat ve cAMP-D2 sulandırın. Kısa süreli depolama için -20 ° C&#39;de alikotları dondurun. </li><li> Çalışma çözümler yapmak için, üreticinin talimatlarına uygun olarak liziz tamponunda anti-cAMP-kriptat bir kısım ve ayrı olarak cAMP-D2&#39;nin bir kısım seyreltin. </li><li> Add, anti-cAMP-kriptat çalışma çözeltisi ve 10 ul / oyuk, çok kanallı bir pipet kullanarak 384-iyi levhaya cAMP-d2 çalışma çözeltisi içinde 10 ul / gözenek. </li><li> Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 100 x g&#39;de santrifüj plaka ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 337 nm&#39;lik bir uyarma kullanan bir floresan plaka okuyucu (hassasiyet için otomatik ölçekli ayar) plakayı okuyun ve başına 620 nm ve 665 nm&#39;de emisyon ölçümü talimatları üretmektedir. </li><li> Başına değerlendirmek rasyometrik analiz uygulamak cAMP standart eğri talimatları üretmektedir. Elde edilen değerleri kullanarak, veri analiz yazılımı kullanılarak test oyuklarındaki tahmini cAMP birikimini tahmin. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+adenylate+cyclase+accounts+for+narcotic+dependence+and+tolerance.">Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).</li><li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+adenylate+cyclase+by+Galpha(i/o)-coupled+receptors.">Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors.</a> Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).</li><li>Christie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+neuroadaptations+to+chronic+opioids:+tolerance,+withdrawal+and+addiction.">Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).</li><li>Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+AGS3+during+morphine+withdrawal+promotes+cAMP+superactivation+via+adenylyl+cyclase+5+and+7+in+rat+nucleus+accumbens/striatal+neurons.">Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons.</a> Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).</li><li>Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m-Opioid+receptor+desensitization+by+&#946;-arrestin-2+determines+morphine+tolerance+but+not+dependence.">m-Opioid receptor desensitization by &#946;-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence.</a> Nature. 408, 720-723 (2000).</li><li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+long-term+plasticity+underlying+addiction.">Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction.</a> Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).</li><li>Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opiate-induced+adenylyl+cyclase+superactivation+is+isozyme-specific.">Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific.</a> J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).</li><li>Sadana, R., Dessauer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+for+G+protein-regulated+adenylyl+cyclase+isoforms:+insights+from+knockout+and+overexpression+studies.">Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies.</a> Neurosignals. 17, 5-22 (2009).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclase+type+5+(AC5)+is+an+essential+mediator+of+morphine+action.">Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).</li><li>Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclase+isoforms+as+novel+therapeutic+targets:+an+exciting+example+of+excitotoxicity+neuroprotection.">Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection.</a> Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).</li><li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+properties+of+adenylate+cyclases+type+5+and+6:+A+progress+report.">Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report.</a> Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).</li><li>Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).</li><li>Lin, Y., Smrcka, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+molecular+recognition+by+G+protein+betagamma+subunits+on+the+path+to+pharmacological+targeting.">Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting.</a> Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).</li><li>Cumbay, M. G., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+sensitization+of+recombinant+adenylate+cyclases+by+activation+of+D2+dopamine+receptors.">Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).</li><li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+endogenous+and+recombinant+adenylate+cyclase+by+activation+of+D2+dopamine+receptors.">Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors.</a> Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).</li><li>Nevo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adenylyl+cyclase+isozymes+on+acute+and+chronic+activation+of+inhibitory+receptors.">Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors.</a> Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).</li><li>Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+activation+of+the+m-opioid+receptor+with+the+endogenous+ligand+endomorphin+differentially+regulates+adenylyl+cyclase+isozymes.">Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes.</a> Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).</li><li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+novel+PKC+isoform+synergistically+enhances+D2L+dopamine+receptor-mediated+sensitization+of+adenylate+cyclase+type+6.">Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6.</a> Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).</li><li>Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+tools+to+dissect+the+role+of+Gs+in+sensitization+of+AC1.">Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1.</a> Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).</li><li>Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2+receptor-induced+heterologous+sensitization+of+adenylyl+cyclase+requires+Gas:+Characterization+of+Gas-insensitive+mutants+of+adenylyl+cyclase+V.">Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V.</a> Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).</li><li>Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D(2)+Receptor-Mediated+Heterologous+Sensitization+of+AC5+Requires+Signalosome+Assembly.">Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly.</a> J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).</li><li>Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+sensitization+of+adenylate+cyclase+is+protein+kinase+A-dependent+in+Cath.a+differentiated+(CAD)-D2L+cells.">Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells.</a> J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+adenylyl+cyclase+inhibitor+for+treating+neuropathic+and+inflammatory+pain.">Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain.</a> Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).</li><li>Nordstedt, C., Fredholm, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modification+of+a+protein-binding+method+for+rapid+quantification+of+cAMP+in+cell-culture+supernatants+and+body+fluid.">A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid.</a> Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).</li><li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+morphine-induced+cAMP+overshoot:+a+cell-based+assay+model+in+a+high-throughput+format.">Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).</li><li>Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+cells+facilitate+cell-based+drug+discovery.">Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).</li><li>Varga, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adenylyl+cyclase+isoenzymes+in+CHO+and+B82+cells.">Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells.</a> Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).</li><li>Masri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+dopamine+D2+receptor/beta-arrestin+2+interaction+is+a+common+property+of+clinically+effective+antipsychotics.">Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).</li><li>Thaker, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+glioblastoma+multiforme+through+short+interfering+RNA+screening:+a+paradigm+for+therapeutic+development.">Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development.</a> Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).</li><li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells:+a+user's+guide.">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Ejendal, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+antagonists+of+tick+dopamine+receptors+via+chemical+library+screening+and+comparative+pharmacological+analyses.">Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).</li><li>Meyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"genome-to-lead"+approach+for+insecticide+discovery:+pharmacological+characterization+and+screening+of+Aedes+aegypti+D(1)-like+dopamine+receptors.">A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors.</a> PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase.">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).</li><li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate/G13+pathway.">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Heterolog sensitizasyon çalışmalarını kolaylaştırmak için bir çaba, biz kapsamlı bizim önceki yöntem bir aerodinamik elde değiştirdiniz &quot;mix ve okumak&quot; yüksek verimli tarama ve eylem inceleme mekanizmasına iyileştirilebilir biçimi. Şu şekildedir protokolüne büyük değişiklikler özetlenebilir: 1) &quot;deneyi hazır&quot; reaktifler olarak dondurularak saklanmış hücrelerin kullanımı, 384-gözlü biçime deneyi 2) minyatürleştirme ve HTRF ölçüm 3) kullanımı cAMP. <p class...

Heterolog-ya da süper-hassaslaşma olarak bilinen tepki sinyalizasyon adaptif bir adenilat siklaz (AC) ilk Nobel ödüllü Dr Marshall Nirenberg laboratuarında keşfedildi. Dr Nirenberg kronik δ opioid reseptör aktivasyonu sonra gözlenen yüksek AC yanıt opiat tolerans ve bağımlılık 1 &#39;de yer alan bir mekanizma olduğunu önerdi. Kronik δ opioid reseptör aktivasyonunun yanı sıra, AC sinyalinin bu nöroadaptif yanıt da birçok Gαi / o-bağlı reseptörlerin 2 kalıcı aktivasyonu takiben oluşur. Özellikle, bu reseptörlerin çoğu ağrı, nöropsikiyatrik ve nörolojik bozukluklar ile bağlantılı ve μ / κ opioid, D 04/02 dopamin, 5HT 1A ve M 2/4 muskarinik reseptörleri 2 içerir. Dr Nirenberg bulgularına ek olarak, kanıt büyük bir gövde, hem kronik opioid reseptör aktivasyonuna AC sinyalizasyon duyarlılığa bağlama Varlığından <ein vitro ve in vivo olarak 3-7 m&gt;. AC Duyarlılık da (inceleme için bakınız referans 2) şizofreni ve Parkinson hastalığı dahil olmak üzere, D-2 gibi dopamin reseptörlerinin rol oynadığı hastalıkların çeşitli ile ilişkilendirilmiştir. Sensitizasyon potansiyel önemine rağmen, kesin mekanizma (lar) AC yanıt büyük ölçüde bilinmemektedir artmasına neden kalıcı Gαi / o kenetli reseptör aktivasyonu ile ilişkilidir. Bu çalışmalar önemli bir nörobiyolojik bir hedef olarak adenilil siklaz hassaslaşması mekanizmaları incelemek için gerekçe sağlar. Aynı şekilde, bireysel ac izoformlarıdır bu adaptif yanıt tutun 8 sinyal AC fizyolojik alaka ve önemi de 2,9,10 kabul edilmelidir. Araştırmamız bağlamında, AC rekombinant izoformlarının heterolog duyarlılık ile ilgili genel özellikleri bu özellikleri paralel desAC endojen izoformlar incelemek için cribed. Özel olarak, önceki araştırma Gαi / o proteinleri ve daha sonra serbest bırakma / yeniden düzenlenmesidir βγ alt birimlerinin aktivasyon her AC izoformlarının reseptör kaynaklı duyarlılık için önemli bir gereklilik olduğunu bulmuştur. Buna ek olarak, pek çok çalışma, protein kinazların ve Gβγ alt birimlerinin gelen sinyalleri sensitizasyon 2,11-13 dahil olduğunu göstermektedir. Bireysel Klimalar aynı zamanda benzersiz ve farklı hassaslaşması desenler 12. gösterilecek. Yakından ilgili AC3 2 duyarlı değildir oysa Örneğin, bunların agonistlere karşı D2 reseptörlerinin kalıcı maruz kalma, Ca2 + / kalmodulin stimülasyonu 14,15 için AC1 ve AC8 duyarlanmasına ile ilişkilidir. AC2, AC4 ve AC7 yakından Ancak, sadece PKC-uyarılmış AC2 aktivite sağlam 7,14,16,17 agonistlerinden için D 2 reseptörleri uzun süreli maruz kaldıktan sonra hassaslaştırılır ilişkilidir. Ayrıca, AC5 ve AC6 heter belirgin derecede göstermektedirologous D2 reseptörlerinin aktivasyonu 14,18-20 takip Gaz ve forskolin ile uyarılmış cAMP birikimi hassasiyeti, ancak Gβγ alt-birimi-AC&#39;de şartlarına göre farklılık göstermedi 21 etkileşimler. AC Hassasiyet çalışmaların çoğu modeli hücre hatları (örneğin HEK293 hücreleri bireysel AC izoformlarını ifade) kullanılmış olmasına rağmen, bu bulgular yerli nöronal hücre modellerinin 4,22 çevirmek görünür. Daha yakın zamanda, AC izoformlarını eksprese eden HEK293 hücrelerinde tespit AC izoform seçici küçük molekül inhibitörlerinin etkileri de in vivo davranış çalışmalar 23 tercüme edilebilir. Heterolog sensitizasyon için tanımlanmış bir moleküler mekanizmasının olmaması olası adaptif yanıt karmaşıklığını hem de AC 12 izoformları bireyin kendisine özgü düzenleyici özelliklerini yansıtmaktadır. Bu karmaşıklığı çözülüyor daha hantal metodoloji t kullanılmasıyla karmaşıkşapka tarafsız yaklaşımları kullanılarak akademik araştırmacılar sınırlıdır. Ve 48-çukurlu doku kültür biçimi 15 - Örneğin, önceki mekanistik çalışmalar 24 kullanılarak sürekli olarak kültürlenmiş hücre modellerinin kullanımını içeriyordu. Kültürlenmiş hücreler tipik olarak, 48 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra hücre yıkama ve inkubasyon bir dizi (Şekil 1) takip agonist ilaç tedavisi (2-18 saat) tabi tutuldu. AC-izoform özel cAMP birikimi protokoller cAMP metodoloji 15,24 bağlayıcı bir zahmetli ve zaman alıcı bir [3H] cAMP kullanılarak birikiminin ölçülmesi ile takip kullanılan sonra idi. Her bir deney için baştan sona süresi genel olarak hücre kaplama veri analizi (Şekil 1) için 4-5 günlük bir toplam gerekmektedir. Yeni teknolojilerin ve otomasyon uygulaması, endüstriyel ve HTS merkezi bir ortamda sensitizasyon çalışmaları için belirgin geliştirmeleri yol açmıştır. Örneğin, kimyasal Ulusal Merkezi ile çalışan bir grupcal Genomics iki günlük bir 1536-çukurlu formatta 25 μ opioid reseptör kaynaklı duyarlılık küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için deney prosedürü HTS bildirdi. Bu makale en çok akademik araştırma kurumları bulunmaktadır teknolojilerini kullanarak heterolog sensitizasyon çalışmaları için bir HTS test geliştirmek için çabalarımızı açıklanır. Bu strateji, heterolog ya da endojen Tek tek rekombinant adenilat siklaz izoform (CHO-B 2L ya da HEK-AC6 / D 2 L) ile kombinasyon halinde, dopamin D2 reseptörü ifade eden hücre modellerden dondurularak saklanmış hücrelerin kullanımı dahil edilmesi ile gerçekleştirildi. Bizim verimi artırmak için, biz aslında &quot;mix ve okumak&quot; olduğunu 384-kuyu biçiminde bir beş adım, tek bir gün tahlil için 48 iyi hassaslaşması tahlili (4-5 gün içinde yaklaşık&gt; 20 adım) yeniden tasarlanmış. Yeni format cAMP acc ölçmek için piyasada bulunan bir homojen zaman çözüldü floresan (HTRF) deneyi kullanırBir çok modlu bir plaka okuyucusu ile sağlam hücrelerde umulation. Deney, sağlam ve küçük molekül tarama için uygun olan ve etkili bir şekilde heterolog sensitizasyon inhibitörlerinin taranması için uygulanabilir. Buna ek olarak, genel bir yaklaşım, sadece küçük bir değişiklik ile veya hedef genom geniş siRNA bir arşiv taraması için siRNA ters transfeksiyonu bu tahlilin kullanımı sağlar veri sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">CHO-K1-DRD2L cells</td>
			<td style="width:144px;">DiscoveRx</td>
			<td style="width:148px;">930579C2</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Ham&#8217;s F12 media</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH30026fs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">G418</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">50-230-5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Penicillin/ streptomycin</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:144px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:148px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">DMSO</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">13150016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cryovials</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">976171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">TC treated 384 well plates</td>
			<td style="width:144px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:148px;">6007688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:205px;">HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td>
			<td style="width:144px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:148px;">62AM4PEB</td>
			<td style="width:199px;">http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Synergy 4</td>
			<td style="width:144px;">Biotek</td>
			<td style="width:148px;">H4MLFPTAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Prism 6</td>
			<td style="width:144px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:148px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">(&#177;)Quinpirole</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">Q111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Spiperone</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S7395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Clozapine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">C6305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Haloperidol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">H1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">S-(-)Sulpiride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:205px;">Lipofectamine2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:148px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Water, DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:144px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:148px;">821739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Gas siRNA</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">custom siRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Non-targeting siRNA control</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">siGlo Red</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001630-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug-induced sensitization of adenylyl cyclase: assay streamlining and miniaturization for small molecule and sirna screening applications

Adenilil siklaza (AC) bir sinyal sensitization, madde bağımlılığı, Parkinson hastalığı dahil olmak üzere nöropsikiyatrik ve nörolojik bozukluklar, çeşitli implike edilmiştir. Gαi / o-bağlanmış reseptörlerin aktivasyonu akut AC aktivitesini inhibe eden, AC heterolog duyarlılaşma bu reseptörler sonuçların kalıcı aktivasyonu ve hücre içi cAMP seviyeleri ise. Önceki çalışmalar, AC yanıt bu artış da dahil olmak üzere, dopamin D 2 ve opioid reseptörleri μ Gαi / o-bağlanmış reseptörlerin çeşitli kronik aktivasyon aşağıdaki in vitro ve in vivo olarak görülmektedir olduğunu göstermiştir. AC heterolog hassaslaşması ilk dört yıl önce rapor edilmiş olmasına rağmen, bu olguyu altında yatan mekanizma (lar) büyük ölçüde bilinmemektedir. Mekanistik veri eksikliği muhtemelen nonbiased yaklaşımları belirlemek yardımcı olabilir düşündüren, bu adaptif tepki ile ilgili karmaşıklığı yansıtırAC heterolog sensitizasyon yer moleküler yolları ing. Önceki çalışmalar AC heterolog duyarlılığa düzenleyen bileşenleri örtüşen olarak kinaz ve Gbγ sinyalizasyon karıştırdılar. AC sensitizasyon ile ilişkilendirilmiş benzersiz ve ek örtüşen hedefleri belirlemek, ölçeklenebilir bir cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesi ve doğrulama daha fazla verim için gereklidir. Duyarlaşması Önceki yaklaşımlar sürekli hücre kültürü bakım yanı sıra birden fazla yıkama adımları içerir cAMP birikimini ölçmek için karmaşık bir metodoloji içeren genellikle zahmetlidir. Bu nedenle, 384 formatında yüksek verimli tarama (HTS) için kullanılabilir sağlam bir hücre bazlı tahlilin geliştirilmesi gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır. İki D 2 dopamin reseptör hücre modelleri (yani. CHO-D 2L ve HEK-AC6 / D 2L) kullanarak, bir beş-s bizim 48-kuyu hassaslaşması deneyi (&gt; 20 adım 4-5 gün) çevirdimTEP, 384 oyuklu formatta geçen gün deneyi. Bu yeni biçim küçük molekül taraması için uygun olduğunu ve bu deney tasarımı da hali hazırda siRNA hedef kütüphane tarama beklentisiyle siRNA ters transfeksiyonu için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bir ticari olarak temin edilebilen hücre modeli kullanılarak küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için bir 384 heterolog sensitizasyon tahlili Geliştirme Bölümü I.. Bir hücre modelinde heterolog hassasiyete incelemek için, bir &quot;mix ve okumak&quot; biçime tahlil düzene bize etkin bir dizi iyileştirme yapılmış. Önemli modifikasyonlar pek çok aşağıda belirtilmiştir, ve tartışmaya daha ayrıntılı olarak tarif edilmektedir. İlk önemli...

Watch this Scientific Journal Video about Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications at JoVE.com

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Adenilat siklaz sinyal duyarlanmasına inhibitör G protein-eşli reseptörler sonuçları Kalıcı aktivasyonu. Temel moleküler yolları belirlemek için, nonbiased yaklaşımlar gereklidir, ancak bu strateji ölçeklenebilir hücre bazlı cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, küçük molekül ve siRNA taranması için olan bir hassaslaşma deneyi tarif eder.

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K Görüntüleme.  Purdue University.  Adenilat siklaz sinyal duyarlanmasına inhibitör G protein-eşli reseptörler sonuçları Kalıcı aktivasyonu. Temel moleküler yolları belirlemek için, nonbiased yaklaşımlar gereklidir, ancak bu strateji ölçeklenebilir hücre bazlı cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, küçük molekül ve siRNA taranması için olan bir hassaslaşma deneyi tarif eder. 

Video: Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Biyomühendislik

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Geniş bant Tıbbi Görüntüleme Uygulamaları Ultrason Optik Dedektörü

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

SiRNA Therapeutics teslimi için Gözenekli Silikon Mikropartiküller

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Biyomedikal Uygulamalar için Mekanik ayarlanabilir ve Biyoaktif Metal iskelelerinin Fabrikasyon

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin exine capsules (SECs) are obtained when spores or pollen are processed so as to remove the internal sporoplasmic contents. The resulting hollow microcapsules exhibit a high degree of micromeritic uniformity and retain intricate microstructural features related to the particular plant species. Herein, we demonstrate a streamlined process for the production of SECs from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs. The current SEC isolation procedure has been recently optimized to significantly reduce the processing requirements which are conventionally used in SEC isolation, and to ensure the production of intact microcapsules. Natural L. clavatum spores are defatted with acetone, treated with phosphoric acid, and extensively washed to remove sporoplasmic contents. After acetone defatting, a single processing step using 85% phosphoric acid has been shown to remove all sporoplasmic contents. By limiting the acid processing time to 30 hr, it is possible to isolate clean SECs and avoid SEC fracturing, which has been shown to occur with prolonged processing time. Extensive washing with water, dilute acids, dilute bases, and solvents ensures that all sporoplasmic material and chemical residues are adequately removed. The vacuum loading technique is utilized to load a model protein (Bovine Serum Albumin) as a representative hydrophilic compound. Vacuum loading provides a simple technique to load various compounds without the need for harsh solvents or undesirable chemicals which are often required in other microencapsulation protocols. Based on these isolation and loading protocols, SECs provide a promising material for use in a diverse range of microencapsulation applications, such as, therapeutics, foods, cosmetics, and personal care products.

This protocol/manuscript describes a streamlined process for the production of sporopollenin exine capsules (SECs) from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs.

Mikroenkapsülasyon Uygulamaları için Ekstraksiyon Tesisi tabanlı Kapsüller

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

Açık Kaynak Mikroplaka Uyumlu Aydınlatma Panelleri Uygulamaları

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various biological activities including cell proliferation, survival, migration and differentiation. Several aberrations in the FGFR signaling pathway, owing to mutations or gene amplification events, have been identified in various types of cancers. Hence, recent research has focused on developing strategies involving therapeutic targeting of FGFRs. Current FGFR inhibitors at various stages of pre-clinical and clinical development include either small molecule inhibitors of tyrosine kinases or monoclonal antibodies, with only a few peptide- based inhibitors in the pipeline. Here, we provide a protocol using phage display technology to screen small peptides as antagonists of FGFR2. Briefly, a library of phage-displayed peptides was incubated in a plate coated with FGFR2. Subsequently, unbound phage was washed off by TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), and bound phage was eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 2.2). The eluted phage was further amplified and used as input for the next round of biopanning. Following three rounds of biopanning, the peptide sequences of individual phage clones were identified by DNA sequencing. Finally, the screened peptides were synthesized and analyzed for affinity and biological activity.

Herein, we present a detailed protocol for screening small peptides that bind to FGFR2 using a phage display peptide library. We further analyze the affinity of the selected peptides toward FGFR2 in vitro and its ability to suppress cell proliferation.

Faj Görüntüleme Peptid Kütüphanesi Kullanılarak Fibroblast Büyüme Faktörü Reseptörü 2'yi Hedefleyen Küçük Peptidlerin Taranması ve Tanımlanması

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Rapid Fabrication of Custom Microfluidic Devices for Research and Educational Applications

Microfluidic devices allow for the manipulation of fluids, particles, cells, micro-sized organs or organisms in channels ranging from the nano to submillimeter scales. A rapid increase in the use of this technology in the biological sciences has prompted a need for methods that are accessible to a wide range of research groups. Current fabrication standards, such as PDMS bonding, require expensive and time consuming lithographic and bonding techniques. A viable alternative is the use of equipment and materials that are easily affordable, require minimal expertise and allow for the rapid iteration of designs. In this work we describe a protocol for designing and producing PET-laminates (PETLs), microfluidic devices that are inexpensive, easy to fabricate, and consume significantly less time to generate than other approaches to microfluidics technology. They consist of thermally bonded film sheets, in which channels and other features are defined using a craft cutter. PETLs solve field-specific technical challenges while dramatically reducing obstacles to adoption. This approach facilitates the accessibility of microfluidics devices in both research and educational settings, providing a reliable platform for new methods of inquiry.

Here we present a protocol to design and fabricate custom microfluidic devices with minimal financial and time investment. The aim is to facilitate the adoption of microfluidic technologies in biomedical research laboratories and educational settings.