Bu protokol, çoklu glikozilasyon enzimlerinin bir hedef proteinin gliko-profili üzerindeki etkisini taramak ve enzimin işlevlerinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmak için kullanılabilir. Protokolün doğası, glikozilasyon enzimlerinin geçici, ancak yüksek verimli bir şekilde taranmasına izin verir. Değiştirilmiş glikozilasyon profilleri, antikor aktivitelerinin artmasına neden olabilir ve bu nedenle nihai ürünün etkinliğini artırabilir.
Biyofarmasötik şirketleri, glikozilasyonu kritik bir kalite özelliği olarak yakından izlemektedir. Anormal bir glikozilasyon, kanser gibi hastalıkların ayırt edici bir özelliğidir. Bu nedenle, bu yöntem farmakolojik ve biyomedikal araştırmalarla ilgilidir.
Protokol, kullanıcıların memeli hücre transfeksiyonu ve Batı lekeleri de dahil olmak üzere çeşitli deneysel tekniklerde deneyime sahip olduklarını varsayar. Daha az örnekle başlamak ve ilk etapta durma noktaları kullanmak daha iyidir. Çin hamster yumurtalık hücrelerinin yoğunluğunu ve yaşayabilirliğini değerlendirerek başlayın.
Ardından, kontaminasyonu önlemek için biyogüvenlik kabinini ve tüm ekipmanı% 70 etanol ve bir RNaz inhibitörü çözeltisi ile dikkatlice temizleyin. Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 100 kez G'de pelet edin ve mililitre başına altı hücreye beş çarpı 10 hücre yoğunluğunda önceden ısıtılmış bir ortamda yeniden askıya alın. DsiRNA ana karışımının sekiz mikrolitresini veya kontrolünü steril bir elektroporasyon küvetine aktarın.
Aynı küvete 800 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin, karıştırın ve elektroporasyon darbesini verin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu küvetten altı delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve köpük benzeri malzemeden kaçının. Hücreleri sallamadan 10 dakika boyunca inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, kuyucuk başına 1.6 mililitrelik bir son hacim yapmak için 800 mikrolitre önceden ısıtılmış ortam ekleyin. 150 RPM'de sallanırken inkübatördeki transfekte hücreleri büyütün. 48 saat sonra, süpernatant ve hücreleri hasat edin.
IgG saflaştırmasından sonra, üç kilodalton moleküler ağırlıklı kesme santrifüjlü konsantrifüj konsantratörüne elüsyon A ekleyin ve dört santigrat derecede 40 ila 50 dakika boyunca 13.300 kez G'de santrifüj yapın. Santrifüjleme, artık hacim 50 mikrolitreye eşit veya daha az olduğunda tamamlanır. Akışı atın ve kalan süpernatanı seyreltmek için 500 mikrolitre önceden soğutulmuş 1X PBS ekleyin.
50 mikrolitre artık süpernatant kalana kadar numuneyi aynı koşulları kullanarak tekrar santrifüj yapın. Süper natantın 100X seyreltilmesini elde etmek için, 500 mikrolitre önceden soğutulmuş 1X PBS ekleyin ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Glikan analiz yöntemiyle uyumluluğu sağlamak için süpernatantı 40 mikrolitrede litre başına yaklaşık 2,5 gramlık bir nihai konsantrasyona konsantre edin.
Glikan analizi için, manyetik boncuk çözeltisinin 200 mikrolitresini 2 mililitrelik bir PCR tüpüne aktarın. Boncukları süpernatanttan ayırmak için manyetik standın üzerine yerleştirin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. Ardından, tüpleri manyetik standdan çıkarın ve saflaştırılmış protein örneğini ve girdabı ekleyin.
Ardından, besleme denatürasyon tamponunu numune tüpüne ekleyin ve 60 santigrat derecede sekiz dakika inkübe edin. Optimum reaksiyon performansı için numune tüplerini açık tutun. Kuluçkadan sonra, PNGaz F ekleyin ve glikanları saflaştırılmış antikorlardan ayırmak için 60 santigrat derecede 20 dakika daha inkübe edin.
N-glikanların salınmasından sonra, numune tüpünü ve girdabını kapatın. Ardından, numune tüpüne, girdaba asetonitril ekleyin ve bir dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Boncukları çözeltiden ayırmak için numune tüplerini manyetik standa yerleştirin.
Ardından, bir pipet kullanarak, boncuklara dokunmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın. Florofor içeren glikan etiketleme solüsyonunu numuneye bir duman davlumbazına ekleyin ve vorteks yaparak karıştırın. Açık kapaklarla 60 santigrat derecede 20 dakikalık bir inkübasyonun ardından, numuneyi asetonitril içinde üç kez yıkayarak fazla boyayı çıkarın.
Ardından, etiketli glikanları çift damıtılmış suda süzün. Numune tüpünü manyetik standa yerleştirin ve saflaştırılmış ve etiketlenmiş glikanlarla zenginleştirilmiş süpernatantı toplayın. Ardından, gerekli tüm standartları ve örnekleri hazırlayın ve belirlenen tepsi konumlarına yükleyin.
Glikan analiz protokolünü çalıştırın ve uygun yazılımı kullanarak numunede bulunan glikanları analiz edin ve tanımlayın. Batı leke analizi, üç Fut8 DsiRNA yapısının bir karışımı ile transfekte edilen hücrelerde Fut8 protein ekspresyonunun azaldığını gösterdi. Nakavt hücrelerinden gelen glikan yapıları da fukozilasyonun azaldığını gösterdi.
Bu eğilim en çok agalaktosillenmiş yapılarda belirgindi ve galaktosillenmiş yapılarda daha az ölçüde gözlendi. Çekirdek fukozilasyonunda iki kat azalma, hücre canlılığında önemli farklılıklar olmaksızın tek bir kare dalga darbesine kıyasla iki kare dalga darbesi kullanılarak elektroporasyondan gözlenmiştir. Genel olarak, kısa müdahaleci RNA konsantrasyonunun arttırılması, çekirdek fukozilasyonu üzerinde hasat süresini arttırmaktan daha büyük bir girişime sahiptir.
Su ve asetonitril arasındaki oran, glikanların çözelti içinde mi yoksa boncukların bir kısmında mı olduğunu belirler. Etiketli glikanların çözeltiden yanlışlıkla çıkarılmasını önlemek için yıkama adımları sırasında hatırlanması gereken çok önemlidir. Bir takip deneyi, antikora bağımlı hücre aracılı sitotoksisiteyi ve kompleman bağımlı sitotoksisiteyi ölçmek için hücre bazlı testler kullanılarak saflaştırılmış monoklonal antikorların karakterizasyonunu içerebilir.
