Yazarlar bu eser desteklemek için Leduq Vakfı tarafından finanse edilen Sphingonet Konsorsiyumu kabul etmek istiyorum. Bu eser de "vasküler farklılaşma ve modelleme" ortak araştırma merkezi tarafından desteklenmiştir (CRC / Transregio23, proje C1) ve 7. FP, COFUND, Goethe uluslararası doktora sonrası programı GO-inç, No 291776 finansman. Daha fazla Kathleen Sommer fareler ile onun teknik yardım için işleme ve Genotipleme anıyoruz.

Tüm hayvanların son derece dikkatli ağrı veya rahatsızlık işlem sırasında en aza indirerek ele. Bu yordam kuruluşumuzun hayvan bakımı kuralları izler ve yerel Komitesi (Regierungspraesidium Darmstadt, onay numarası FK/1044) tarafından onaylanmış.
Vivo geçirgenliği tahlil farelerde için iş adımları şematik Resim 1' de gösterilen. Her adımı ayrıntılarını aşağıda açıklanmıştır.
1. hayvan taşıma
<ol><li>
Hazırlık ve izleyiciler ve anestezi yönetimi
	<ol>
<li>En az bir gün önce geçirgenliği tahlil katıştırma doku etiketli tüpler ve kalıpları hazırlamak. Temiz duman başlık altında çalışan ve % 80 etanol ile temizlenmiş araçları kullanarak protokol steril koşullarını korumak. 3-6 ay için geçerli protokol Olgun Yetişkin yaş grubunda erkek veya kadın vahşi-türü (WT) veya angiopoietin-2 (Ang-2) fonksiyonu kazanç (GOF) CD1 fare kullanın. 10daha önce açıklandığı gibi farelerin Genotipleme gerçekleştirin. Not: % 80 alkol steril aletlerin oluşturmayacaktır ancak kirlenme hazırlanan numunelerin en aza indirmek olacaktır.</li>
		<li>Steril PBS tüm izleyiciler 2 mM stokları sulandırmak ve ışık-20 ° C'de korunan aliquots depolayın</li>
		<li>Tarayıcıları (Tetramethyl rodamine) TMR gibi seçin ve (floresein isothiocyanate) FITC ayrı uyarma/emisyon spectra ve çoğu lizin her iki tarafından Floresans mikroskobu boyalar arasında en az girişime sonuçlanan tamir edilebilir (TMR kullanarak veya FITC sırasıyla filtre) ve fluorometry geçirgenliği tahlil için bir plaka okuyucu tarafından. Not: TMR dextran 3 kD ve FITC dextran 3 kD çalışmada kullanılan her iki lizin tamir edilebilir olduğunu ve dolayısıyla da immunohistokimyasal analiz sonrası fiksasyon ile aldehitler için bölgesel farklılıklar araştırmak amacıyla kullanılabilir.</li>
		<li>Tüm hayvanların son derece dikkatli Kurulusları yönergeleri izleyerek başa. İntraperitoneally her fare her izleyici 100 µL bir 1:1 karışımı10,13' te kullanarak ek bir izleyici birleştirildiğinde bu kadar 200 µL artırılabilir 100 µL izleme çözümü ile enjekte et. PBS autofluorescence arka plan çıkarma için sahte denetimi olarak hizmet etmek için izleyiciler yerine tek başına en az bir hayvan enjekte.</li>
		<li>5 dakika sonra izleyici enjeksiyon, ketamin ve Xylazine bir IP enjeksiyon hayvanla anestezi (5-10 mg ve 100 mg % 0,9 kg vücut başına Saline ağırlık sırasıyla, kokteyl 25 g fare başına 150 µL). Not: hayvan anestezi ve perfüzyon/kurban arasındaki dönemi kısa olduğu gibi veteriner merhem gözünü işlem sırasında uygulanmadı nerede herhangi bir gözünde kurutma değildi (10 dakika) görülmektedir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kan toplama ve kardiyak perfüzyon
	<ol>
<li>Hayvanlar kalp perfüzyon 10 dk sonra anestezik Yönetim için hazır olun. Pençe seğirme yanıt yokluğu hayvan cerrahi anestezi uçağa ulaştı emin olmak için kontrol edin.</li>
		<li>Hayvanlar onların sırt üstü yatıyordu ve % 80 etanol karın bölgesinde cilt üzerinde uygulayın. Küçük makas kullanırken, karın duvarı göğüs kafesinin hemen altında küçük bir insizyon attım (2 cm) ile açın. Karaciğer diyaframdan ayırın ve sonra yavaş yavaş plevral boşluğu 15açığa diyafram ile kesti.</li>
		<li>Bilateral göğüs kafesi kesme ve kesme göğüs kemiğinin sol ventrikül göstermek düzeltmek. Peristaltik perfüzyon sistemi için sol ventrikül arka içinde bağlı 21'lik kelebek iğne yerleştirin.</li>
		<li>Sağ atrium ponksiyon ve hızlı bir şekilde (içinde 10 s) 1 mL pipet İpuçları (ile son kesme) kullanarak göğüs boşluğu içine serbest kan 200-300 µL serum koleksiyonu tüplerde toplamak ve buza saklayın. Not: Bu perfüzyon hayatta olmayan bir yöntemdir.</li>
		<li>En kısa zamanda kan toplanır, perfüzyon sistemi (10-12 d/d, 5 mL/dk) geçin ve hayvan 3 dk sıcak (RT) 1 x PBS ile sıvı (Ca'nın ücretsiz2 + /Mg2 + iyonları). Not: PBS içeren Ca2 +/Mg2 + iyonları perfüzyon sırasında daha iyi kalp etkinlik için yararlı olabilir. Toplam perfüzyon için kullanılan PBS 15-20 mL aralığında miktarıdır.</li>
		<li>Perfüzyon kalite karaciğer, rengini işaret ederek değerlendirmek böbreğin perfüzyon sonra beyaz/soluk görünür. Not: Böbrek veya karaciğer perfüzyon değil mutlaka bir belirtisi olarak arterler (karotis/vertebra) aort beyinden adım 3 hazırlık Atriyal ponksiyon sırasında özellikle sırasında yırtıldı ulaşan beyin perfüzyon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. doku işleme
<ol><li>Organ toplama ve depolama
	<ol>
<li>Perfüzyon sonunda, servikal çıkması ve hasat beyin ve böbrekler hayvanın ölümü onaylayın. Beyin perfüzyon perfüzyon kalitesi iyi değil zaman hayvanlar geçirgenliği çözümleme dışı bırakmak böylece beyin (görünür kan damarlarının meninkslerde), renk tarafından doğrulayın. Beyin 2 hemibrains bir neşter (şekil 1) kullanarak ayırın.</li>
		<li>Bir neşter bir hemibrain ile olfaktör loblar ve beyincik ücretsiz teşrih ve hemicerebrum 2 mL tüp aktarın. Hemi-beyincik serebellar geçirgenliği değerlendirmesi için gerekli ek bir tüp içinde saklayabilirsiniz.</li>
		<li>Bir tek böbrek için başka bir 2-mL tüp aktarın. Örnekleri hemen kuru buza saklayın.</li>
		<li>Yerel olarak kalan böbrek ve hemi-beyin (beyincik ve olfaktör loblar oluşan) doku-tek en iyi kesim ısı (O.C.T) kuru buza bileşik katıştırın.</li>
		<li>Sonunda, 10, 000 g, 4 ° C'de 10 dakika buz serum koleksiyonu tüpler içinde depolanan kan örnekleri santrifüj kapasitesi Serum supernatants 1,5 mL tüpler için aktarmak ve onları kuru buz kapsayıcısına getirin.</li>
		<li>Kuru buzun-80 ° C dondurucu için daha fazla alay kadar toplanan tüm örneklerini aktarın. Not: Çözülme donma gibi örnekleri homojenizasyon verimliliği artar sonra olarak homojenizasyon adımlara geçmeden önce dondurmak önemlidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Homojenizasyon ve Santrifüjü
	<ol>
<li>Aşağı-80 ° C'de dondurulmuş hemi-cerebrum ve böbrek örnekleri buz çözme ve organları içeren tüpler tartın. Bu ağırlıklar doku kilo almak için birkaç boş tüpler (20) ortalama değerini çıkarın. 300 µL ve soğuk 1 200 µL eklemek X PBS böbrek ve hemi-cerebrum, sırasıyla içeren tüpler için. Not: doku (100 mg altında hemi-beyincik gibi) daha düşük miktarlarda için bireysel tüpler ağırlığında tavsiye edilir.</li>
		<li>Yaklaşık 15 vuruş gerçekleştirerek bir elektrik havai karıştırıcı (1, 000 rpm) için bağlı bir politetrafloroetilin (PTFE) havaneli ile orijinal eppendorf tüp her örnekte homojenize (1 vuruş = 1 ve 1 aşağı). PBS ile havaneli örnekleri arasında durulama ve sonraki örnek geçmeden önce kuru silin. Not: Deterjanlar homojenizasyon sırasında kullanımı ile fluorometry olası girişim nedeniyle kaçınılması. Ancak, doku iyice bir yuvarlak donma sonra çözdürme daha verimli olduğu homojenize gibi hücre içi izleyici de bu protokol için algılandı.</li>
		<li>Homojenize örnekleri ışık ve santrifüj 15.000 g, 20 dk, Masa üstü bir santrifüj 4 ° C'de sonunda hep birlikte korunuyorsunuz buz mağaza. Supernatants yeni bir 1,5 mL tüpler için hemen fluorometry ya da daha sonra çözümlenecek-80 ° C'de buzda aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresans ölçüm ve miktar
	<ol>
<li>Önceki adım sonunda donmuş, buzda-80 ˚C ışık folyo ile onları korumak, saklanan doku süpernatant ve serum örnekleri çözülme.</li>
		<li>Seyreltik serum (30 µL 1 x PBS + 20 µL serum) ya da (as) doku supernatants 50 µL 384-şey siyah bir tabak pipet. Bu doku homogenate arka plan normalde PBS eritici kullanılan daha yüksek olduğu gibi sahte hayvan uygun arka plan çıkarma, emin olmak serum ve doku supernatants için en az bir örnek içerir. Not: sahte autofluorescence değerleri (veri gösterilmez) çok az bir değişkenlik gözlendi rağmen ortalama 3 sham hayvanların autofluorescence için kullanılabilir. PBS, ayrıca gürültü oranı sinyal örnekleri için beyin örnekleri gibi düşük floresan ile artırabilir ile sulandrarak kullanılan serum miktarı azaltılabilir. Upto 10 µL serum ile 40 µL PBS sulandrarak test edildi. Hava kabarcığı yok wells bulunduğundan emin olun.</li>
		<li>384-şey siyah plaka plaka okuyucuya yerleştirin ve floresan ölçüm seçerek yeni bir komut dosyası açın.</li>
		<li>Kazanç için en iyi ayarlayın ve 550/580 veya 490/520 uyarma/emisyon (nm) değerleri sırasıyla TMR veya FITC dyee için kullanın ve ham Floresans birimleri (RFUs) elde etmek için ölçüm başlatın.</li>
		<li>Ham Floresans birimleri (RFUs) plaka okuyucu geçirgenliği dizin (PI) karşılık gelen sahte değerlerini çıkarılarak sonra hesaplamak için kullanın.<ol>
<li>
* Geçirgenliği dizin (mL/g) = (Doku RFUs/g doku ağırlık) / (Serum RFUs/mL serum)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Örnek hesaplama beyin geçirgenliği dizin (PI) için hayvan GOF1 (Tablo 1):<ol>
<li>GOF1 beyin RFUs - SHAM beyin RFUs 154-22,5 = 131.5 =</li>
			<li>GOF1 serum RFUs - SHAM serum RFUs 38305-27 = 38278 =</li>
			<li>Beyin ağırlığı (g) 0.195 =</li>
			<li>Serum hacmi (ml) 0,02 =</li>
			<li>Beyin geçirgenliği dizin (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) 0.352 = Not: Mutlak ve deneyler ve doku türleri arasında karşılaştırılabilir değerler geçirgenliği dizin hesaplamalar verim. Bunlar ancak 2 grup 12arasında karşılaştırma kolaylığı için oranları olarak sunulabilir. Bu her iki grupta her hayvan PI 1 henüz kontrol grubunda Inter hayvan varyasyon tutmak ile kontrol grubu ortalama sürüş kontrol grubunun ortalama PI ile bölerek elde edilebilir. Bu dönüşüm kontrol grubu 1'e ayarlayın göre deney grubu (veya grup) için değerler sağlar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Ayirt görsel izleyici olarak
	<ol>
<li>Yerli bir cryostat ilgili bölümlerde-20 ° C ayarla ve oda sıcaklığında yerleştirilen slaytlara bölümleri transfer 10 µm içine doku-tek bileşik (O.C.T) (Adım 2.1) gömülü böbrek/hemi-beyin blok kesme. Bir kez bölümleri (yaklaşık 30 dk) kurutulur, slaytlar kadar kullanmak-80 ° C buzluğa aktarın.</li>
		<li>Gününde, boyama slaytlar için 10 dk. 37 ° C'de erimek ve bölümleri için PBS hızlı yıkama ardından oda sıcaklığında 10 dk %4 paraformaladehyde (PFA) ile düzeltin.</li>
		<li>Permeabilization/engelleme arabellek % 1 BSA ve oda sıcaklığında 1 h için % 0,5 Triton X-100 pH 7.5 içeren steril PBS yapılmış bölümlerde kuluçkaya.</li>
		<li>Slaytlar, oda sıcaklığında CD31 birincil antikor ile 1,5 saat için kuluçkaya (0,5 mg/ml, MEC 13,3 klonu), 1: 100 steril PBS, % 0.5 BSA, %0.25 içeren arabellekte PBS üç 5 dk yıkar ardından Triton X-100 (pH 7.2) seyreltilmiş.</li>
		<li>İkincil antikor kuluçka species-specific ile oda sıcaklığında 1 h için yukarıdaki arabellek fluorescently antikorlar seyreltilmiş 1:500 (2 mg/mL) etiketli gerçekleştirin. CD31 için keçi Anti-sıçan Alexa 568 veya Alexa 488 1:500 bir seyreltme kullanılabilir. DAPI içerir (300 µM) ikincil antikor (1:1, 000 seyreltme stoktan) çekirdeği için leke karıştırın.</li>
		<li>Aqua polymount lekeli bölümlerle dağ ve gece karanlıkta oda sıcaklığında polimerizasyon için bırakın.</li>
		<li>Spektral görüntüleme confocal lazer mikroskop sistem tarama kullanarak görüntüleri elde etmek. Görüntüleri NIS elements yazılımı (version 4.3) tarafından analiz. Yazılım Photoshop gibi montaj şekiller oluşturmak için kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Abbott, N. J., R&#246;nnb&#228;ck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Dysfunction+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier.</a> Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).</li><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT-1+glucose+transporters+in+the+blood-brain+barrier:+differential+phosphorylation.">GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation.</a> Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).</li><li>Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+blood-brain+barrier+to+blood-brain+interface:+new+opportunities+for+CNS+drug+delivery.">From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer's+disease+and+other+disorders.">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).</li><li>Paganetti, P., Antoniello, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+efflux+of+amyloid-&#946;+peptides+through+the+blood-brain+barrier+by+muscarinic+acetylcholine+receptor+inhibition+reduces+pathological+phenotypes+in+mouse+models+of+brain+amyloidosis.">Increased efflux of amyloid-&#946; peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).</li><li>Devraj, K., Poznanovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BACE-1+is+expressed+in+the+blood-brain+barrier+endothelium+and+is+upregulated+in+a+murine+model+of+Alzheimer's+disease.">BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).</li><li>Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier in health and disease.</a> Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).</li><li>Gurnik, S., Devraj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2-induced+blood-brain+barrier+compromise+and+increased+stroke+size+are+rescued+by+VE-PTP-dependent+restoration+of+Tie2+signaling.">Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling.</a> Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).</li><li>Scholz, A., Harter, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-derived+angiopoietin-2+is+a+therapeutic+target+in+treatment-naive+and+bevacizumab-resistant+glioblastoma.">Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).</li><li>Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoside+diphosphate+kinase+B+regulates+angiogenic+responses+in+the+endothelium+via+caveolae+formation+and+c-Src-mediated+caveolin-1+phosphorylation.">Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).</li><li>Ziegler, N., Awwad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Catenin+Is+Required+for+Endothelial+Cyp1b1+Regulation+Influencing+Metabolic+Barrier+Function.">&#946;-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).</li><li>Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+sphingolipid+metabolism+as+a+putative+mechanism+underlying+LPS-induced+BBB+disruption.">Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption.</a> Journal of Neurochemistry. , (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+Low+Molecular+Weight+Fluorescein+Isothiocyanate+(FITC)-Dextrans+to+Assess+Blood-Brain+Barrier+Disruption:+Technical+Considerations.">High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations.</a> Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).</li><li>Armulik, A., Genov&#233;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier.">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li><li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis.">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li><li>Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging.">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li><li>Banks, W. A., Gray, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+blood-brain+barrier+disruption:+roles+of+cyclooxygenase,+oxidative+stress,+neuroinflammation,+and+elements+of+the+neurovascular+unit.">Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).</li><li>Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+claudins.">Structure and function of claudins.</a> Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).</li><li>Johansson, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+Role+of+Brain+Endothelial+Surface+Charge+and+Glycocalyx.">Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx.</a> Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).</li><li>Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+effects+of+the+blood-brain+barrier+on+the+transport+of+charged+molecules.">Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules.</a> The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).</li><li>Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Fc+receptor+mediates+internalization+of+Fc+in+transfected+human+endothelial+cells.">Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).</li><li>Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -. Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-pore+model+describes+transport+properties+of+bovine+retinal+endothelial+cells+in+normal+and+elevated+glucose.">A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).</li><li>Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+endothelial+cell+surface+marker+is+suppressed+during+differentiation+of+the+blood+brain+barrier.">Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Kan - beyin bariyerini disfonksiyon birincil ve ikincil Beyin Tümörleri veya felç gibi nörolojik bozukluklar, bir dizi ile ilişkilidir. BBB arıza kez hayati CNS ödem ile ilişkilidir. Bu nedenle açılış tetik moleküler mekanizmaları aydınlatma veya BBB kapatılması tedavi önemini nörolojik bozukluklar ve yaygın araştırmacılar tarafından araştırıldı. Ancak, yöntemleri araştırmak için BBB geçirgenliği vivo literatürde bildirilen Floresans görüntüleri17<sup...

Mikrovasküler endotel hücreleri (ECs) Bazal lamina ensheathed olan yakından ilişkili perisitlerden (PCs) ve sonunda ayakları1 ile membran örtmek astrocytes (ACs) tarafından desteklenen, kan - beyin bariyerini (BBB) oluşur ,2. ECs destekleyen ve bariyer fonksiyonu, öncelikle ACs ve PC'ler, düzenleyen birkaç hücre tipleri ile etkileşim ve aynı zamanda sinir hücreleri ve microglia, Bütün bunlar birlikte form nörovasküler birimi (NVU). NVU kan yoluyla toksinlerin ve patojenler beyin girmesini sınırlayan BBB, işlev için önemlidir. Bu işlev mevcut ve taşıyıcılar gibi p-glikoprotein (P-gp) bu sızma endotel girin molekülleri içine geri eylem nedeniyle ECs arasında sıkı kavşak molekülleri claudin-5, occludin, zonula occludens-1, gibi bir sonucudur gemi Lümen1,2,3. BBB ancak besin (glikoz, demir, amino asitler) gibi temel moleküllerin taşıması için özel taşıyıcılar üzerinde EC plazma membran1,2,3ifade tarafından sağlar. EC katman son derece çeşitli taşıyıcılar luminal (kan bakan) ve özel ve vektörel taşıma fonksiyonu4için,5 izin vermek için abluminal (beyin bakan membranlar) arasındaki dağılımı açısından polarize . BBB sıkıca CNS çevre düzenlenmesi ile ilgili koruyucu olmakla birlikte, CNS ilaç dağıtım fonksiyonel BBB ile Parkinson gibi hastalıklarda için büyük bir sorun olduğunu. BBB disfonksiyonu olan nörolojik hastalıklar bile, özellikle bariyer disfonksiyonu örneğin Alzheimer hastalığı (Ah) gibi belirli ışınlama hedefleri zarar dahil olabilir gibi beyin ilaç dağıtım arttığını kabul edemiyor. Yılında, birkaç amiloid beta taşıyıcılar LRP1, öfke, P-gp gibi dysregulated olduğu bilinmektedir ve bu nedenle bu taşıyıcılar hedefleme beyhude6,7,8olabilir. BBB inme, reklam, menenjit, multipl skleroz ve Beyin Tümörleri9,10,11' gibi çeşitli nörolojik hastalıklarda bozulmuş. Bariyer fonksiyonu geri tedavi stratejisinin önemli bir parçasıdır ve böylece onun değerlendirmesi önemlidir.
Bu çalışmada, objektif ve biz başarılı bir şekilde her iki transgenik ve deneysel hastalık modelleri10,12,13 birkaç fare satırlarına uygulanır Rodents geçirgenliği tahlil için nicel protokolü bir tarif var ,14. Yöntem izleyiciler damar yuvası kaldırmak için floresan izleyiciler tarafından farelerin perfüzyon takip basit bir mayi iğne temel alır. Beyin ve diğer organlara toplanan yazı perfüzyon ve nesne tarafından değerlendirildi geçirgenliği ve doku homogenates bir plaka okuyucu Floresans ölçümleri dayalı mutlak geçirgenliği dizin vardır. Tüm ham Floresans değerleri doku homogenates veya herhangi bir izleyici almazsınız sham hayvanlardan serum kullanarak arka plan için düzeltilir. Geniş normalizations serum cilt, serum Floresans ve böylece mutlak ve deneyler ve doku türleri arasında karşılaştırılabilir geçirgenliği dizin oluşturan dokular, ağırlığı dahil edilir. Biz daha önce12gerçekleştirilen vardı gibi gruplar arasında karşılaştırma kolaylaştırmak için mutlak geçirgenliği dizin değerlerini kolayca oranları dönüştürülebilir. Aynı anda, saklı hemi-beyin ve böbrek Floresans mikroskobu10tarafından izleyici görselleştirme için yararlanılabilir. Klasik Floresans mikroskobu geçirgenliği bölgesel farklılığı hantal olsa doku bölümü ve yarı kantitatif analiz için görüntü öznel seçim nedeniyle elde etmek önemli olabilir. Ayrıntılı adımlar iletişim kuralında sunulmaktadır ve notlar uygun olan yerlerde eklenir. Bu başarıyla diğer küçük hayvanlar için ölçeklendirilebilir farelerde vivo içinde geçirgenliği tahlil gerçekleştirmek için gerekli bilgileri sağlar. Tahlil tarayıcıları birçok türde uygulanabilir şarj ve boyutu için izin alarak geçirgenliği değerlendirme tarayıcıları farklı floresan spectra ile kombinasyonu tarafından.

<table><tbody><tr><td>Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (Ketavet)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun)</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% Saline</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldhehyde solution</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>prepare a 4% solution</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, fraction V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rat alexa 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rat alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Aqua polymount</td><td>Polyscience Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>21-gauge butterfly needle</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>serum collection tube</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>2mL eppendorf tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech precision wipes tissue wipers</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>384-well black plate</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>slides superfrost plus</td><td>Thermoscientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PTFE pestle</td><td>Wheaton</td><td>358029</td><td></td></tr><tr><td>electric overhead stirrer</td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>plate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>peristaltic perfusion system</td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vivo blood-brain barrier permeability assay in mice using fluorescently labeled tracers

Kan - beyin bariyerini (BBB) toksinler ve patojenler dolaşımda beyin microenvironment karşı korur ve beyin homeostazı tutar özel bir engeldir. Asıl bariyer sıkı hücreler arası kavşaklar ve plazma membran üzerinde ifade sızma taşıyıcılar bariyer fonksiyonu sonuçları beyin kapiller endotel hücreleri sitelerdir. Bu işlev perisitlerden ve birlikte nörovasküler birimi (NVU) formu astrocytes tarafından düzenlenmiştir. Felç, Alzheimer hastalığı (Ah), gibi çeşitli nörolojik hastalıklar Beyin Tümörleri bir Engelli BBB işlevi ile ilişkilidir. BBB geçirgenliği değerlendirilmesi bu nedenle nörolojik hastalığın şiddeti ve istihdam tedavi stratejileri başarı değerlendirilmesinde çok önemlidir.
Henüz birkaç fare başarıyla uygulanmış olan sağlam geçirgenliği tahlil hem genetik hem deneysel modeller Burada basit bir mevcut. Son derece nicel ve izleyici Floresans analiz tarafından yaygın olarak uygulanan mikroskobu ile karşılaştırıldığında objektif yöntemidir. Bu yöntemde, fareler intraperitoneally sulu etkisiz floresan izleyiciler fareler anesthetizing tarafından takip bir karışımı ile enjekte edilir. Kardiyak perfüzyon hayvanların beyin, böbrek veya diğer organlara hasat öncesinde gerçekleştirilir. Organları homojenize ve centrifuged floresan ölçüm tarafından süpernatant takip. Hemen önce perfüzyon kardiyak ponksiyon çizilmiş kan damar yuvası normalleştirme amaçla hizmet vermektedir. Doku floresan bir nicel elde etmek için ıslak ağırlık ve serum floresan için normalleştirilmiş izleyici geçirgenliği dizin. Ek onay için kontralateral hemi-beyin immünhistokimya için korunmuş izleyici Floresans görselleştirme amaçlar için yararlı olabilir.

Biz son zamanlarda angiopoietin-2 (Ang-2) fonksiyonu kazanç (GOF) fareler daha yüksek beyin damar geçirgenliği kontrol fareler daha sağlıklı koşullar10' olduğunu ortaya koymuştur. Felç indüklenen farelerde Ayrıca GOF fareler daha büyük enfarktüsü boyutları ve daha büyük geçirgenliği kontrol littermates daha vardı gösterir oldu. Bu sonuçlar geçirgenliği BBB, Ang-2 kritik bir rol gösterir. Protokol bu nedenle GOF fareler kullanılmaktadır...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers at JoVE.com

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan - beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

an-vivo-blood-brain-barrier-permeability-assay-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

24.3K Görüntüleme.  Goethe University Hospital. Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan - beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.

Video: An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

Tahmin içinde Vivo Payloads bir kan-beyin tümör-engel bir tabak içinde kullanarak teslim

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Kanser Araştırmaları

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

An<em&gt; In vivo</emKan Gemi Geçirgenlik Test&gt; Test

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Tıp

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Kan - beyin bariyerini geçirgenliği FITC etiketli albümin nörodejeneratif hastalık, bir fare modeli intravenöz infüzyonu tarafından değerlendirilmesi

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

Nörobilim

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

<meta charset="utf8"></head><body>Farelerde Kan-Beyin Bariyeri Parçalanmasının Floresan Boya Bazlı Görselleştirilmesi

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the endothelial barrier dysfunction is related to many salivary gland secretory disorders. The present protocol describes an in vivo paracellular permeability detection method to evaluate the function of endothelial tight junctions (TJs) in mouse submandibular glands (SMG). First, fluorescence-labeled dextrans with different molecular weights (4 kDa, 40 kDa, or 70 kDa) were injected into the angular veins of mice. Afterward, the unilateral SMG was dissected and fixed in the customized holder under a two-photon laser-scanning microscope, and then images were captured for blood vessels, acini, and ducts. Utilizing this method, the real-time dynamic leakage of the different-sized tracers from blood vessels into the basal sides of the acini and even across the acinar epithelia into the ducts was monitored to evaluate the alteration of the endothelial barrier function under physiological or pathophysiological conditions.

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In the present protocol, the endothelial barrier function of the submandibular gland (SMG) was evaluated by injecting different molecular weighted fluorescent tracers into the angular veins of test animal models in vivo under a two-photon laser-scanning microscope.

İn Vivo Fare Submandibuler Bezinde Vasküler Geçirgenlik Tespiti

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

Biyoloji

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of plasma inflammatory markers and bacterial translocation to the spleen and lymph nodes, the gold standard directly quantifies the ability of selected molecules to traverse the gut mucosal layer toward systemic circulation. This article uses a non-invasive, cost-effective, and low-burden technique to quantify and follow in real time the intestinal permeability in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran (FITC-dextran). Prior to oral supplementation with FITC-dextran, the mice are fasted. They are then gavaged with FITC-dextran diluted in phosphate-buffered saline (PBS). One hour after the gavage, the mice are subjected to general anesthesia using isoflurane, and the in vivo fluorescence is visualized in an imaging chamber. This technique aims to assess residual fluorescence in the abdominal cavity and the hepatic uptake, which is suggestive of portal migration of the fluorescent probe. Blood and stool samples are collected 4 h after oral gavage, and the mice are sacrificed. Plasma and fecal samples diluted in PBS are then plated, and the fluorescence is recorded. The concentration of FITC-dextran is then calculated using a standard curve. In previous research, in vivo imaging has shown that fluorescence rapidly spreads to the liver in mice with a weaker gut barrier induced by a low-fiber diet, while in mice supplemented with fiber to strengthen the gut barrier, the fluorescent signal is retained mostly in the gastrointestinal tract. In addition, in this study, control mice had elevated plasma fluorescence and reduced fluorescence in the stool, while inversely, inulin-supplemented mice had higher levels of fluorescence signals in the gut and low levels in the plasma. In summary, this protocol provides qualitative and quantitative measurements of intestinal permeability as a marker for gut health.

In the present study, fluorescein-isothiocyanate-labeled (FITC) dextran is administered to mice via oral gavage to evaluate intestinal permeability both in vivo and in plasma and fecal samples. As gut barrier function is affected in many disease processes, this direct and quantitative assay can be used in diverse research areas.

Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tahmin içinde Vivo Payloads bir kan-beyin tümör-engel bir tabak içinde kullanarak teslim

An

Ayarlama-up bir

Kan - beyin bariyerini geçirgenliği FITC etiketli albümin nörodejeneratif hastalık, bir fare modeli intravenöz infüzyonu tarafından değerlendirilmesi

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

İn Vivo Fare Submandibuler Bezinde Vasküler Geçirgenlik Tespiti

Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi