Yazarlar stabil sıçan Slack-B proteini ifade HEK293 hücrelerin cömert bağış için Yale Üniversitesi&#39;nden Dr Fred Sigworth laboratuvarında Dr Yangyang Yan minnettarız. Ayrıca yazarlar Video tanıtımı görüntülenen Slack kriyo-elektron mikroskopisi homoloji modeli için Dr Sigworth minnettarız. Bu araştırma LKK NIH Hibe DH067517 ve NS073943 tarafından desteklenmiştir

1.. Hücre Kültürü (Fleming ve Kaczmarek 18 uyarlanmıştır) <ol><li> 2 &#39;den büyük, fakat 10&#39;dan daha az ifadeler, bu deneyde kullanmadan önce uygun ortam içinde kültür hücreleri. Kararlı biçimde sıçan Slack-B proteini ifade Transfekte edilmemiş HEK-293 hücreleri ve HEK-293 hücreleri, Leibovitz L-15 Orta% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve antibiyotikler ile takviye edilmiş bir yarım Dulbecco&#39;nun Modifiye edilmiş Eagle ortamında ve bir yarısı yetiştirilmektedir. 500 ug / ml Geneticin (G418) sabit bir şekilde Slack kanalının sentezlenmesi için seçmek üzere Slack-B ifade eden HEK-293 hücrelerine ilave edilir. % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile kaplarından ayrışma ile% 70-90 izdiham Geçiş hücreleri. </li></ol> 2. Fibronektin ve Ovalbumin ile TiO2 384-Optik Biosensor Plate Ekstrasellüler Matriks (ECM) Kaplama <ol><li> Fibronektin ECM karışımına ovalbümin bloke çözeltisinin hazırlanması <ol><li> Fibronect bir çalışma çözeltisi hazırlayın20.0 ml PBS içinde fibronektinin 5 ug / ml &#39;lik bir son konsantrasyon ile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS). Bir 1.0 mg / ml stok konsantrasyonu, bir 200-kat seyreltme için 20.0 ml PBS ile 100 ul ekle. Fibronektin çalışma çözeltisi hazırlandıktan sonra, numune alınır ve -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> , Steril su içinde ısı ile inaktive edilmiş ovalbümin% 5 stok çözelti hazırlayın. % 5 çözeltisi ve steril doku kültürü dereceli su içinde ovalbümin seyreltin, 60 ° C&#39;de 30 dakika süre ile ısı ile inaktive Oda sıcaklığı ile steril filtre çözelti çözüm soğutun. 4 ° C&#39;de% 5 ovalbümin çözeltisi ve mağaza alikotu </li><li> PBS içinde% 5 stok çözelti seyreltilerek ovalbümin% 2 çalışma çözeltisi hazırlayın. Örneğin, 30.0 ml &#39;lik bir son hacim için PBS 18.0 ml% 5 ovalbümin stok çözeltisinin 12.0 ml. </li></ol></li><li> 384 oyuklu optik biyosensör plaka kaplaması <ol><li> 20.0 ul / kuyu ile TiO2 plakasını hidrat15 dakika için steril doku kültürü dereceli su. Aşağıdaki adımlar 16 kanallı bir pipet ile yapılmalıdır. </li><li> Kuyu başına 50.0 ul PBS ile plaka 1x yıkayın. </li><li> Her çukuruna fibronektin çalışma çözeltisinin 20.0 ul ekleyin ve ECM&#39;yi oluşturmak için oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Kuyu başına 50.0 ul PBS ile plaka 1x yıkayın. </li><li> Her bir oyuğa ovalbümin çalışma çözeltisinin 40.0 ul ekleyin ve plaka engellemek için 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Kuyu başına 50.0 ul PBS ile plaka 3x yıkayın. ECM ile kaplanmış levhalar kadar 48 saat boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li></ol> 3. 384-de optik biyosensör Plate üzerine Hücrelerinin tohumlama <ol><li> Hücrelerden büyüme ortamı çıkarın ve plaka hücreleri çıkarmak için tripsin ekleyin. Hücreleri toplamak ve 1 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de santrifüj. Büyüme ortamı içinde tripsin ortam ve hücreler tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> Hemasitometre veya otomatik kullanmahücre sayacı, hücrelerin konsantrasyonunu belirler. </li><li> Inkübasyon sırasında buharlaşma etkisini en aza indirmek için, oyuk başına büyüme ortamı 50.0 ul kullanılacaktır. Hücreler büyüme ortamı 50.0 | il hacminde göz başına hücrelerin istenen sayıda elde etmek için seyreltilmelidir. Bu deneyler için, 1,000 hücre / çukur biyosensör üzerine kaplandı. </li><li> Serpilen hücreleri, hava /% 5 CO2 altında 37 ° C&#39;de büyüme ortamı içinde bir gece boyunca inkübe izin verin. </li></ol> 4. RWG&#39;nin Optik Biosensor Testi için Biosensor ve Bileşik Plakaların hazırlanması <ol><li> Inkübatör plaka kaldırmak ve hücrelerden büyüme ortamı çıkarın. Hücreler Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) ile 1x yıkayın. Her bir oyuğa HBSS 25.0 ul ekleyin. </li><li> BIND Tarayıcı üzerinde biyosensör plakayı ve hücreler, 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. </li><li> Ilgi ligandları reklam olacak ayrı bir bileşik tabak hazırlayıntahlil sırasında biyosensör plakasına ded. Bu deneyler için, çözelti içeren bileşiğin 25.0 ul 50.0 ul toplam hacim için biyosensör plaka üzerinde her bir oyuğa ilave edildi. Bu nedenle, çözelti içinde 2x bileşikler, arzu edilen nihai konsantrasyon hazırlanmıştır. </li></ol> 5. RWG&#39;nin Optik Biosensor Testi gerçekleştirin <ol><li> Iyi BIND Tarama yazılımını kullanarak her merkezi 1.5 mm için 3.75 mm / piksel maksimum çözünürlük kullanılarak kuyu A1-P12 (SBS 384-plaka yarısı) için Scanner sistemi ile temel ölçü almak. Bu temel tarama yaklaşık 30 dakika sürer. </li><li> Kuyu A1-P12 için her bir oyuğa bileşik çözümler 25.0 ul ekleyin. </li><li> Kuyular A13-P24 bir temel ölçü almak. </li><li> Kuyu A13-P24 için her bir oyuğa bileşik çözümler 25.0 ul ekleyin. </li><li> Kuyular A1-P12 için bir post bileşik ilave ölçüm alın ve kuyular A13-P24 için tekrarlayın. </li></ol> 6. ABIND Manzaralı Deneyi Veri nalysis <ol><li> Windows başlangıç ​​ölçümü için BIND tahlil verileri açın ve hücre seçimi etkinleştirmek için &quot;Izgara Editör&quot; butonuna tıklayın. Yazılım kullanıcı tarafından tanımlanan ilgi ölçümleri hesaplamak olacaktır. </li><li> &quot;Hücre Finder&quot; ve &quot;baseliner&quot; fonksiyonu vardır &quot;Plug-ins&quot;, açın. &quot;Hücre Finder&quot; set parametreler hücreler biyosensör kökenli ayırt böylece. </li><li> Bazal ölçüm için &quot;Hücre Finder&quot; verileri içeren hücre harita dosyası ihracat. </li><li> Tekrar sonrası bileşik ilave veriler için 6,1-6,2 adımları. </li><li> &quot;Baseliner&quot; plug-in açın ve taban ölçümünün hücre harita ithalat. Yazılım plan ve sonrası bileşik veri arasındaki PWV yılında vardiya hesaplamak olacaktır. </li><li> Hücreler için PWV yılında ortalama vardiya çıkışı için &quot;Δ Cep Mean&quot; seçeneğini seçin. Veriler daha sonra Microsoft Exc ihraç edilebilirdaha fazla analiz için el. </li></ol>

<ol>
	<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels of Excitable Membranes. , (1992).</li><li>Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conducting+functions+of+voltage-gated+ion+channels.">Non-conducting functions of voltage-gated ion channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).</li><li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels.">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li><li>Shamah, S. M., Cunningham, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell-based+assays+using+photonic+crystal+optical+biosensors.">Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors.</a> Analyst. 136, 1090-1102 (2011).</li><li>Cunningham, B. T., Laing, L. M. i. c. r. o. p. l. a. t. e. -. b. a. s. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+detection+of+biomolecular+interactions:+applications+in+proteomics.">label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics.</a> Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).</li><li>Cunningham, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+assays+on+the+BIND+system.">Label-free assays on the BIND system.</a> J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).</li><li>Hessel, A. a. O., A, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Theory+of+Wood's+Anomalies+on+Optical+Gratings.">A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings.</a> Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).</li><li>Cunningham, B. T., Laing, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+application+of+label-free+detection+assays+in+drug+screening.">Advantages and application of label-free detection assays in drug screening.</a> Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).</li><li>Lee, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+optical+biosensor:+a+tool+for+G+protein-coupled+receptors+pharmacology+profiling+and+inverse+agonists+identification.">Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).</li><li>Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+K++channels,+Na++is+the+new+Ca2.">For K+ channels, Na+ is the new Ca2.</a> Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).</li><li>Santi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+regulation+of+Slick+and+Slack+K++channels+by+neuromodulators.">Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators.</a> J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).</li><li>Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slack+and+Slick+K(Na)+channels+regulate+the+accuracy+of+timing+of+auditory+neurons.">Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons.</a> J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel.">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels.">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).</li><li>Barcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+gain-of-function+KCNT1+channel+mutations+cause+malignant+migrating+partial+seizures+of+infancy.">De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy.</a> Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).</li><li>Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+biosensors+to+detect+modulation+of+Slack+potassium+channels+by+G+protein-coupled+receptors.">Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).</li><li>Nelson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins.">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li><li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data.">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li></ol>

Steven M. Shamah X-BODY Biyobilimlerdeki bir çalışanıdır.

Z ana (Z &#39;) faktör yüksek verimli bir tarama deneyinde 20 kalitesini ölçmek için yaygın istatistiksel bir yöntemdir, ve bu tahlilde GPCR agonistlerinin tarama bir SBS uyumlu bir 384 tahlilinde oluştuğu için, mükemmel bir sağlar Bu deneyde 21 sağlamlık ve geçerlilik ölçüsü. 1 AZ &#39;değeri varolmayan standart sapmalar ile veri noktaları sonsuz sayıda bir teorik ideal bir tahlil gösterir. 0.5 &#39;in altında bir marjinal bilgi deney dikkate ile 0,5-1 arasında bulunan AZ&...

Bunların fizyolojik olarak ilgili bağlamda canlı hücrelerin incelenmesi, hücresel hedefler biyolojik fonksiyonları anlamak için çok önemlidir. Bununla birlikte, kanal ve bu coimmunoprecipitation tahlilleri gibi düzenleyici sitoplazmik proteinler arasındaki etkileşimi incelemek tahliller, genel olarak, canlı hücrelerde etkileşimler zaman süreci ile ilgili çok az bilgi sağlar. Mevcut hücre bazlı deneylerde büyük bir çoğunluğu bu ilgi bir floresan etiketli proteinin translokasyon gibi belirli bir hücresel etkinlik, ölçün. Bu deneyler, potansiyel proteinin davranışını değiştirebilir ve hedefin fizyolojik önemi azaltabilir, ilgi konusu proteinlerin modifikasyonları gerektirir. , Sistemin işleme gerektiren hücresel aktivite sürekli bir ölçümünü sağlar ve en uygun durumda fizyolojik olarak 4 hücre çalışmaları izin vermez invaziv olmayan hücre bazlı deneyler,. Optik biyosensörler üretmek için tasarlanmıştırsensör yüzeyine birleştirilmiş olan bir ışık karakteristik bir değişiklik ölçülebilir. Yüzey plazmon rezonansı (SPR) ile rezonans dalgaboyu ızgara (RWG) teknikler kaybolan dalgalar kullanan optik biyosensörler, öncelikle sensör yüzeyi üzerinde hareketsizleştirilmiş biyolojik reseptörlerine bağlanma moleküllerinin afinite ve kinetik tespit etmek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanda, ticari olarak temin edilebilir RWG biyosensörler yüksek uzamsal çözünürlük (en fazla 3.75 mikron / piksel) 5 de sensor yüzeyine yapışık hücre alt kısmı içinde kütlesindeki nispi değişimin saptanmasına olanak tanınması için geliştirilmiştir. Bu biyosensörler, hücre yapışması ve yayılması, toksisite, çoğalması ve G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler) de dahil olmak üzere hücre yüzeyi reseptörlerinin çeşitli tarafından ortaya çıkarılan sinyal yollarının olarak uyarılması sonucu canlı hücreler, plazma zarı yakın kütle değişiklikleri saptayabilir 6 . İÇG biyosensörler göreli chan tespitbiyosensör 7, 150 nm olan kütlesindeki nispi değişimin bir fonksiyonu olarak kırılma endeksi ge. Hücreler biyosensör için kaplama zaman, kırılma endeksi, bu değişiklik, biyosensör için hücresel yapışma içinde değişimden ortaya çıkan hücrenin plazma zarının yakın kütle değişimi yansıtır. Bu protokol RWG&#39;nin biyosensörler kullanarak kanal-protein etkileşimlerinin algılama tartışılacaktır. RWG&#39;nin veri toplama sistemleri birçok bileşenden oluşur. X-BODY Bıoscıences BIND Tarayıcı Bu deneyler için kullanılan Çünkü, biz bir plaka okuyucu, ilişkili biyosensör, BIND Tarama toplama yazılımı ve BIND Görünüm analiz yazılımı 8 oluşan bu özel sistem için bileşenleri ifade eder. Fotonik kristal biyosensörler, optik biyosensörler değinilmektedir, bir periyodik düzenlemesi oluşan belirli bir ışığın ilerlemesini önler 2 ya da 3 boyutlu olarak ve dielektrik malzemedalga boyları ve yönleri. Fotonik kristal yapılar Wood&#39;un anomali denilen bir olgu dayanmaktadır. İlk olarak 1902 yılında Wood tarafından keşfedilen, anormallikler, özellikle kırılma siparişinin yoğunluğunda hızlı değişimler belirli dar bir frekans bantlarında meydana optik kırılma ızgarası ile yansıtılan ışığın spektrumunda gözlenen etkileri vardır. 1962 yılında, Hessel ve Oliner sonlu dönemi ızgara ayakta rezonans dalga boyu 9 oluşturduğu, Wood&#39;un anomalilerin yeni bir teori sundu. Burada tarif edilmiş olan optik biyosensör olarak, Wood anomalileri beyaz ışık ile uyarıldığında dalga boyu, sadece çok dar bir bant (tipik olarak 850-855 nm) yansıttığı bir RWG&#39;nin biyosensör üretmek için kullanılır. Bireysel biyosensörler yüksek kırılma dielektrik malzemesi titanyum dioksit (TiO 2) ince bir tabaka ile kaplanmış olan bir periyodik bir yüzey yapısına sahip, düşük kırılma indeksli bir plastik malzemeden oluşur. Ne biosensveya Fotonik kristallerin optik ızgara BIND Tarayıcı bir spektrofotometre ile ölçülür ışığın dalga boyu dar bir aralık yansıtan geniş bir dalga boyu ışık kaynağı ile aydınlatılır. Yansıyan dalga boyunda (tepe değer Dalga boyu veya PWV) zirve yoğunluğu daha sonra sinyalden hesaplanır. Biosensor yüzeyin yakınlık içinde kütlesinde bir artış veya azalma (~ 150 nm) bir sonucu olarak kırılma indisindeki bir değişiklik, üzerine hafif kaymaların PWV. Optik biyosensörler Biyomoleküler Sciences için standart Derneği (SBS), bu deneylerde kullanılan deneyleri için 384 oyuklu mikro-plaka içine dahil edilmiştir. RWV biyosensörler hücreleri 10 oturma eksojen sinyallerinin eklenmesi üzerine değişiklikleri tespit etmek için kullanılır. Hücreler doğrudan RWG&#39;nin biyosensör yüzeyi üzerine kültürlenir ve kırılma yerel endeksinin değişimi belli bir uyarana ile işlenmesi üzerine izlenir. Biosensör kütle değişikliği yön olabilirYerel biosensör yakın kütlesinde bir artış kırılma endeksi ve sonuç olarak bir artış PWV bir artış olarak ölçülür, çünkü belirlenmiştir. Tersine kütlesinde bir azalma PWV bir düşüş üretir. Tespit PWV değişiklik hücre yapışması değişiklikler, protein işe / serbest bırakılması, endositoz ve geri dönüşüm, ekzositoz, apoptoz ve hücre iskeleti yeniden düzenlenmesi de dahil olmak üzere çok sayıda hücresel olaylar, neden olabilir. Örneğin, tahlil, potasyum kanallarını ve diğer sitoplazmik ya da hücre iskelet yapısı arasında kanal-protein etkileşimleri değişiklikleri tespit edilebilir. Olay, ancak, biosensör yakın ~ 150 nm saptama bölgesi içinde meydana gelir ve plazma zarı yakın bağlı bir hücrenin, söz konusu olmalıdır. Hücresel tepkilerin kazanılması BIND Scan yazılımı ile gerçekleştirilir ve SBS levhadaki 384 kuyu her bir görüntü gösterimi oluşturulur. Bu sistem tek bir hücre içinde olayların tespitine olanak sağlayan, en fazla 3.75 mm / piksel çözünürlüğe sahip ve(örneğin, HEK293 ya da CHO hücreleri gibi) hücre hatları ile birlikte ya da daha fazla fizyolojik olarak uygun primer ya da hücreleri ile kullanılabilir. BIND görüntüle, yazılımı ile görüntü analizi ve bireysel hücre popülasyonları hem de hücresel yanıtları saptanmasını sağlar. Biyosensörler mikro 384 oyuklu standart SBS dahil edilir olarak, sistem, yüksek verimli tarama (HTS) için kolayca uyarlanabilir. Rezonans-dalga boyu ızgara optik biyosensörler önce GPCRs 11 aktivasyonu, aşağıdaki hücrelerin plazma zarı yakın kütle değişiklikleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bizim laboratuvar iki sodyum-aktif (K Na) potasyum kanalları, Slack-B ve Slick 12 klonlanmış oldu. Her iki B-Fren ve kaygan kanallarının aktivitesi çok güçlü bir protein kinaz C (PKC) aktivasyonu 13 doğrudan etkilenmiş olduğu gösterilmiştir. Bu tür muskarinik M1 reseptör ve mGluR1 metabotropik glutamat olarak R Gα q protein bağlı reseptörler, aktivasyonuçifti donörlüğü, kuvvetli PKC aktivasyonu yoluyla kanal aktivitesini düzenler. Bu K, Na kanal tutmalı uyarılması esnasında nöronal uyum katkı ve eylem zamanlama hassasiyeti 14 potansiyeller düzenler. Slack kanalları FMRP, Fragile X Zihinsel Engelliler protein 15,16 dahil sitoplazmik sinyal molekülleri, çeşitli etkileşim bilinmektedir. Bebeklik (MMPSI), ağır gelişme geriliği 17 sonuçları epilepsi erken başlangıçlı formu Çoklu Geçiş Kısmi Yakalanan Gevşek sonucu mutasyonlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Geneticin G-418 Sulfate</td>
			<td style="width:172px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB05057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">HBSS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DPBS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Carbamoylcholine chloride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Finnpipette (5-50 &#181;l)</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4662090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIND Scanner System</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384-well TiO2 coated plates</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">TiO-96-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of label-free optical biosensors to detect modulation of potassium channels by g-protein coupled receptors

İyon kanalları seçici iyonları, plazma zarının 1 akmasına izin vererek, nöronlar ve diğer uyarılabilir hücre tiplerinin elektrik özelliklerini kontrol eder. Nöronal uyarılabilirliği düzenlemek için, iyon kanallarının biyofiziksel özellikleri çoğu zaman bir heteromerik kompleks kanal 2,3 oluşturmak için kanallar kendilerini bağlayan protein ve sinyal molekülleri tarafından modifiye edilir. Canlı hücrelerde etkileşimler zaman süreci hakkında az bilgi sağlarken kanalları ve düzenleyici proteinleri arasındaki etkileşimi incelemek geleneksel deneyler, potansiyel olarak proteinin davranışını değiştirebilir ve hedefin fizyolojik önemi düşürebilir dışsal etiket gerektirir. Örneğin X-BODY Bıoscıences BIND Tarayıcı sistem olarak optik biyosensörler, rezonans değişiklikleri algılamak için, yeni bir etiket içermeyen teknoloji, rezonans dalga boyu ızgara (RWG) optik biyosensör kullanmak biyosensör yakın ışık yansır. Bu deney sağlar: göreceli algılamahücre yapışmasında ligand bağlı değişiklikler ve yayılma, toksisite, proliferasyon ve plazma zarı yakın protein-protein etkileşimleri değişikliklerden kaynaklanan biyosensör yüzeyine yapışık canlı hücre alt kısmı içinde kütle olarak değiştirin. RWG&#39;nin optik biyosensörler G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler), reseptör tirozin kinazlar ve diğer hücre yüzeyi reseptörlerinin aktivasyonu takiben hücrelerin plazma zarı yakın kütle değişiklikleri tespit etmek için kullanılmıştır. Iyon kanalı-protein etkileşimleri Ligand ile uyarılan değişiklikler de bu tahlil kullanılarak incelenebilir. Bu yazıda, Slack-B sodyum-potasyum aktive GPCRs tarafından (K Na) kanalları modülasyonu algılamak için kullanılan deneysel prosedür anlatacağız.

Slack-B kararlı biçimde HEK-293 hücreleri transfekte edilmiş ve kontrol transfekte HEK-293 hücreleri de 384, ECM kaplanmış RWG biyosensör plakalar üzerinde 1000 hücre / tohumlanmıştır. Biyosensör merkezi 1.5 mm 2 Görüntüler 3.75 mm / piksel çözünürlükte (Şekil 1) kaydedildi. Kütlenin yoğunluk gradyan haritaları önceden oluşturulan ve BIND Scan yazılımı ile 30 dakika sonrası bileşik ilave edildi. BIND View yazılımı temel PWV gelen PWV sonrası bileşik ek ç...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors at JoVE.com

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Optik biosensor teknikleri canlı hücrelerin içindeki plazma zarının hemen yakınındaki kütlesinde değişiklikleri algılar ve bir tek hücre ve hücre popülasyonları hem de hücresel yanıtları takip izin verebilir. Bu protokol, bu yaklaşımı kullanarak sağlam hücrelerdeki G-protein bağlı reseptörler ile potasyum kanallarının modülasyonu algılanmasını anlatacağız.

G-protein bağlı reseptörler ile Potasyum kanallarının modülasyonunu Algılama Label içermeyen optik Biyosensör kullanımı

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

use-label-free-optical-biosensors-to-detect-modulation-potassium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Görüntüleme.  Yale School of Medicine.  Optik biosensor teknikleri canlı hücrelerin içindeki plazma zarının hemen yakınındaki kütlesinde değişiklikleri algılar ve bir tek hücre ve hücre popülasyonları hem de hücresel yanıtları takip izin verebilir. Bu protokol, bu yaklaşımı kullanarak sağlam hücrelerdeki G-protein bağlı reseptörler ile potasyum kanallarının modülasyonu algılanmasını anlatacağız. 

Video: Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Silan Kaplin Ajanlar kullanarak Silika Optik Biyosensörler için Biyolojik Probları takılması

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Biyomühendislik

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optik Algılama<em&gt; E. coli</emMezopor Silikon Biyosensörlerin tarafından&gt; Bakteri

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

Biyomoleküler etkileşimleri algılamak için bir Conductimetric Biyoalgılayıcı β-lactamase tabanlı tahlil kullanımı

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations and development of microstructurally motivated mathematical models for understanding the mechanical properties of human resistance arteries in health and disease have the potential to aid understanding how disease and medical treatments affect the human microcirculation. To develop these mathematical models, it is essential to decipher the relationship between the mechanical and microarchitectural properties of the microvascular wall. In this work, we describe an ex vivo method for passive mechanical testing and simultaneous label-free three-dimensional imaging of the microarchitecture of elastin and collagen in the arterial wall of isolated human resistance arteries. The imaging protocol can be applied to resistance arteries of any species of interest. Image analyses are described for quantifying i) pressure-induced changes in internal elastic lamina branching angles and adventitial collagen straightness using Fiji and ii) collagen and elastin volume densities determined using Ilastik software. Preferably all mechanical and imaging measurements are performed on live, perfused arteries, however, an alternative approach using standard video-microscopy pressure myography in combination with post-fixation imaging of re-pressurized vessels is discussed. This alternative method provides users with different options for analysis approaches. The inclusion of the mechanical and imaging data in mathematical models of the arterial wall mechanics is discussed, and future development and additions to the protocol are proposed.

We describe simultaneous mechanical testing and 3D-imaging of the arterial wall of isolated, live human resistance arteries, and Fiji and Ilastik image analyses for the quantification of elastin and collagen spatial organization and volume densities. We discuss the use of these data in mathematical models of arterial wall mechanics.

Canlı, insan direnç arterler tarafından etiket içermeyen Floresans mikroskobu kolajen ve Elastin basınç bağımlı Microarchitectures değerlendirilmesi

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...