This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

Tek moleküllü tweezing için RNA moleküllerinin hazırlanması 1. <ol><li> Ilgi duyulan dizilimi klonlanması. Bir vektör, RNA yapıya tekabül eden DNA dizisini Clone. </li><li> Sentez ve transkripsiyon şablon saflaştırılması. PCR ile bir transkripsiyon şablonu sentezlemek. [Burada yer Tablo 1] Şimdi, bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünlerinin saflaştırılması ve&gt; 200 ng / ul örnek konsantre edilir. Saflaştırılmış DNA, transkripsiyonu için kullanıldığı için, RNazsız su yıkama ve konsantrasyon adımları kullanılmalıdır. </li><li> In vitro transkripsiyonu ile. RNA, verimi maksimize etmek için gece boyunca 37 ° C&#39;de in vitro transkripsiyon RNA sentez. Transkripsiyondan sonra [burada yer tablo 2], I, 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca DNA şablonu sindirimi 1 ul DNase ekleyin. Bir silis kolonu kullanılarak eğirme RNA&#39;yı saflaştırmak. </li><li> Biyotinile edilmiş kol sentezi A. Üretim, astar Af ve Ar ve konsantre kullanılarak PCR ile modifiye edilmemiş kol imaliAmplifiye DNA&gt; 200 ng / | il için entrate. Daha sonra, bir primer uzatma reaksiyonu kullanılarak PCR ürünü içine biyotin modifikasyonlar. [Yer tablo burada 3] Not: biyotinile edilmiş bir kolu (biyotin-HA) saflaştırılmadan doğrudan tavlama kullanılabilir. Biyotin-HA RNA ile tavlanmış edilmesi olduğu için, her iki adımda RNazsız su kullanımı için çok önemlidir. </li><li> Digoksigenin modifiye sapın B. Sentez Sentez astar Bf ve digoksigenin-modifiye oligo Dig-Br (Şekil 3) kullanılarak PCR ile kolu B (kazı-HB) modifiye Digoxigenin. Daha sonra, PCR ürünü saflaştırmak ve&gt; 200 ng / ul örnek konsantre edilir. </li><li> Kolları için tavlama RNA. Kulplu RNA tavlamak. [Burada yer Tablo 4 ve 5] </li><li> Tavlı örnek arındırın. Tavlanmış numunenin 3 hacim etanol ekleyin ve iyice karıştırın. En az 1 saat boyunca -70 ° C&#39;de saklayın karışımı. 15,800 xg&#39;de Spin ve süpernatant atın. Bir toz haline kullanılarak topak ile kurutun. Pelet çözülür100 ul RNazsız su. Not: Örnek kullanılmaya hazırdır ve -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Optik Cımbızlar 2. Kalibrasyon ve Operasyon <ol><li> Video Monitörü Piksel Boyutu kalibre <ol><li> Tuzak bilinen çapı (boyut standart) ile bir boncuk optik tuzak kullanın. </li><li> Görüntüleme yazılımı kullanarak bir tuzak boncuk Yakalama görüntüleri (Şekil 4). </li><li> Ağırlık merkezi yöntemine göre görüntüleme yazılımı kullanılarak kordonun çapı belirlenir. </li><li> Farklı boyutta boncukların çapları belirlemek için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Bir pikselin fiziksel boyutunu elde etmek üzere doğrusal regresyon ile boncukların ölçülür ve bilinen çapları takın. </li></ol></li><li> Mesafe Kalibrasyon doğrulayın <ol><li> Tuzak bir boncuk optik tuzak kullanın. </li><li> Görüntü yakalama yazılımı tarafından sentroid piksel konumunu belirlemek ve Minitweezers kullanarak konumunu kaydedin. </li><li> Diffe için boncuk Steer<html> pozisyonları kira ve pozisyon tayinini tekrarlayın. </li><li> Kalibre piksel boyutunu kullanarak m birimine piksel boncuk, X ve Y konumlarını dönüştürün. </li><li> Video ile ve Minitweezers tarafından ölçülen pozisyonları arasındaki X ve Y karşılaştırın. Değerleri iki grup anlaşmalıdır. Görüntü çözünürlüğü&gt; 0.1 mikron olduğu, doğruluğunu sağlamak için ölçümler arasındaki 1 mikron üzerinde boncuk hareket. Mesafe kalibrasyon Minitweezers saklanan bir karşılaştırılabilir değilse, aleti kalibre edin. </li></ol></li><li> Tuzak Sertlik Kalibrasyon <ol><li> Optik tuzak kullanarak boncuk yakalamak ve hala tutun. </li><li> 3 sn için bir oran&gt; 5 kHz bir baypas hızlı veri toplama kullanarak tuzak kuvveti kaydedin. </li><li> Yazılımını kullanarak boncuk hareket kaydından bir güç spektrumu oluşturmak. Lorentz (Şekil 5) 38 güç spektrumu Fit: 542 / 51542eq1.jpg &quot;width =&quot; 200 &quot;/&gt; (Denk. 1) burada S (f) f frekans gücü, f c köşe sıklığı, ve S 0 asimptotik güçtür. Köşe frekansı, c, f termal hareketinin güç asimptotik değerinin yarısına düşmüştür sıklığıdır. F c lazer güç ve boncuk boyutuna göre değişir gibi, tek tek her bir tuzak boncuk kalibre. </li><li> F c tuzak yay sabitini, κ, hesaplayın: <img alt="Denklem 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (Denk. 2) burada γ boncuk (Denk. 3) arasında sürtünme katsayısıdır. Kuvvet değişimi bir RNA uzantısı değişikliklerini saptamak için yay sabitini kullanın. </li></ol></li><li> Stokes Kanunu Testi <ol><li> Optik tuzak kullanarak bir boncuk yakalayın. -Geri kuvvet boncuğu taşı farklı hızlarda. </li><li> Boncuk hareketlerini kaydetmek ve Minitweezers kullanarak zorlamak. </li><li> Boncuk yarıçapını hesaplayın. Not: sürtünme kuvveti, F d, bir akışkan içinde bir parçacığın küresel hareketi tarafından üretilen Stokes hakları ile tarif edilebilir: <img alt="Denklem 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (Denk. 3) burada r kürenin çapı, v hız ve h referans tabloları bulunabilir, akışkan dinamik viskozitesidir. F d olarak ölçülen kuvvet kullanarak, kordonun uzunluğu Denklem kullanılarak hesaplanabilir. 3 (Şekil 6) ve görüntü alma yazılımı tarafından belirlenen bu kabul edilmelidir. Stokes yasası testi etkili bir genel kalibrasyon ve aracın performansını test eder. </li></ol></li></ol> Tek bir RNA molekülünün 3. Nanomanipulation <ol><li> Fluidics yapma. <ol><li> No 2 kapak camı ile altı delik (2 mm çapında her biri) ile (Şekil 7) ve matkap (7b Şekil) bir lazer gravür kullanarak, çift taraflı bant poliimid üç tane yarık (2 mm kalınlığında) kesilir. </li><li> Çift taraflı bant Kapton iki kat cam tabaka iki sandviç tarzı bir akış bölme yapın. Bant (Şekil 7c) arasında bir mikropipet ve iki baypas tüpleri yerleştirin. </li><li> Akışkan delikleri (Şekil 7d) eşleştirerek bir metal çerçeve üzerine akış odasına monte edin. </li><li> Polietilen boru donanımları (Şekil 7e) ile seçilen tampon ile doldurulmuş 10 ml &#39;lik şırıngaya bölmenin akışkan kanalları bağlayın. </li><li> İki amaçları arasındaki optik cımbız üzerine tüm odasını monte edin. Akışkan kanalları bölmenin ön sağa baktığından emin olun. Objektif çekin ve t montaj delikleri çerçeve (Şekil 7e) içinde pirinç işaretçilerine fişidiye cımbız. Odacık konumunu düzeltmek için vidaları sıkın. </li></ol></li><li> Tavlanmış örnek ve boncuk Karıştırma. , Anti-digoksijenin kaplı boncuklar (DIG-boncuklar) ile tavlanmış örnek karıştırın ve karışım 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında kalmak sağlar. Tipik olarak, tavlanmış numunesinin 1 ul, 1 ml tampon içinde 5 ul Kazı-boncuklar ile karıştırılır. Not: boncukların miktarı, akış bölme içine yüklenecek boncukların makul bir miktar baypas boru teslim edilecek sağlamak için seçilmelidir. Tanelere tavlanmış numune oranı kolaylıkla tahmin edilemeyen. İdeal durumda, çoğu boncuk boncuk, sadece küçük bir bölümü boncuk başına sadece bir RNA molekülü olabilir öyle ki herhangi bir RNA sahiptir. Tavlanmış örnekler ve boncuk süspansiyonu ölçmek zor olduğu için, tek yolu, şu anda ve karışım oranını değiştirmek ve cımbız üzerindeki karışımın test etmektir. </li><li> Mil üstüne, yani, (nolu akış odacığı içinde bir reaksiyon sitesi için birkaç mikrometreden boncuk sununcropipette ucu, Şekil 7C). <ol><li> 1 ml&#39;lik bir şırınga içine streptavidin kaplı boncuklar (strep boncuklar) bir süspansiyonu yerleştirin. </li><li> Akış odası (Şekil 7a) alt kanalına giden akışkan borusuna enjektörü. </li><li> Odasına strep boncuk akmasına şırınga itin. </li><li> Alt baypas borusunun (Şekil 7b) bir açıklığın yakınında optik tuzağı motor kontrol yazılımı kullanılarak bütün bölmesini hareket ettirin. Sonra bir strep boncuk yakalamak için bir topunu ile optik tuzak çalışır. </li><li> Motor kontrol yazılımı kullanılarak mikropipet ucuna yakın boncuk hareket ettirin. </li><li> Mikropipet üzerine boncuk emmek için mikropipet bağlı şırıngayı çekin. </li><li> Ekstra strep boncuk dışarı atılması için orta kanala şırınga basarak hafifçe akışını uygulayın. </li><li> Benzer şekilde, numunenin karışımını odanın üst kanala kazı-boncuk (adım 3.2) sağlar. </li><li> Bir kazı-boncuk yakalamak ve optik tuzak kullanarak strep boncuğa o yakın getirmek. </li><li> Akışı uygulanmak suretiyle, orta kanal temizleyin. Not: strep- ve mikroskopik altında görsel olarak ayırt edilebilir, böylece boncuklar dig farklı boyutlarda olacak şekilde seçilir (Şekil 4). </li></ol></li><li> Balıkçılık &quot;bir çift boncuk ile cepheye tek molekülü. <ol><li> Strep boncuk (Şekil 4) üzerine dikey olarak DIG-boncuk yerleştirin. </li><li> Tuzak direksiyon aşağı strep boncuk doğru kazı-boncuk taşıyın. Kuvvet değişiklikleri görselleştirmek için bilgisayarda bir kuvvet-mesafe arsa penceresini açın. </li><li> Iki boncuk temas üzerine, dikey olarak uzak strep topuk kazı-boncuk hareket eder. </li><li> Belirli bir temas olursa, kuvvet, neredeyse sıfır kalır. İki molekül boncuklar ile bağlı, kuvvet önemli ölçüde artırır iki boncuk ayrıldığında. Genel olarak &quot;balık&quot; olarak anılacaktır Bu işlem, çoğu zaman perfboncuk her çift ormed birden çok kez etkili bir tek-molekül urgan bulmak için. </li></ol></li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

<html> Tweezing Örnekleri Hazırlanmasında Modifikasyonu ve Sorun Giderme Klonlama Vektör seçimi. Burada tarif edilen genel şema (Şekil 3), özel bir klonlama vektörü gerektirmese de, vektör, bir promotör istenilen pozisyonlarda durmasıyla PCR yoluyla dahil edilebilir şekilde transkripsiyonun kolaylığı için içsel T7 veya T3 için tercih edilmemektedir. Dizi ve Kolları Uzunlukları. Kolları içi...

Optik cımbız tekniğinin gelişmesi uzun biyolojik araştırma uygulaması ile eşlik etti. Optik yakalama etkisi ilk keşfedildiği zaman, Arthur Aşkın kirli suda bakteri lazer odak 1 sıkışan olamayacağı görülmektedir. O zamandan beri, bakteri biyofizik öğrenci nesiller için bir kasıtsız, eğlenceli deney yanı sıra mikrobiyal fizyoloji 2,3 incelemek için ciddi bir araştırma aracı haline gelmiştir hapsi. Optik yakalama tekniği mikroskobik 1 nesne hareketsiz hale getirmek için odaklanmış bir lazer ışını kullanır. Pratik olarak, aynı zamanda, tutucu (koyup Dx) merkezinden yer değiştirmesi tarafından tuzağa nesne üzerinde bir kuvvet (F) ölçen bir optik yayı gibi bir lazer tuzak çalışır. Κ kısa bir aralıkta, F = κ x Dx, içindeki tuzak yay sabittir. Optik tuzak MICROS için picoNewton (PN), kesinlik kuvvet uygulamak için kullanılabilirCopic nesne ve nanometre (nm) doğrulukla konumunu ölçmek. Son yirmi yılda, optik cımbız biyofizik en çok kullanılan tek-molekül tekniklerinden biri haline gelmiştir. Tekniği katlama ve DNA 4-6, RNA 7-9 ve proteinlerin 10,11 mekaniğini incelemek için istihdam edilmiştir. Optik cımbız da DNA replikasyonunu 12 RNA transkripsiyonu 13, 14,15 ve protein sentezi, hem de diğer birçok biyomoleküler bir etkinlik 16-18 gözlemlemek için kullanılmıştır. Tek molekül yaklaşımlar esas RNA engebeli katlama enerji manzara keşfetmek için RNA yapısal araştırma istihdam edilmektedir. Bir RNA dizisi nedeniyle genellikle RNA basit kimyasal bileşimi ve baz soyma kurallarına, birden fazla istikrarlı, birbirini dışlayan yapılar içine kat edebilirsiniz. Uzun RNA yapısal polimorfizm, bu riboswitches 19,20 meydana gelir, örneğin, gen regülasyonunda önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Bir recent genom anket birkaç derece büyük ölçüde hücresel transcriptome 21 büyük bir kısmının yapısı ve protein sentezini etkileyen kadar küçük ki sıcaklık değişimlerini ortaya koymuştur. Bu örnek, daha önce tahmin edilenden daha alternatif RNA katlama biyolojik rolü belki de daha önemli ve yaygın olduğunu ipuçları. Yapısal polimorfizm, ancak birçok moleküllerinin ortalama özelliklerini incelemek geleneksel biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlar için bir sorun teşkil etmektedir. Örneğin, &quot;üzerinde&quot; bir riboswitch bir &quot;kapalı&quot; konformasyonlar bağdaşmıyor. Heterojen bir yapı elde edilen bir ortalama yapısı biyolojik ilgili şekillerin ya da benzer olası değildir. Ayrıca, çevrilmemiş RNA ve mRNA genellikle yapılar oluştururlar. Proteinler ve düzenleyici RNA&#39;lar ile etkileşimi yaygın etkileşimin bir parçası olarak mevcut yapının açığa çıkmasını gerektirir. Bu nedenle, RNA açılma / yeniden katlanmasını okuyan bir ilgili olurRNA biyoloji sorunu. Böyle bir sorun karşılamak için, tek-molekül yaklaşımı bir anda 22-27 az bir molekül okuyan RNA yapısal polimorfizmini çözülmeye istihdam edilmiştir. Popüler tek molekül fluoresans yöntemiyle karşılaştırıldığında, açılma mekanik göre cımbız tek tek moleküller konformasyonları uygulanan kuvveti ile manipüle edilebilir ve nanometre hassasiyetle ölçülebilir bir avantaj sağlar. Bu özellik, büyük nanomanipulation RNA hiyerarşik katlama 28 kesilmiş olabilir, bireysel yapısal alanın açılma / katlanır izlemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, bir tek elyaf birçok konformerlerin birine katlanmasına yönelik olabilir; veya mevcut yapıya mekanik olarak farklı bir konformasyona 29 içine yeniden kapatmak için indüklenebilir. Biyolojik şartlar altında, bir RNA yapısı sıcaklık değişimi veya ligand bağlanması üzerine değiştirilebilir. Doğrudan manipüle moleküler s yeteneğikırılmalardan RNA yapısal çalışmanın yeni bir mekan açılıyor. Prensip olarak, böyle bir atomik kuvvet mikroskopu ve manyetik cımbızlar gibi diğer mekanik teknikler de, tek RNA moleküllerinin katlanmasını incelemek için kullanılabilir. Ancak bu gibi uygulamalar, nispeten düşük uzaysal çözünürlüğü 30 büyük ölçüde sınırlıdır. Optik cımbız iş RNA yapılarının mekanik güç ile katlanmamış sağlar. Açılımı mekanik avantajı birkaç yönlüdür. Metal iyonları ve ligand uyarılmış katlama ağırlıklı üçüncül yapıları ile sınırlıdır, oysa Kuvvet, ikincil ve üçüncül yapıların her ikisinin de açılmak için kullanılabilir. Sıcaklık ve denatüran önemli ölçüde su ve çözünenlerin faaliyetlerini etkileyebilir. Buna karşılık, kuvvet moleküler yapılarını perturb lokal olarak uygulanır; çevresini üzerine uygulanan kuvvet etkisi ihmal edilebilir düzeydedir. Buna ek olarak, termal erime en küçük RNA yapılarını katlama termodinamik çalışma için kullanılır,optik cımbız yedi temel-çift tetraloop firkete 28 ikinci bir 400-nükleotid ribozim 31 kadar farklı boyutlarda RNA yapılarının incelenmesi için kullanılmıştır gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, RNA yapıları mekanik mezofilik sıcaklıklarda açılabilirler. Buna karşılık, bir termal erime deneyde RNA açılmak için, sıcaklık tipik olarak daha da önemli olarak, özellikle Mg +2 iyonlarının mevcudiyetinde, RNA, hidroliz artar fizyolojik sıcaklıklarda, üzerinde yükseltilir. Bu kuvvet, bir mekanik etki yapısına tatbik edilir nasıl bağlı olduğunu not etmek önemlidir. Uygulanan kuvvet katlanan enerji manzara tenteli. Örneğin, saç tokası, bir kuvvet uygulandığında, baz çiftleri, sırasıyla, bir zaman (Şekil 1a) bir tane kırılır. Kopyalama çatal uygulanan kuvvete dik helezon ekseni boyunca ilerler. En az bir öpüşme karmaşık bir gerilim altında Bunun tersine, iki öpüşmeUygulanan kuvvet paralel olan baz çifti, bir güç yük paylaşımı (Şekil 1b). İkincil ve üçüncül katlama 28,32 ayırt etmek için kullanılabilir bunların farklı mekanik karşılık olarak uygulanan kuvvet sonucu firketenin ve öpüşme karmaşık ilişkide tutulur, dolayısıyla farklı geometriler. Açılımı mekanik teorik yönü önceden 8,9,30 gözden geçirilmiştir. Bu çalışma kurmak ve bir tek molekül mekanik açılımı analizini gerçekleştirmek için temel yaklaşımları özetliyor. Deneysel Kurulumu. Bizim mekanik çekme deneyinde, tweezing için RNA numunesi iki çift bükümlü DNA / RNA kolları tarafından sınırlanan, ilgi konusu RNA (Şekil 2) oluşur 7. Tüm molekül sırasıyla streptavidin- biotin ve digoksijenin anti-digoksijenin antikor etkileşimleri, üzerinden iki yüzey kaplı mikron boyutunda boncuk (Spherotech) gergin olabilir. Bir boncuk bir kuvvet ölçme optik tr tarafından düzenlenenAP, diğer ise, bir mikropipet ucunda tutulur. Halkalar arasında göreceli mesafe tutucu direksiyon veya mikropipet ile hareket ya da değiştirilebilir. Bu yaklaşımı kullanarak, tek bir alana sıkıştırılmış boncuklar RNA molekülü gerilip serbest edilebilir. Numune hazırlanması. Tweezing için RNA örneklerinin sentezi birkaç adımları içerir (Şekil 3) içerir. İlk olarak ilgili RNA&#39;ya karşılık gelen DNA sekansı ilk olarak plazmid vektörüne klonlanır. Daha sonra, üç PCR reaksiyonu, iki kolları ve transkripsiyon için bir şablon üretmek için kullanılmaktadır. Transkripsiyon şablon sap bölümleri ve eklenen dizileri de kapsamına almaktadır. Tam uzunlukta RNA, in vitro transkripsiyon kullanılarak sentezlenir. Son olarak, RNA ve kimyasal olarak modifiye edilmiş kolları tweezing için molekülleri oluşturmak için bir araya tavlanır. Kalibrasyon ve Cımbızlar Operasyonu. Minitweezers kullanımının temel tasarımBu çalışmada d ki çift-ışın optik cımbız 33 izler. İlk nesil optik cımbız ile karşılaştırıldığında pek iyileştirmelerle, Minitweezers olağanüstü dengeye sahiptirler. Birkaç ülkede araştırma grubu bir tek-molekül araştırmalarına 14,15,34-37 olarak Minitweezers kullanın. Talimat videolar dahil olmak üzere cihazın, inşaat, kalibrasyon ve operasyon bilgilerini, &quot;Cımbız Lab&quot; sitesinde (http://tweezerslab.unipr.it) mevcuttur. Burada, günlük bazda yapılması gereken iyileştirmeler ve kalibrasyon işlemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Minitweezers</td>
			<td style="width:211px;">Steven B. Smith Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Data acquisition card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">USB-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Video card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">PCI-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Labview programming software</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">NI Vision Builder</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Laser engraver</td>
			<td style="width:211px;">Epilogue laser systems</td>
			<td style="width:119px;">Zing-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:211px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">MEGAscript T7 kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">MEGAclear kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Biotin-11-UTP</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td>FERR0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:211px;">New England Labs</td>
			<td style="width:119px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">SVP-20-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Antidigoxigenin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Size standard microspheres</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">PPS-6K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:211px;">Kaptontape.com</td>
			<td>KPPTDE-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 2 cover glass</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-543D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomanipulation of single rna molecules by optical tweezers

İnsan genomunun büyük bir kısmı kopyalanmış fakat tercüme değildir. Bu Mesaja genomik çağda, RNA düzenleyici işlevleri giderek daha önemli olduğu gösterilmiştir. RNA işlevi çoğu zaman alternatif yapılarını benimsemek yeteneğine bağlıdır olarak, sırayla doğrudan RNA üç boyutlu yapılarını tahmin etmek zordur. Tek molekül bir seferde moleküler yapılarla bir molekül izleyerek RNA yapısal polimorfizmi sorunu çözmek için gösteri potansiyelleri yaklaşır. Bu çalışma, tam optik cımbız kullanarak tek RNA moleküllerinin, katlanma ve yapının manipüle etmek için bir yöntem sunmaktadır. İlk olarak, yöntemler tek moleküllü mekanik iş için uygun moleküller tanımlanmıştır sentezlenmesi için. Optik cımbız düzgün işlemleri sağlamak yanında, çeşitli kalibrasyon prosedürleri tartışılmıştır. Daha sonra, çeşitli deneyler açıklanmıştır. Tekniğin yararlılığını göstermek için, mekanik olarak saç tokası RNA açılımı sonuçlarını ve bir tek RNA öpmeyeceğing karmaşık delil olarak kullanılır. Bu örneklerde, bağımsız bir şekilde nanomanipulation tekniği, ikinci ve üçüncü dahil olmak üzere her yapısal etki katlanmasını incelemek için kullanılmıştır. Son olarak, sınırlamalar ve yöntemin gelecekteki uygulamalar tartışılmaktadır.

Boşluk ile sınırlıdır, tek RNA moleküllerinin nanomanipulation mekanik olarak saç tokası RNA açılımı örnekleri ve üç boyutlu yapıya sahip bir RNA göstererek gösterilmiştir. Tek Firkete Moleküller işleyin Bir ip boncuk arasına kurulduğunda, halata bağlı uzantısı ve kuvvet bir kullanıcı tanımlı protokolü kullanılarak manipüle edilebilir. Dört ortak manipülasyon protokolleri yaygın olarak kullanılmaktadır. ...

Watch this Scientific Journal Video about Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers at JoVE.com

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

nanomanipulation-of-single-rna-molecules-by-optical-tweezers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K Görüntüleme.  University at Albany, State University of New York. Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules. 

Video: Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Biyomühendislik

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

Yerli, Fibröz Uzun Aralığı ve Bölümlere Uzun Aralığı Kollajen in vitro sentezi olarak

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optik Algılama<em&gt; E. coli</emMezopor Silikon Biyosensörlerin tarafından&gt; Bakteri

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

İpucu büyüyen bitki hücreleri son derece küçük alanlarda uzama yeteneğini çalışmaya mikrosıvısal cihazların geliştirme

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...