Biz düzenleme yardım için Sabin Russell müteşekkiriz. Bu çalışma (http://www.jbei.org) ABD Enerji Bölümü, Bilim, Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi, Ofisi tarafından desteklenen DOE Ortak Biyoenerji Enstitüsü parçası oldu Lawrence Berkeley arasındaki sözleşme DE-AC02-05CH11231 yoluyla Ulusal Laboratuvarı ve ABD Enerji Bakanlığı.

1.. Gömmeyi Kök <ol><li> Su içinde bir% 7 agaroz çözeltisi (distile su, 100 ml dereceli agaroz elektroforezi 7 g) elde edin. 20 dakika için otoklav ile ya da düşük yoğunlukta (1250 watt bir mikrodalga, örneğin,% 10 yoğunluk) 20 dakika boyunca mikrodalga ile agaroz eritilir. </li><li> Plastik şişeleri kullanarak kaynaklanıyor gömmek için bir ev yapımı kalıp hazırlayın. <ol><li> Bir jilet kullanarak, bir 2 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüp (Bölüm A) konik alt kesti. , Bir şırınga iğnesi ile, gömülü olarak kök çapından biraz daha büyük boru kap içinde bir delik delinerek. Sonraki, bir 0.6 ml mikrosantrifüj tüp (Bölüm B) alt kısmına 0,5 cm kesti. </li><li> Önceden kesilmiş 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine 0.6 ml mikrosantrifüj tüpü cut-off 0.5 cm kısmını ekleyin. Parafilm (Şekil 1) kullanılarak, iki parça kapatın. NOT: Tüpün alt Agaroz katılaşmış sonra gömülü numunenin çıkarılmasını kolaylaştırmak için kesilir. To kap içinde bir delik kök agaroz gömüldüğünde kök sabit tutulmasına yardımcı olur. Kalıp agaroz tutun ve gömerken kök düz tutmak için hizmet edecektir. Agaroz ayarlanır ve kök gömülü kadar Parafilm, iki parça, A ve B yapacak. </li><li> Bir jilet kullanarak, ilgi alanı, (ilk kök boğum örneğin orta) bir kök bölümü kesti. NOT: İdeal olarak, kök sadece dehidratasyon yıkımı önlemek için gömmeden önce kesilmelidir. Seçenek olarak ise, sap geçici olarak su ile ıslatılmış filtre kağıdı içeren bir plaka saklanabilir. Bu plaka, doku su kaybını ve deformasyonunu önlemek için gömülü olması için hazır olana kadar buz üzerine yerleştirilebilir. Yüksek nem olmadan 30 dakika daha uzun süreler için kök saklama kök kurumasına neden olur. </li></ol></li><li> Düşük yoğunlukta mikrodalgada agaroz eritin. DİKKAT: agaroz içeren şişe sıcak olabilir. Şişe almak için de eldiven kullanın. Erimiş agaroz diyelim(20 ° C ve 25 ° C arasında), oda sıcaklığında tand yaklaşık 50 ° C&#39;ye soğuyana kadar </li><li> Yavaş yavaş şişeyi doldurmak için önceden hazırlanmış plastik kalıp içine agaroz 5 ml pipetle. NOT: Emin kalıplar içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Hava kabarcıkları agaroz kalıp boşlukları neden olur ve tamamen sonunda numune bölümlerinin düzensiz kesme yol açacaktır kök örneği, kapsamaz. <ol><li> Agaroz yarı katı olmak için 30 ila 60 saniye boyunca soğumaya bırakın. Nüfuz ve agaroz, yüzer ayağa olamaz, ama emin, küçük bir kürdan ile test edin. NOT: agaroz o hücre morfolojisi yok, kök aksatmanın tarafından örnek zarar verecektir hala sıcak olduğu zaman kök yerleştirilir ise. </li><li> Bu agaroz dolu şişe içinde kök yerleştirin. Gövdesi düz kalır emin olun. Kök ucu, kapak tarafından düzenlenen bir şekilde delikli kapağı yerleştirin. Vidalı kapağı açmayın. Bazen (tek bir tür) bir kök daha embe olabilirTek bir şişede dded; ama bu özel durumda, kap kullanmayın. NOT: vidalı kapak açıksa, kök bükümlü alacak. </li></ol></li><li> Sertleşene kadar, 10-30 dakika süre ile, oda sıcaklığında ya da 4 ° C &#39;de şişeyi bırakın. </li><li> Yavaşça tüpün dışına kaydırarak kalıp çıkarın. Parafilm açın. Bir cam mikroskop lamı üzerine Kısım A katılaşmış agaroz serbest bırakmak için parmak ile hafifçe kalıbın Kısım B alt itin. </li><li> 1.2 cm uzunluğunda üç eşit parçaya agaroz gömülü kök kesilir. Agaroz değildi ve atın kök kısmını kesip. <ol><li> Gömülü olan agaroz bu parçaları Mağaza hava geçirmez bölüme hazır olana kadar 4 ° C&#39;de bir siyah kutu içinde 2 ml mikrosantrifüj tüpleri kaynaklanıyor. Seçenek olarak ise, bir haftalık bir süre için 4 ° C&#39;de tüpler saklayın. NOT: Depolama mümkündür, ama deneyci gömülü kaynaklanıyor hala hayatta ve deney olarak farkında olması gerekir, Eserler potansiyel tanıtıldı olabilir. </li></ol></li></ol> 2.. Kesit alma Kök <ol><li> DİKKAT: dikkatle vibratome kılavuzunu okuyun ve tüm emniyet talimatlarını izleyin. </li><li> Numune disk (herhangi bir katı veya sıvı ücretsiz) temiz ve tamamen kuru olduğundan emin olun. Önceki deneylerden herhangi bir kalıntı tutkal ve suyla yıkamak için bir traş makinesi bıçak ile numune diski temizleyin. Sonra bir kağıt havlu ile kurulayın. Not: Bu yapıştırıcı iyi çalışır ve agaroz numune bağlanan sağlayacaktır. Bu adımı düzgün yapılmazsa ise, numune diske uygun olmayabilir ve daha sonra numune kesit sırasında diske devrilmesine neden olasıdır. <ol><li> Kullanın yumuşak kağıt örnekler içeren agaroz blok herhangi bir nemi çıkarmak için mendil. </li><li> Örnek disk üzerinde doku yapıştırıcı bir damla yerleştirin. Çizgi yapışkan şişenin ucu kullanılarak plakanın ortasına bir alanı kapsayacak şekilde, yapışkan var. Çabuk yerAgaroz blok numuneler dik ya da sırasıyla, çapraz veya uzunlamasına kesitlerde, için plaka paralel olarak ya da olduğu kadar. Yapışkan 10-30 dakika için oda sıcaklığında ya da 4 ° C&#39;de numune diske örnek düzeltmek için izin verin. NOT: Bu bir zaman duyarlı bir adımdır. </li></ol></li><li> Tampon tepsiye veya çukur üzerinde yerinde numune diski düzeltmek. Bölümleri ile agaroz blok / s jilet paralel olmalıdır. Örnekler tamamen gömülü olduğu kadar oda sıcaklığında damıtılmış su ile tampon tepsi doldurun. </li><li> Yarısında jilet kesmek ve daha sonra bıçak tamamen düz kalır, böylece sağlam bir makasla uçlarını kesin. Bıçak tutucu üzerine önceden kesilmiş jilet yansım takın. <ol><li> 84 ° bıçak tutucuya açısını ayarlamak, 50 Hz (Vibratome pozisyon 5) 0.90 / sn mm (Vibratome pozisyon 8) ve frekans hızı. 100 um kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir. Sürekli modunu kullanın. HAYIRTE: Bu kalınlık, doku boyama protokollerini kullanılan çeşitli asit ve baz tedavi dayanabilir emin olmak için seçildi. Kesit için pencere ayarlayın ve bölüm yaklaşık 1.2 cm&#39;lik bir agaroz blok için Vibratome için sürekli bir modda 15-20 dk bekleyin. </li></ol></li><li> Tampon tepsisine kesit boyunca bir tek kullanımlık plastik pipet kullanarak bölümleri toplayın. Alternatif olarak, kısımlar, bir cam kabın içine tampon tepsiden aktarılır ve daha sonra berrak bir Petri levhaya edilebilir. 2.0 ml mikrosantrifüj tüplerine birkaç bölümleri aktarın. Not: numuneler saydam bir zemin üzerine bölümlerine bakınız daha kolay olduğu için, bir Petri plakasından toplanan ve tampon, tepsi bir sonraki numune için hazır olarak kabul edilebilir. </li><li> Kesitler, 30-60 dakika boyunca 4 ° C de, 50 ml bir tüp içinde saklanan ya da toplandı ve 1,5-2 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde saklanabilir. NOT: Daha uzun süreler için bölümleri saklanması kötü görüntü kalitesine yol açacaktır. </li&gt; </ol> Görüntüleme için 3. Mikroskop ve Kamera Ayarı <ol><li> Mikroskop Koehler aydınlatma ayarlayın. Bir hedef seçin. İlk numune odaklanın. Bir buçuk veya daha düşük bir ışık yoğunluğunu getirin. Alanında diyafram (FD) ve diyafram (AP) kapatın veya belirli bir hedef üzerinde mümkün olan en düşük ayara getirin. <ol><li> Büyütme kadar yüksek olursa, o kadar büyük halkası olacaktır. Gibi keskin mümkün olduğunca alan iris odaklanmak için kondansatör odaklanarak düğmeyi kullanın. </li><li> Yavaşça kondansatör-merkezleme topuzlarını (Kondansörü çevreleyen iğne şeklindeki vida) kullanılarak merkeze alan iris (altıgen şekilli, küçük halka) resim getirecektir. Yavaşça alan iris kenarına ulaşır diyafram (FD) bu tür artış. Alan iris kenarını geçtikten hemen sonra FD artan durdurun. </li><li> Yavaşça kontrastını ayarlamak için açıklığı (AP) artar. Gerektiği gibi ışık yoğunluğunu ayarlayın. NOT: Koehler aydınlatma her o için ayarlanması gerekiyorbjective, her deney gün. Gün için düzeltme yapıldıktan sonra elde edilen numaralarını not edin. Bu rakamlar hedefler o gün için ileri ve geri açıldığında her defasında yeniden edilecektir. </li></ol></li><li> Diyafram, şiddeti, maruz kalma süresi, kazanç, ve Tablo 1&#39;de açıklandığı gibi filtreleri ayarlayın. Bu bilgiler sadece bir rehber olarak kullanılmalıdır. </li><li> Floresan görüntü yakalamak için hiçbir mekanik obtüratör ile bir geniş format CCD çipi ile yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf makinesi kullanın; ve aydınlık alan görüntüler için yüksek çözünürlüklü, yüksek hızlı kamera. </li><li> Standart yazılımı kullanarak slaytlar işleyin. Yazılımı yükleyin. &quot;Al&#39;ı&quot; ve tıklayın &quot;Set kamera / ütü masası,&quot; daha sonra kullanılacak kamera seçin. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Ardından &quot;Al&quot; Click &quot;Renk sekmesinde.&quot; Altında &quot;Renk sekmesinde,&quot; seçim &quot;Bayer metodu&quot; ve ardından &quot;ortalama dört.&quot; Önerdi kazancı (kırmızı, yeşil, mavi) sağa sola eklem Tablo 1. &quot;Set kaydetmek&quot; sekmesini seçin ve görüntülerin saklanacağı dizinde tıklayın. Tablo 1&#39;de önerileri &quot;Pozlama süresi&quot; olarak ayarlayın. &quot;1&quot; &quot;binning&quot; olarak ayarlayın ve &quot;Canlı binning&quot; ilgi bölgeye &quot;1&quot;., Odak ve sonra tıklayın &quot;canlı kaydedin.&quot; </li><li> Kamera yazılımı çıkış görüntüleri &quot;TIF&quot; formatında bulunmaktadır. Hücre tipleri için histokimyasal görüntüleri analiz edin. Sunum ve yayın aşağı kullanımlar için standart bilgisayar yazılımı kullanın. </li></ol> 4.. Ultraviyole ve Parlak alan Görüntüleme <ol><li> Bölümler kolayca pipetle böylece pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça pipet bölümler ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine. Bir kapak kayma bölümleri kapsayacak. UV ışığı veya parlak ışık altında alan bölümleri gözlemlemek. </li></ol> 5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) Boyama 12 <ol><li> % 3 phloroglucinol çözeltisi hazırlamak için, 10 ml mutlak etanol içinde 0.3 g floroglukinol çözülür. Etanol% 3 floroglukinol iki hacim için konsantre HCI (37 N), bir hacim karıştırın; Bu çözeltiye, phloroglucinol-HCl (Ph-HCI) veya Wiesner leke. NOT: Bu çözüm çözüm zamanla düşer ve boyama etkisiz hale gelecektir çünkü, boyamanın gününde taze yapılacak ve saklanabilir olamaz. DİKKAT: HCl oldukça yıpratıcıdır, Ph-HCl leke tutarken çok dikkatli kullanın. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Bölümleri ihtiva eden tüpe Ph-HCl çözeltisi 1 ml ilave edilir ve Ph-HCl leke olarak HCl oldukça aşındırıcı, çünkü hemen kap. Yavaşça tüm bölümleri boyanır sağlamak için tüp hareket ettirin. Bu aşama için bir alternatif, Ph-HCl çözeltisi yukarı ve aşağı pipetle böylece tercihen saniye bozmadan, açık boru kap tutmaktırTIONS. NOT: Bu, bu bölümleri zarar verebileceğinden, pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. <ol><li> Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipetle. Kapak kayma bölümleri kapsayacak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. NOT: Ph-HCl çözüm örneklerinin bir bozulmaya neden, 5-10 dakika içinde kurur. Bu nedenle, görüntüleme bu süre içinde tamamlanması gerekmektedir. </li></ol></li></ol> 6.. Maule Boyama 13,14 <ol><li> % 0.5 &#39;lik bir potasyum permanganat solüsyonu hazırlamak için, 40 ml damıtılmış su içerisinde potasyum permanganat, 0.2 g çözülür. 7 günlük bir süre boyunca oda sıcaklığında karanlık şişe içinde depolayın. <ol><li> 9 ml saf su (1:10) ile, 1 ml konsantre HCI (37 N) ilavesiyle, bir% 3.7 HCI solüsyonu hazırlayın. Taze bir% 3.7 HCl çözeltisi hazırlayınDeney günü. Kullanılan 37 N HCI stok çözümü çok eski olmadığından emin olun. Konsantre amonyum hidroksit çözeltisi (14.8 M) azalan gelen doymuş çözeltisi molaritesini önlemek için 4 ° C&#39;de depolanmalıdır. </li></ol></li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Bölümleri ihtiva eden tüpe% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi 1 ml ilave edilir. <ol><li> Tercihen bölümleri bozmadan, yavaşça yukarı ve aşağı% 0.5 potasyum permanganat çözüm pipetle. 2 dakika boyunca inkübe edin ve pipetleme tekrarlayın. Tüm bölümler sakinleşene kadar mikrosantrifüj tüp bekletin. NOT: bölümleri zarar verebilir gibi pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. Bu çözüm karanlık olduğu gibi kök bölümlere bakın, bu yüzden tüp rafa bölümleri ile tüp tutmak ve onları 2 dakika boyunca yerleşmek için izin zor olabilir. </li><li> 1 ml pipet kullanarak,% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi 700 ul çekmek.Potasyum permanganat solüsyonu çalkalamak için damıtılmış su içinde 700 ul ekleyin. Su çözeltisi berrak kalana kadar 3-4x tekrarlayın ya. </li><li> Su atın. Derin bir kahverengi renk bölümlerde taburcu kadar hızlı% 3 HCl 1 ml ekleyin. Bu, 3-5 dakika içinde ortaya çıkabilir veya 5 dakika her 2 yıkar gerektirebilir. Tüm% 3 HCl çözümü Pipet ve hemen bir sonraki adıma geçin. </li><li> Konsantre amonyum hidroksit çözeltisi 1 ml ilave edilir. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde uç kesim ile 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipetle. Bir lamel ile bölümleri kapsayacak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. DİKKAT: amonyum hidroksit derece aşındırıcı olduğundan, mikroskop veya mercek aşamasına korozyona neden önlemek için ekstra bakım ve dikkat gerektirir. NOT: amonyum hidroksit dumanlar zor örneği gözlemlemek için yapım, lamel sis olabilir. Bu nedenle lamel eklemeden önce ekstra dikkatli olun. Çözelti 5-10 dakika içinde kurur, bu yüzden görüntüleme o süre içinde tamamlanması gerekmektedir. </li></ol></li></ol> 7. Kongo Kırmızı Boyama 11,15 <ol><li> % 0.5 &#39;lik Kongo kırmızı bir çözelti hazırlamak için damıtılmış su, 100 ml kırmızı Kongo 0.5 g çözülür. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Tüpe% 0.5 Kongo kırmızısı çözeltisi 1 ml ilave edilir. Yavaşça% 0.5 kongo kırmızı çözümü pipet ve aşağı bölümleri bozmadan. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. <ol><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve tekrar pipetleme. Oda sıcaklığında kuluçkalama bir diğer 3 dakika ile izleyin. </li><li> % 0.5 kongo kırmızı solüsyon 700 ul çekmek için 1 ml pipet kullanın. Kongo kırmızı bir çözelti çalkalamak için damıtılmış su içinde 700 ul ekleyin. Yıkama çözeltisi kadar yıkama 3-4x Tekraraçıktır. </li><li> Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde kendi ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet, ve kapak örtün. 560/40 bir bant geçiren bir filtre kullanılarak mavi ışık uyarma altında mikroskop lamı üzerine örnekleri gözlemlemek. NOT: Su 10-30 dakika içinde kongo kırmızı yıkayın gibi, önce mikroskopik analiz için uzun süre suda bölümleri tutmayın. </li></ol></li></ol> 8. Kalkofluor Beyazı Boyama 9 <ol><li> % 0,2 &#39;lik bir stok çözelti hazırlamak için damıtılmış su, 10 ml (beyaz Kalkofluor M2R&#39;den) fluoresan parlatıcı 28 0.02 g çözülür. % 0.2 &#39;lik çözelti, 4 ° C de karanlık bir şişe içinde, altı ay boyunca saklanabilir Damıtılmış su ile% 0.2 &#39;lik stok çözeltisi 10x seyreltilerek% 0.02&#39; lik bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. % 0.02 calcof en boru 1 ml ekleluor beyaz çözelti. Yavaşça yukarı ve aşağı 0.02% calcofluor beyaz çözüm pipetle. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. <ol><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve tekrar pipetleme. Oda sıcaklığında bir diğer 3 dakika için bölümü inkübe edin. NOT: bölümleri daha kolay bölümlere zarar vermeden çözüm pipetle yapmak için tüpün dibine çökmesine izin verilmektedir. </li><li> % 0.02 calcofluor beyaz solüsyon 700 ul çekmek ve distile su 700 ul eklemek için 1 ml pipet kullanın; 5 dk calcofluor beyaz çözümü çalkalamak için bekleyin. Yıkandıkları 3-4x tekrarlayın. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle olabilir Bu şekilde olarak pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. </li><li> Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet ve bir lamel ile onları karşılamak. UV ışık altında bölümleri gözlemlemek. </li></ol></li></ol> 9. Toluidine Blue O Boyama 16,17 <ol><li> A% 0.02 çözeltisi hazırlamak için 100 ml damıtılmış su içinde 0.02 g toluidin mavi O çözülür. NOT: toluidin mavi O çözelti, oda sıcaklığında karanlık şişe iki hafta içinde saklanabilir. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Tüpe% 0,02 toluidin mavi O solüsyonun 1 ml ilave edilir. Yavaşça yukarı ve aşağı 0.02% toluidin mavisi O çözüm pipetle. Daha sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve bir kez tekrar pipetleme. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. Bölümler sakinleşene kadar mikrosantrifüj tüp hala bekletin. Bu çözüm karanlık olduğu gibi, görmek, bu yüzden tüp rafa bölümleri içeren tüp tutmak ve onları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca yerleşmek için izin zor olabilir. <ol><li> % 0.02 toluidin mavisi O çözeltisi 700 ul çekmek için 1 ml pipet kullanın. Toluidin mavi O sol dışarı durulama için distile su 700 ul ekleyinution. 3-4x tekrarlayın veya yıkama solüsyonu kadar açıktır. Bölümler onlara zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. </li><li> Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet ve bir lamel ile onları karşılamak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li><li>Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis+and+structure.">Lignin biosynthesis and structure.</a> Plant physiology. 153, 895-905 (2010).</li><li>Humphreys, J. M., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewriting+the+lignin+roadmap.">Rewriting the lignin roadmap.</a> Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).</li><li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+chemistry&#8212;past,+present+and+future.">Lignin chemistry&#8212;past, present and future.</a> Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).</li><li>Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+Staining+of+Plant+Cell+Walls+by+Toluidine+Blue.">Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue.</a> 59, 368-373 (1964).</li><li>Mori, B., Bellani, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+staining+for+cellulosic+and+modified+plant+cell+walls.">Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls.</a> Biotechnic &amp; histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).</li><li>Maeda, H., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+binding+of+hexopyranosyl+polysaccharides+with+fluorescent+brightener.">Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener.</a> Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).</li><li>Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+in+the+interaction+of+direct+dyes+with+polysaccharides.">Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).</li><li>Hughes, J., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+an+optical+brightener+in+the+study+of+plant+structure.">The use of an optical brightener in the study of plant structure.</a> Stain technology. 50, 319-329 (1975).</li><li>Verbelen, J. P., Kerstens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+confocal+microscopy+and+congo+red+fluorescence:+a+simple+and+rapid+method+to+determine+the+mean+cellulose+fibril+orientation+in+plants.">Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants.</a> Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).</li><li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cellulose+reorientation+during+cell+wall+expansion+in+Arabidopsis+roots.">Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots.</a> Plant physiology. 152, 787-796 (2010).</li><li>Liljegren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloroglucinol+Stain+for+Lignin.">Phloroglucinol Stain for Lignin.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).</li><li>Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , (1992).</li><li>Sibout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CINNAMYL+ALCOHOL+DEHYDROGENASE-C+and+-D+are+the+primary+genes+involved+in+lignin+biosynthesis+in+the+floral+stem+of+Arabidopsis.">CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis.</a> The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).</li><li>Yeung, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+the+study+of+plant+structure.">A beginner's guide to the study of plant structure.</a> Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).</li><li>Turner, S. R., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapsed+xylem+phenotype+of+Arabidopsis+identifies+mutants+deficient+in+cellulose+deposition+in+the+secondary+cell+wall).">Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall).</a> The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).</li><li>Iiyama, K., Pant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+M&#228;ule+colour+reaction.+Introduction+of+methylated+syringyl+nuclei+into+softwood+lignin.">The mechanism of the M&#228;ule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin.</a> Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+secondary+cell+wall+deposition+in+plants.">Engineering secondary cell wall deposition in plants.</a> Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).</li><li>Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+deposition+of+lignin+in+the+pith+of+stems+of+two+Arabidopsis+mutants.">Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants.</a> Plant physiology. 123, 59-70 (2000).</li><li>Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+general+phenylpropanoid+pathway.">An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway.</a> The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).</li><li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROCUSTE1+Encodes+a+Cellulose+Synthase+Required+for+Normal+Cell+Elongation+Specifically+in+Roots+and+Dark-Grown+Hypocotyls+of+Arabidopsis.">PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis.</a> The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).</li></ol>

The authors have no financial conflicts to disclose.

A. thaliana sap bölümleri yaygın olarak sekonder hücre duvarındaki hücre organizasyonunu incelemek ve niteliksel olarak vahşi tip ve transjenik bitkiler arasındaki farklılıkları incelemek için kullanılır. Örneklerin kesit için yaygın olarak kullanılan teknikler doğrudan el kesme vardır; numuneleri agaroz veya sabitleyici gömülü olduğunda ya da kesit bir vibratome veya mikrotom ile yapılabilir. Helisli aksine, sadece son iki numune ve düzgün olmayan yüzeyler arasında kalınlık farkl...

Bitki hücre duvarı çeşitli bileşenlerine içinde bilgi bir bolluk tutar: lignin, selüloz, hemiselülozlar (ksilan, glucuronoxylan, ksiloglukan, arabinoksilan, karışık bağlantı glukan veya glukomannanı), ve pektin. Histolojik teknikler örgütsel ve hücresel düzeyde ikincil hücre duvarları içinde farklılıklarını inceleyerek önemli görsel ipuçları sağlar. Çeşitli histolojik teknikler geliştirilmiş ve literatürde bulunabilir, ama basit görsel talimatları ile çok detaylı protokoller nadiren hiç varsa, çünkü bu teknikler zor ve zaman alıcı yeni başlayanlar için olabilir. Bu çalışmanın amacı, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek histolojik boyama teknikleri için basit kurallar sağlamaktır. Kök doku Kesit hücre duvarları ve hücre şekillerde görselleştirilmesi ilk adımdır. El-cut bölümler ucuz ve hazırlamak için daha az zaman alacak olsa da, bir vibratom kullanımı tutarlılığı sunar veyüksek kaliteli görüntü verir. Bir vibratome kullanarak keskin görüntüler üretmek için yardımcı olur ve önemli ölçüde sadece kötü bir örnek hazırlama neden olacağını numuneler arasındaki yanlış farklılıkları üretme riskini azaltır, aynı kalınlıkta, hatta bölümleri üreterek daha iyi veri kalitesini üreten sağlar. Taze örnekleri düzeltmek için reçineler kullanılarak yeni başlayanlar için zor olabilir ve bir şekilde analiz yapılması gerektiğinde hala bile uzmanlar için zaman alıcı olabilir. Buna ek olarak, bir reçine içine gömülü olduğu zaman numunenin herhangi bir biyolojik aktivitesini ölçmek mümkün olur. Agaroz ve ev yapımı bir kalıp kullanır Basit bir tekniktir kök dokuları gömmek için yararlı olduğunu ve aynı zamanda yumuşak dokuların diseksiyonu gerektiren uygulamalarda kullanılabilir. Reçine içinde gömme örnekleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, canlı dokuları tutmak ve örnek manipülasyon azaltma avantajına sahiptir. Bir vibratom yoluyla dokulara Kesit derece hassas ve homojen üretirÇalışmanın amacına bağlı olarak, daha sonra çeşitli boyama teknikleri ile kullanılabilir, lı bölümleri. Lignin ve diğer aromatik maddelerin görselleştirmek için en basit yöntem, ultraviyole (UV) ışık kullanır. UV ışığı ile aromat bazlı moleküllerin uyarma eski bir tekniktir, ancak yine de lignin görüntülenmesi için hızlı yaklaşımlardan biridir. UV ışık diğer aromatikleri heyecanlandıracak Ancak, UV görselleştirme aslında lignin tespiti için ideal değildir. 1-3: Lignin esas olarak üç yapı, monolinyollere (koniferil alkol, sinapil alkol ve p-kumaril alkol hydroxycinnamyl alkolleri) oluşur. Phloroglucinol leke ksilem, lif, ve trakea dokularda 4 mevcut sinamaldehitler&#39;in ölçüde ipuçları sağlayabilir. Phloroglucinol genel sinamaldehitler&#39;in iyi bir göstergesi olduğunu ve sinamaldehitler&#39;in ve diğer aromatik ayırt edebilirsiniz. Sinapil alkol monomerler algılanabilirve Maule leke kullanılmasıyla ayrılır. Toluidin mavisi O çok renkli bir boya ve bu nedenle farklı renklerde 5,6 hücre duvarının farklı unsurları leke yeteneğine sahiptir. Toluidin mavi O birincil kullanımı pektin ve lignin 5,6 tespit etmektir. Toluidin mavi O kullanmanın avantajı, hücre duvarının birçok unsuru tek bir aşamada görselleştirilebilir olmasıdır. Beyaz Kalkofluor ve Kongo Kırmızı hem de çalışmak için kolay ve selüloz görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Kalkofluor beyaz lekeler selüloz, kaloz, ve diğer non-değiştirmiş veya zayıf ikame β-Glukan 6-9, kongo kırmızı lekeler, doğrudan özellikle 10,11-β (1 → 4)-Glukan ve selüloz oysa. Bu çalışmanın amacı A. yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için yukarıda belirtilen boyama tekniklerinin kullanımı için basit kuralları sağlamaktır thaliana kaynaklanıyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Agarose</td>
			<td>EMD</td>
			<td>MERC2125</td>
			<td>CAS Number: 9012-36-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloroglucinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 3502</td>
			<td>1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>HX0603-75</td>
			<td>CAS Number: 7647-01-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX1303-6</td>
			<td>CAS Number: 1336-21-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toulidine Blue O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3260</td>
			<td>Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9]&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium permanganate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223468</td>
			<td>CAS Number 7722-64-7&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 proof</td>
			<td>KOPTEC</td>
			<td>V1401</td>
			<td>CAS Number: 64-17-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C6277</td>
			<td>Disodium 3,3&#39;-[[1,1&#39;-biphenyl]-4,4&#39;-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3543&#160;</td>
			<td>4,4&#39;-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2&#39;-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7]&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Vibrating blade microtome VT1000S</td>
			<td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>American Safety razor company</td>
			<td>Item # 60-0139-0000&#160;</td>
			<td>Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16466-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes (0.6ml)</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT-060-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitt</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>380000000</td>
			<td>SCIENCEWARE&#160; Hot Hand Protector Mitt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive&#160;</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>10033</td>
			<td>Store at 4&#176;C or 20&#176;C for 3 months or longer&#160; storage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>NN-SD762S</td>
			<td>PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera with CCD chip with no mechanical shutter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed color camera&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software&#160;</td>
			<td>&#160;Molecular Devices</td>
			<td>MetaMorph version 7.7.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagining anaylsis&#160;</td>
			<td>Adobe&#160;</td>
			<td>Photoshop CS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No.1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8&#34;)-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Micro Slides, 1mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>75 x 25 mm- 1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX2 Filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11513851/11513885</td>
			<td>Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Alcan packaging</td>
			<td>BRNDPM998</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histochemical staining of arabidopsis thaliana secondary cell wall elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Gömme ve kesit Kök: Gömmek için ev yapımı plastik kalıp kullanımı agaroz hızlı ve kolay (Şekil 1) kanıtladı% 7 kaynaklanıyor. İki parça (A ve B; Şekil 1) gömülü flakon sistemin basit kolayca temiz sistemini tutmak, agaroz atıl olan şişe parçaları sopa değil gibi agaroz gömülü kök serbest bırakmak için yapmak. Vialler yıl için birden çok kez tekrar edilebilir. Gömülü kök depolamak kolaylık da sonraki adımları kolaylaştırır. , Bazen gö...

Watch this Scientific Journal Video about Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements at JoVE.com

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histokimyasal boyama<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

histochemical-staining-arabidopsis-thaliana-secondary-cell-wall

Research

JoVE Journal

Biology

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

40.1K Görüntüleme.  Joint Bioenergy Institute. Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Video: Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

14 gün eski Fideler Dokular protoplast izolasyonu Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Biyoloji

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

ERL1 Dinamiğinin Konfokal Görüntüleme ile Uzay-Zamansal Olarak İncelenmesi

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Yazar Spotlight: Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

Arabidopsis thaliana'da Polen Hidrasyon Profillerini Ölçmek İçin Geliştirilmiş Bir Yöntem

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

Yazar Spot Işığı: Arabidopsis thaliana için Yüksek Çözünürlüklü, Tek Taneli, İn Vivo Polen Hidrasyon Biyotahlili  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

Arabidopsis thaliana için Yüksek Çözünürlüklü, Tek Taneli, In Vivo Polen Hidrasyon Biyotahlili

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...