Sadece bir deneyden elde edilen bilgi miktarı çok büyük. Bu hücre duvarı polimerlerinin varlığını tespit edebilir ve hücre ve dokularda tam olarak nasıl dağıtıldıklarını bileceğiz ve hatta bolluklarını belirleyebiliriz. Bu yöntem, analiz etmek isteyebileceğiniz herhangi bir türden hemen hemen her tür bitki dokusuna uygulanabilecek şekilde tasarlanmıştır.
Bitki dokularında immünosalizasyon, gerçekte ne olduğunu görmeden açıklanması zor, çok titiz bir çalışma içerir. Bitki dokusu örneğini toplamadan önce, bir cam şişeyi tüm örnekleri tamamen batırmak için yeterli soğuk fiksatif çözelti ile doldurun. Daha sonra analiz edilecek bitki dokularını seçin ve numuneleri en fazla 16 milimetre karelik bir boyuta kırpın.
Örnekleri hemen sabit çözüme daldırın. Glutaraldehit ve formaldehit her ikisi de mükemmel fiksatiflerdir, ancak her ikisi de tehlikelidir ve akış başlığında ele alınmalıdır. Şişeyi bir vakum odasına aktarın ve yavaşça vakum uygulayın.
Basınç negatif 60 kilo pascals ulaştığında, şişedeki yüzen malzeme dibe batmaya başlayacaktır. Odadaki basıncı negatif 80 kilo pascal'dan fazla tutmayın. Batma işlemi iki saat kadar sürebilir.
Numuneler iki saat boyunca vakum odasında kaldıktan sonra, vakumun yavaşça serbest bırakılmasının ardından. Cam şişeyi kapatın ve dört santigrat derecede gece boyunca soğutun. Gece sabitlemeden sonra, şişenin dibine batmayan örnekleri atın.
Kalan numuneleri 25 milimolar PBS ile 10 dakika yıkadıktan sonra 25 milimolar PIPES tamponunda 20 dakika yıkayın. Tüm kayan örneklerin çıkarılması son derece önemlidir, çünkü fiksatifin numuneye nüfuz etmemiş olması muhtemeldir. Numuneleri bir etanol serisinde susuz bırakın, numuneleri her etanol konsantrasyonunda 20 dakika daldırin.
Örnekleri boğmak için, üç parça etanol için bir parça reçine ile başlayarak etanolde artan LR-beyaz reçine konsantrasyonları ekleyin. Her konsantrasyonda, dört santigrat derecede 24 saat kuluçkaya yatır. LR-beyaz reçinesini taze reçine ile değiştirin ve numuneleri dört santigrat derecede 12 saat daha kuluçkaya yatırın.
Yerleştirme jelatin kapsüllerini hazırlayın, numunelerden biraz daha büyük kapsülleri seçin, böylece numuneler reçineye tamamen kapatılabilir. Mürekkep reçineyi kirleteceğinden kağıt etiketleri kalemle etiketleyin. Her kapsülün altına bir damla taze LR-beyaz reçine uygulayın.
Her kapsüle bir örnek yerleştirin, ardından kapsülleri taze reçine ile maksimum kapasiteye doldurun. Kapağı kapsülün üzerine koyun ve mühürlemek için hafifçe bastırın. Reçineyi polimerize etmek için kapsülleri 58 santigrat derecede yaklaşık 24 ila 48 saat sertleşene kadar iyileştirin.
Jelatin kapsülü LR-beyaz reçineden soyduktan sonra, reçine bloğunu stereo mikroskobun altına yerleştirin. Keskin bir jilet kullanarak, LR-beyaz bloğu numuneye 45 derecelik bir açıyla kırpın. Örneği döndürün ve ilkine 90 derecelik bir açıyla ikinci bir kesim yapın.
Piramidin tepe noktasından numunenin ilgi alanının hemen üzerinde bir piramit oluşturmak için aynı desende kesmeye devam edin, ardından kesme yüzeyi örneğe ulaşana kadar ana eksene dik ince dilimleri çıkarmaya başlayın. Hedef örnek ideal olarak yamuk şeklinde kapatılmalıdır. Kesilmiş reçine bloğunu ultra mikrotom içine yerleştirin.
Bıçak kenarı ile reçine bloğu arasındaki açıyı ayarlayın. 200 ila 700 nanometre kalınlığında bloktan kesitler kesin. Mikrotomdan örneklenmiş bazı bölümleri dikkatlice kaldırmak için bir tel halka kullanın.
Onları cam bir kaydırağa damıtılmış deiyonize su damlasına yerleştirin. Slaydı 50 santigrat derecede sıcak bir tabağa yerleştirerek suyu buharlaştır, ardından bölümlere bir damla leke ekleyin. 30 saniye sonra lekeyi durulayın ve bölümün genel durumunu ve istenen bitki yapısının görünür olduğunu doğrulamak için mikroskop altında slaytı gözlemleyin.
Slaydın her kuyusuna bir damla damıtılmış deiyonize su yerleştirerek temiz bir reaksiyon kaydırağı hazırlayın. Her su damlasına bir veya iki örnek bölüm aktarın. Kaydırağı 10 santimetre kare petri kabına yerleştirin, örtün ve 50 santigrat derecede kurumasına izin verin.
Reaksiyon slaytları için bir kuluçka odası hazırlamak için, pipet uçları kutusunun altına sönümlenmiş kağıt havlular yerleştirin ve kutuyu alüminyum folyo ile sarın. Slaytları kutudan kuluçka odasına aktarın. Pipet Her kuyuya 50 mikrolitre blokaj çözeltisi.
Slaydı 10 dakika kuluçkaya yatırdıktan sonra, engelleme çözeltisini çıkarın, ardından tüm kuyuları pbs ile her seferinde 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. El yazmasında açıklandığı gibi birincil antikor çözeltilerini hazırladıktan sonra, kuyuların beş dakika boyunca damıtılmış deiyonize su ile son bir yıkamasını gerçekleştirin. Ana antikor çözeltisini reaksiyon kuyularına pipet, daha sonra engelleme solüsyonlarını kontrol kuyularına pipetle.
Kuluçka odasını kapatın. Oda sıcaklığında iki saat bekletin ve sonra dört santigrat derecede gece boyunca soğutun. Blokaj çözeltisinde ikincil antikorun%1'lik bir çözeltisini hazırlayın.
Kuyu başına yaklaşık 40 mikrolitreye ihtiyaç duyulacaktır. Çözeltiyi alüminyum folyo ile örtün. Reaksiyonun kuyularını PBS ile iki kez ve her seferinde 10 dakika damıtılmış deiyonize su ile bir kez yıkayın.
Kuyularda hiçbir engelleme çözümünün veya birikintisinin kalmadığından emin olun. İkincil antikor çözeltisini tüm kuyulara pipetle. Slaytları oda sıcaklığında üç ila dört saat boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın.
Yine, reaksiyonun kuyularını PBS ile iki kez ve bir kez damıtılmış deiyonize suyla yıkayın, ardından her kuyuya bir damla Calcofluor White ekleyin. Yıkamadan, her kuyuya bir damla montaj ortamı ekleyin ve her kuyunun üzerini bir kapakla örtün. Floresan mikroskobu kullanarak reaksiyon kaydırağındaki örnek bölümleri gözlemleyin.
Her gözlem için, Calcofluor tarafından boyanmış hücre duvarlarını tespit etmek için bir UV filtresi ve immünokokalizasyonu tespit etmek için bir FITC filtresi kullanın. Sonuçların daha iyi görselleştirilmesi için, her UV filtre görüntüsünü ilgili FITC filtre görüntüsüyle birleştirmek için ImageJ veya benzer bir görüntü analiz programını kullanın. Protokol, belirli epitopların yerelleştirilmesini belirleyerek hücre duvarı bileşiminin karakterizasyonuna olanak tanır.
Örneğin, gelişmekte olan Quercus suber anther hücre duvarında 1, 5-arabinan bol miktarda bulunur. Az esterleşmiş homogalacturonans tipik olarak organın mekanik özelliklerini belirten Quercus suber embriyosunun kök ucunda bulunur. Ksylogalacturonans, Quercus suber meşe palamudu olgunlaşmasının son aşamalarında endosperm hücresi gibi dejenere hücrelerde bulunur.
AGP'nin JIM13 veya JIM8 tarafından tanınan epitopları, Arabidopsis thaliana'daki mikrogametogenez ile ilgili hücre hatları ve bazal anjiyosperm Trithuria submersasının stigmatik papilla ve mikrobiyal gibi üreme ile ilgili yapılarda bulunur. Bu protokolün uygulanmasındaki yaygın hataların algılanıp tanımlanması genellikle kolaydır. Yıkamalar atlandığında veya reaksiyon kuyularının kurumasına izin verildiğinde, ikincil antikor genellikle bir smear olarak görünecektir.
İlişkisiz primer antikor düzgün bir şekilde yıkanmazsa yeşil florokrom agregaları oluşacaktır. Bölümlerin katlanması veya müfrezesi genellikle temiz olmayan slaytların kullanılması veya agresif yıkama nedeniyle zayıf yapışıklıkla ilgilidir. Numune hazırlama da kritik öneme sahiptir.
Reçine blokları açıkça görülebilen soluk sarıdan açık kahverengi örneğe sahip çatlaklardan arındırılmalıdır. Verimsiz gömülü numuneler tozlu beyaz lekeler veya alanlar gösterecektir. Numune boyutunu sekiz milimetrenin altında tutmak, fiksatif çözeltinin nüfuz etmesi için gereklidir.
Kötü sabitlenmiş numuneler koyu kahverengi veya neredeyse siyah görünecektir. Aşırı sıcaklık, reçinenin çatlayarak numunenin kesitini imkansız hale gelmesine neden olabilir. İmmünolokalizasyon tekniklerinin kullanımı çeşitli araştırma yönleri açar.
Hücre duvarının biyokimyasal analizi gibi daha spesifik tekniklerle takip edilebilir veya hatta moleküler bir yaklaşıma geçilebilir. Bu tekniğin sağladığı sonuçlar, basit kimyasal analizle analiz etmesi çok zor olan son derece karmaşık bir yapı olan hücre duvarının bileşimini anlamaya yardımcı olabilir.
