Biz UAS-EGFP :: Msp-300 KASH plazmid sağlamak için Janice Fischer teşekkür ederim. MAB24B10 antikor NICHD himayesinde geliştirilen Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası elde edilen ve Iowa Üniversitesi, Biyoloji Bölümü tarafından muhafaza edilmiştir. Repo-GAL4 stok (BL7415) Indiana Üniversitesi Bloomington Stok Merkezinden elde edilmiştir. Kanser Araştırma Purdue University Center Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu (IRG # 58-006-53) den destek minnettarlıkla olduğunu. Jingqun Ma Purdue Üniversitesi&#39;nde Gıda ve Tarım Purdue ASİSTANLIĞA bir Tarımsal Araştırma tarafından desteklenmektedir.

1.. EGFP üretimi ve karakterizasyonu :: KASH Drosophila <ol><li> Çapraz Gal4 sürücü Msp-300 KASH uçar UAS-EGFP&#39;nin :: uçar. Alternatif olarak, sürücü ve Gal4 UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgeni taşıyan yeniden birleştirici hem de sinekler standart genetik teknikleri kullanılarak oluşturulabilir. Döl sayıda gerekmektedir, bu ikinci bir yaklaşım, avantajlıdır. </li><li> Standart mikroskopi teknikleri kullanarak EGFP :: KASH işaretleyicinin ekspresyonunu karakterize eder. Not: EGFP ekspresyonu ya da bütün larvaları, kesilmiş, sabitlenmiş Drosophila dokularda standart mikroskopi teknikleri ile gözlenebilir, ve bir antikorun kullanımını gerektirmez. <ol><li> EGFP ifade modelini belirleyecektir :: flöresanlı bir diseksiyon mikroskobu altında tüm organizma içinde KASH işaretleyici (Malzemeler PDF bakınız). Not: Şekil 1 &#39;de gösterilen Repo-GAL4 sürücü, sergi n sürücüleri dahil olmak üzere birçok Gal4,Ancak tükürük bezi gibi diğer larva dokularda ifade onspecific kalıpları (Sonuçlar bakınız). </li><li> Konfokal mikroskopi kullanılarak ilgilenilen kesilir dokusundaki EGFP :: KASH ekspresyon modelini analiz edin. <ol><li> EGFP lokalizasyonunu :: DNA&#39;ya KASH etiket göreli görselleştirmek için 0.1 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda DAPI kullanılarak, nihai konsantrasyonu% 4 ve leke DNA de formaldehit kullanılarak, ilgi konusu doku tespit edin. </li><li> Ilgi dokusunun büyüklüğüne bağlı 40X / 1.30 immersiyon yağı hedefi veya 20X / 0.75 immersiyon yağı hedefi, kullanarak görüntü kazanır. Aşağıdaki uyarım / emisyon şartlar görüntü elde etmek için kullanılabilir: 408 nm nm/425-475 (DAPI), 488 nm / 525-550 nm (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Drosophila Larvaların Dokular Çekirdeği izole <ol><li> Larva doku diseksiyonu ve sonraki çekirdekler izolasyon ekipmanları hazırlayın. NotBütün dechorionated embriyoları, aynı zamanda eğer istenirse başlangıç ​​maddesi olarak kullanılabilir. Bu ilgi, hücre tipi, hayali disk gibi belirli bir dokuda mevcut ise yerine tüm larvalara göre kısmen kesilmiş, larva dokularından kullanılması önerilir. Bu spesifik olmayan bağlanma azaltır, ve aynı zamanda hedef olmayan hücrelerde bir Gal4 sürücüsü ifade neden olabilir sorunları ortadan kaldırır. <ol><li> (Malzeme PDF görmek) keskin forseps iki çift hazırlayın, bir silikonlu 9-sıra cam plaka (Malzeme PDF görmek) ve PBT (1x PBS, pH 7.4;% 0.1 Tween-20). </li><li> Manyetik boncuk GFP antikor Prebind. Bu adım diseksiyonu başlamadan önce başlanmalıdır. Yıkama tamponunun 400 ul (Malzemeler PDF bakınız, Roche) manyetik boncuk 10 ul (Invitrogen, malzemeler PDF) ve GFP antikor 2 ug ekle (1 x PBS, pH 7.4, 2.5 mM MgCI2) 1.5 ml bir tüp içinde . Gerektiğinde kullanılan boncuk ve antikor miktarı, sam hedefin miktarına göre optimize edilebilirple ve tanelere antikorun bağlanma afinitesi. </li><li> , Oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca rotasyon ile boncuk ve antikorun inkübe edin. </li><li> Manyetik rafa boncuklar ve antikor ihtiva eden 1.5 ml bir tüp (Malzeme PDF bakınız) yerleştirin ve boncuklar yaklaşık 1-2 dakika boyunca, manyetik bağlamaya olanak sağlar. Ilişkisiz antikor içeren süpernatantı ve 1 ml pipet kullanarak yıkama tamponu. Boncuklar mıknatıs bitişik tarafında 1.5 ml tüpün duvarına bağlı kalacaktır. </li><li> Bölüm 2.1.4 &#39;de tarif edildiği gibi her yıkama tampon içinde, 1 ml ile iki kez boncuk durulayın. Manyetik raftan 1.5 ml tüp çıkarın ve boncuk karıştırın ve her yıkama adımında yıkama tamponu kısaca ters. </li><li> Adım 2.7 ile devam etmek için hazır olana kadar yıkama tamponu içinde antikor-bağlı boncuk saklayın. Boncuklar protokol herhangi bir aşamasında kurumasına izin verilmemelidir. </li></ol></li><li> PBT, larva dokularından inceleyin ve etmek için parçalandı dokular aktarmak9-iyi bir yemeğin biri iyi. Tipik haliyle, 100, üçüncü instar larvaları arasındaki optik lob ve göz hayali diskin diseksiyon çekirdekleri ayrılmasından sonra, aşağı doğru gen ekspresyon analizi için yeterli malzeme sağlar. </li><li> Nükleer ekstre tamponu içinde izole edilmiş doku durulayın (10 mM HEPES-KOH, pH 7.5; 2.5 mM MgCI2, 10 mM KCI), 1.5 ml bir tüp içinde. Taze nükleer ekstre tamponu içeren 1 ml buz üzerinde (Malzemeler PDF bakınız), 1 ml Dounce homojenizatörü içine izole edilmiş larva dokuları aktarın. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu RNA izolasyonu çekirdekleri aşağıdaki ekstre edilecek ise, proteaz inhibitörlerinin eklemek gerekli değildir. </li><li> Gevşek havan tokmağı ile 20 darbeleri doku bozabilir ve daha sonra hücreler, şişmeye imkan vermek için 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe örnek. Sıkı havan tokmağı ile 15 vuruş kullanılarak hücrelerden çekirdek ekstrakte edin. Gevşek ve sıkı bir havan elleri ile dokunuşların sayısı farklı dokular ve hücre tipleri için optimize edilmesi gerekmektedir, aşırı homojen hale getirme neden olabiliryetersiz homojenleştirme dokudan tüm çekirdeklerin ayıklamak olmaz ise, çekirdek makaslanmış. </li><li> Nükleer homojenizasyon tampon maddesi ile prerinsed edilmiş bir 40 mikron gözenek boyutlu süzgeç (Malzemeler PDF bakınız) sayesinde, hücreler ve hücre artıklarının içeren Homojenat, filtre. Yeni bir tüp içinde, süzüldü Homojenat toplayın. </li><li> Çekirdekler verim, çekirdekleri bütünlüğünü belirlemek için, ve izolasyon çekirdeklerin önce hedef genlerin transkript seviyelerini belirlemek için bir sonraki analiz için ön izolasyon örnekleri toplayın. <ol><li> Bir pipet kullanarak yeni bir 1.5 ml tüp aktarın süzüldü homojenat 50 ul. Bu, ön yalıtım örneğidir. Trizol tepkin 500 ul ekleyin sonradan RNA izolasyonu (adım 3.1) -20 ° C&#39;de, karıştırmak için invert ve mağaza (Malzeme PDF, DİKKAT bakınız). </li><li> Yeni bir 1.5 ml tüp aktarın süzüldü homojenat 20 ul. <ol><li> 0.1 ug / ml &#39;lik bir son konsantrasyona DAPI ekleyin ve inc10 dakika boyunca buz üzerinde Ubate örneği. </li><li> Bir poli-lisin kaplı lamel DAPI ile boyanmış çekirdek transferi ve bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Net oje kullanarak lamel kapatılmalıdır. </li><li> Çekirdekler bütünlük ve floresan mikroskop kullanılarak ilgi GFP-etiketli çekirdeklerin varlığı kontrol edin. Not: Bu, çekirdekleri gidermek için, veya bunların slaytlar (24 saat içinde) hazırlanması Aşağıdaki oldukça hızlı bir şekilde analiz edilir ise GFP için leke için gerekli değildir. </li></ol></li><li> Yeni bir 1.5 ml tüp aktarın süzüldü homojenat 10 ul yıkama tamponu ve 90 ul (1 x PBS, pH 7.4, 2.5 mM MgCI2) ekleyin. 0.1 ug / ml &#39;lik bir son konsantrasyona DAPI ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. 10X hava objektif altında Epifloresans kullanarak DAPI-pozitif çekirdeklerin saymak Hemasitometre kullanarak ön-izolasyon numunesinde çekirdekleri verimi belirlemek. </li></ol></li><li> Manyetik bir rafa (bölüm 2.1.6 hazırlandı) antikor-bağlı boncuklar ihtiva eden 1.5 ml tüp yerleştirinve bölüm 2.1.4 &#39;de tarif edildiği gibi, manyetik boncuklar, en az 2 dakika boyunca mıknatısın bağlamak için izin verir. 1 ml pipet kullanarak antikora bağlı boncuklardan yıkama tamponunu çıkarın ve 1 ml bir pipet kullanılarak 1.5 ml tüp aşama 2.5 &#39;ten süzüldü Homojenat ekleyin. </li><li> Hafifçe karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin ve uçtan uca fazla çalkalama ile 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Mümkünse, bu çekirdeklerin topaklanma neden olabilir bu yana tüp içinde kabarcıklar kaçının. </li><li> Manyetik bir rafa antikor-bağlı boncuklar ve Homojenat ihtiva eden 1.5 ml tüp yerleştirin ve bölüm 2.1.4 &#39;de tarif edildiği gibi, manyetik boncuklar, en az 2 dakika boyunca mıknatısın bağlamak için izin verir. 1 ml pipet kullanarak, bağlanmamış çekirdekleri fraksiyonu içeren Homojenat çıkarın. </li><li> Yıkama 3x 1 ml her tampon örnek yıkayın. Tarif edildiği gibi boncuklar, bağlı çekirdek içeren 1.5 ml tüp çıkarın ve raftan yıkama tamponu ile pek çok kez çevrilerek karıştırılmıştır, daha sonra manyetik rafa tüp yerleştirmekadımda 2.9 ve 1 ml pipet kullanarak süpernatant kaldırmak. </li><li> Hedef çekirdeklerine bağlı olması boncuklar, yıkama tampon 150 ul ekle. Bu post-izolasyon örneğidir. Mikroskopi analizi ve sonraki RNA ekstraksiyonu için numune hazırlayın. <ol><li> Yeni bir 1.5 ml tüp ve DAPI ile leke transfer sonrası izolasyon örnek 20 ul ve bölüm 2.6.2 tarif edildiği gibi analiz edin. GFP + / + ve DAPI GFP-/DAPI + sonrası izolasyon numunedeki zenginleştirilmiş GFP + çekirdeklerin saflığını belirlemek için manyetik boncuk tarafından yakalanan çekirdek sayısı. </li><li> , Post-izolasyon numunenin geri kalanına Trizol reaktifi 1 ml ilave edilir karıştırmak için ters ve saklamak daha sonra RNA izolasyonu (adım 3.1) -20 ° C &#39;de. Not: Trizol numuneler gerektiğinde -20 ° C&#39;de birkaç hafta saklanabilir Bu, Trizol reaktif maddesi kullanılarak önce RNA ekstre manyetik boncuk çekirdek elüt edilmesi için gerekli değildir because Boncuklar daha sonra RNA izolasyonu karışmaz. </li></ol></li></ol> 3. Larva Dokular İzole Çekirdeğin içinde Transkript Düzeyleri belirleyin <ol><li> Aşağıdaki modifikasyonlarla (Malzemeler PDF bakınız) Trizol tabanlı RNA ekstraksiyonu için tarif edilen standart protokol kullanılarak bölümleri 2.6.1 ve 2.11.2 &#39;de hazırlanan ön izolasyon ve sonrası izolasyon RNA örneklerinden izole: <ol><li> RNA pelet ile presipitasyondan sonra, pelet RNase-içermeyen su içinde 19.2 ul ve RNASecure tepkin 0.8 ul (bkz. Malzeme PDF) ekleyin ve RNaz&#39;larına inaktive etmek için 20 dakika boyunca 60 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Üreticinin protokolü takip QubitR 2.0 florometre kullanılarak bu tür Qubit RNA deney kiti gibi bir floresan-RNA bağlayıcı boya (Malzemeler PDF bakınız) RNA konsantrasyonunun belirlenmesi. </li><li> Örneğin EpiScr gibi bir ters transkriptaz kullanılarak amplifiye cDNA sentezlemeipt üreticinin talimatlarına Transcriptase kiti ve oligodT Ters primerleri. Not: Genellikle, RNA 50-100 ng birden fazla gen ekspresyonu analiz gerçekleştirmek için yeterli cDNA oluşturur. Önceden izolasyonu ve post-RNA izolasyon eşdeğer miktarları cDNA oluşturmak için kullanılmalıdır. </li><li> Bu 10-kat önce, gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) analizi seyreltilmesi için 20 ul cDNA numunesine nükleaz içermeyen su içinde 180 ul ekleyin. Sulandırılmamış cDNA örnekleri qPCR inhibe çünkü bu seyreltme, önemli bir adımdır. </li><li> Polimeraz ve dNTP, 4 pmol ileri her biri ile bir QPCR ana karışım hazırlanarak, ters primer, 20 ul nihai reaksiyon hacmi için steril su ile oluşur. <ol><li> Ilgilenilen bir hücre tipinde eksprese beklenmektedir genleri hedef ve doku toplanmış edildiği gelişim aşamasında QPCR için primerler dizayn. Bir intron span astar tasarımı mümkünse, o kadar genomik vecDNA PCR ürünleri ayırt edilebilir. Not: Hedef hücre tipinin gen ekspresyon profili bilinmiyorsa, etiketli çekirdekler popülasyonunda spesifik olarak ifade edilmelidir eGFP karşı primerler, belirli bir hücre tipi ve dokusunda (Tablo 1) için protokol optimize etmek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Bütün dokusundan hazırlanan cDNA&#39;dan bir seyreltme serisi ile karşılaştırma ile ön izolasyon ve sonrası izolasyon örneklerde, ilgi konusu her genin nispi transkript seviyelerini belirlemek. Hedef genlerin transkript seviyeleri, Rpl32 (ya da tercihen çok sayıda referans genler) gibi bir referans genine normalize edilmesi gerekmektedir. </li></ol>

<ol>
	<li>Weake, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcription+initiation+function+of+the+ubiquitous+SAGA+complex+in+tissue-specific+gene+activation.">Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation.</a> Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).</li><li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+chromatin+immunoprecipitation+from+multicellular+complex+samples+using+BiTS-ChIP.">Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP.</a> Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).</li><li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3'-end-seq.">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).</li><li>Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+contributions+of+the+nuclear+and+cytoplasmic+compartments+to+global+gene+expression+in+human+cells.">Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells.</a> BMC Genom. 8, 340 (2007).</li><li>Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+characterization+of+cell-specific+gene+expression+through+fluorescence-activated+sorting+of+nuclei.">Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei.</a> Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+gene+expression+and+chromatin+profiling+of+individual+cell+types+within+a+tissue.">A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue.</a> Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genom. Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+and+SUN+proteins.">KASH and SUN proteins.</a> Curr Biol. 21, 414-415 (2011).</li><li>Fischer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klarsicht+has+distinct+subcellular+localization+domains+for+nuclear+envelope+and+microtubule+localization+in+the+eye.">Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye.</a> Genetics. 168, 1385-1393 (2004).</li><li>Patterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+Klarsicht+and+nuclear+lamin+in+developmentally+regulated+nuclear+migrations+of+photoreceptor+cells+in+the+Drosophila+eye.">The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+KASH+domain+protein+MSP-300+plays+an+essential+role+in+nuclear+anchoring+during+Drosophila+oogenesis.">The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).</li><li>Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klaroid+encodes+a+SUN+domain+protein+required+for+Klarsicht+localization+to+the+nuclear+envelope+and+nuclear+migration+in+the+eye.">Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye.</a> Fly. 1, 75-85 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).</li><li>Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+Drosophila+nervous+system.">Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, Drosophila embriyonik ya da larva dokularda karma hücre popülasyonlarından, özellikle etiketli ya da yüksek ölçüde çekirdek izole zenginleştirmek için kullanılabilir. Bu protokolü kullanarak, çekirdekler, yaklaşık 1 saat içinde kesilmiş dokularından izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdeklerin saflığı ve verimi deneysel her hücre tipi için belirlenmelidir. Çünkü numunede mevcut boncukların hemasitometre kullanarak protokol sonrası izolasyon aşamasında boncuk-bağl...

Gibi, merkezi sinir sistemi gibi dokularda Drosophila hücre tipleri karmaşık bir karışımını içerir. Bu nedenle, Drosophila dokulardan hücreye spesifik gen ekspresyon profillerini analiz etmek için, bu alt uygulamaları sağlamak için yeterli miktarlarda spesifik hücrelere homojen bir popülasyonu izole etmek için ilk olarak gereklidir. Dokulara hücreleri izole etmek için yöntemler lazer mikrodiseksiyon ve bütün hücre sınıflandırması (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre içerir. FACS 1-3 gen ekspresyonu ve kromatin için Drosophila embriyolardan ve Caenorhabditis elegans hücreler ve çekirdekler izole etmek için kullanılmış olsa da, FACS ve lazer mikrodiseksiyon yüksek harmanlanmış hücre tipleri ya da içeren hücreler ile birlikte içeren dokularda başarılı bir şekilde gerçekleştirmek zor olabilir nöronlar gibi düzensiz morfolojisi. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, çok hücrelere göre çekirdek, özel hücre tipleri izole edilmiştir ve daha sonra gen için kullanılabilire ekspresyon profili. Önemli olarak, nükleer RNA numuneleri kullanılarak mikro-dizi-bazlı mRNA ifadesi analiz, toplam RNA 4, 5 kullanılarak gerçekleştirilmiştir genel olarak benzer sonuçlar göstermektedir. Ayrıca, nükleer RNA kullanılarak gen ekspresyon analizi başarılı bir şekilde C de dahil olmak üzere bir çok mikroorganizma gen ifadesini incelemek için kullanılmıştır elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila ve insanlar 4, 5, 2, 3. Yakın zamanda çeşitli yaklaşımlar gen ekspresyon analizi ve / veya kromatin immüno için uygun olan Drosophila dokulardan etiketli çekirdeklerinin özel popülasyonlarının izole edilmesi için anlatılmıştır. Immünopresipitasyon (bit çipli) yöntemi için dokuya özel kromatin toplu izolasyonu nükleer lokalize GFP 2&#39;nin hücre türüne özgü ifade bazında sabit bir çekirdek izole etmek için FACS kullanır. Bu yaklaşım, su olmuşturccessfully Drosophila embriyoların 2&#39;nin mezodermden izole edilmiş çekirdeklerin Kromatin immüno-çökeltmesi kullanılarak histon modifikasyon ve transkripsiyon faktörlerinin dağılımı analiz etmek için kullanılır. Bununla birlikte, FACS-bazlı yaklaşımlar nedeniyle alt uygulamalar için uygun numaraları elde etmek için gerekli olan yüksek sıralama zaman bir karışık nüfusun sadece küçük bir kısmını oluşturan etiketli çekirdek izole edilmesi için daha az uygun olabilir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, birkaç grup özel bir hücre tipinde belirli bir epitop ile etiketlenir çekirdek saflaştırılması için afinite bazlı izolasyon teknikleri kullandık. Arabidopsis thaliana 6, 7 kullanılmak için geliştirilmiş, özel hücre tipleri (bozulmamış) yöntemi etiketli çekirdeklerin son izolasyonu Drosophila 8 kullanılmak üzere adapte edilmiştir. Bu yöntemde, in vivo biyotinilasyon için bir substrat olan bir çekirdek zarı füzyon proteini olup coexpresspesifik hücre tiplerinde Escherichia coli biotin ligazı BirA ile sed. Biotin-etiketli çekirdekler ardından streptavidin bazlı afinite izolasyonu kullanarak karışık popülasyonlardan saflaştırılabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, çekirdek çekirdek zarı başarılı bir füzyon proteini, bir mezoderm özgü arttırıcı 8 kontrolü altında eksprese edildiği, Drosophila embriyoların mezodermden etiketlenmiş ve izole edilmiştir. Yazarlar ayrıca, Gal4 düzenleyici dizi, UAS 9 kontrolü altında, herhangi bir hücre tipinde ifade edilebilir çekirdek zarı füzyon proteinlerini oluşturulur. Bu yaklaşım, hızlı bir şekilde karışık nüfusu etiketli çekirdeklerinin alt kümelerini izole edilmesi yeteneğine sahiptir, ama üç farklı transjenik yapıları gerektirir ve bu nedenle de, özellikle genetik uygulamalar için uygun olabilir. Son zamanlarda, bir yaklaşım SUN (S AD1 ve UN C-84), nükleer zarfın iç zarına lokalize etki alanı içeren proteinler ile etiketlendi edildiği tarif edilmiştirfloresan proteinleri ve Gal4/UAS sisteminin 10 kontrolü altında ifade edilmiştir. Çekirdekler nükleer zarfın dış zar kaldırmak için iyonik olmayan deterjanın varlığında, izole edilir ve anti-GFP antikorları bağlanmış manyetik boncuklar kullanılarak afiniteyle saflaştırıldı. Bu yaklaşım, Drosophila 10 yetişkin beyin içinde spesifik sinir hücresi alt tiplerinin etiketli çekirdeklerin küçük popülasyonlarının izole edilmesi için kullanılmıştır. Burada, Drosophila larva dokudan hücrelerin karışık bir nüfusu etiketli çekirdeklerin izolasyonu için bir protokolü tarif edilmektedir. Bu yöntem, bağımsız bir şekilde, geliştirilmiş, ancak Henry vd. 10 Birinci tarafından açıklanan yaklaşım benzer olan, çekirdek karışık popülasyonlarında etiketli çekirdeklerin daha sonra izole edilmesini kolaylaştırmak için, sadece Drosophila melanogaster, spesifik hücre tiplerinde ifade edilen bir floresan etiket ile etiketlenmiş afinite-temelli bir yaklaşım kullanarak. Çekirdekler etiketlemek için,KASH (K larsicht / A nc-1 / S yne h omology) etki kullanılmıştır. KASH etki perinükleer alanı 11 içinde SUN etki alanı içeren proteinleri ile etkileşim yoluyla kısmen nükleer zarfın dış membran, lokalize bir transmembran etki alanıdır. Bunların N-terminal etki alanları, örneğin sitoplazma içinde 12-14, aktin ya da mikro tüpler gibi hücre iskeleti proteinleri ile etkileşim sırasında Drosophila Msp-300 ve Klarsicht gibi proteinlerin C-terminal KASH etki, dış nükleer membran proteinleri için, bu tutturur. Konstruktlar hangi Drosophila Msp-300 KASH etki pUAST-attB vektörü 15, 16 &#39;de Gal4 düzenleyici dizi, UAS kontrolü altında, EGFP C-terminine kaynaştırılmıştır üretilmiştir. PhiC31 siteye özgü entegrasyon kullanılarak, transjenik sinekler oluşturulan UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgen kromozomu üzerindeki attP2 lokus olarak sokulmuştur hangi3L 17. UAS-EGFP :: Msp-300 KASH uçan, ilgi konusu bir hücre tipinde dış çekirdek zar üzerinde EGFP hedeflenen eksprese edilmesine yol açan, özel bir hücre tipinde ifade Gal4 sürücü sinek ile çaprazlanabilir. Etiketli çekirdekleri daha sonra manyetik boncuklara bağlanmış GFP karşı antikorlar kullanarak karışık hücre popülasyonlarından saflaştırılabilir. Bu yaklaşımda, iyonik olmayan deterjanın kullanımı EGFP etiket dış çekirdek zarının sitoplazmik yanı lokalize olduğu için gerekli olan ve bu nedenle, antikorlar için erişilebilir değildir. Aşağıda tarif edilen protokol saflık ve izole edilmiş verimi çekirdeklerin ölçmek için, Drosophila larva dokularda spesifik hücre tiplerinden EGFP etiketli çekirdek zenginleştirmek / izole etmek ve (kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için uygun nükleer RNA çıkarmak için kullanılabilir qRT -PCR) gen ekspresyon analizi. Çekirdeklerin izolasyonu ve afiniteyle saflaştırma (tissu hariçdiseksiyon e) en az bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Sonuçlar glial çekirdekleri başarıyla larva optik lob ve göz hayali diskten izole edilir ve daha sonra gen ekspresyon analizi için kullanılabileceğini gösteren sunulmaktadır. Bu yaklaşım, hedef hücreler, genel nüfusun% 5&#39;ten az teşkil eden embriyonik ve larva dokularından etiketli çekirdeklerin izolasyon / zenginleştirilmesi için yararlı olacağı tahmin edilmektedir. Bu çalışmada oluşturulan tüm Drosophila hisse senetleri ve plazmalar istek üzerine yazarlarda mevcuttur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1884">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td style="width:263px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:195px;">mAB24B10</td>
			<td style="width:828px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BEQPCR-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dounce Homogenizer (1 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62400-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EpiScript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>ERT12910K</td>
			<td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon cell strainers, 40 &#956;m pore size</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Mini tube rotator</td>
			<td style="width:263px;">Genemate</td>
			<td style="width:195px;">H-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:599px;">Qubit starter kit</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">Q32871</td>
			<td style="width:828px;">Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RNAsecure (Ambion)</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">AM7010</td>
			<td style="width:828px;">The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RT-PCR machine Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">CFX Connect Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Siliconized 9 well glass plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 - 460nm) excitation + yellow barrier</td>
			<td style="width:263px;">Nightsea</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf" >http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

Drosophila melanogaster embriyonik ve larva dokular genellikle bu dokularda gen ekspresyon analizi karmaşık hücre türleri arasında yüksek ölçüde heterojen bir karışımı içerir. Bu nedenle, Drosophila dokulardan hücreye spesifik gen ekspresyon profillerini analiz etmek için, yüksek saflıkta ve bu transkripsiyon profil ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için yeterli bir verimde özel hücre tiplerini izole etmek için gerekli olabilir. Bununla birlikte, bu dokularda spesifik hücre tipleri nadir nüfusu ile birleştiğinde örneğin merkezi sinir sistemi gibi dokularda düzensiz hücre morfolojisi, ayırma lazer mikro-kesim ve floresans ile aktive edilmiş hücre gibi hücre izolasyonu için geleneksel yöntemlerle (FACS) zorluklar oluşturabilir . Burada, etiketlenmiş çekirdeklerin afinite bazlı izolasyon yerine, tüm hücreleri kullanılarak hücre spesifik gen ekspresyon profillerini karakterize için alternatif bir yaklaşım tarif edilmektedir. Belirli c çekirdeklerilgi ell tür genetik olarak Gal4/UAS ikili sentezleme sistemi kullanılarak bir çekirdek zarı-lokalize EGFP etiket ile etiketlenir. Bu EGFP-etiketli çekirdekleri manyetik boncuklara bağlanmış olan GFP karşı antikorlar kullanılarak izole edilebilir. Bu protokol açıklanan yaklaşım, bu hücre tipleri, toplam hücre popülasyonunun en az% 2 edilmiş olsa dahi, yüksek saflıkta Drosophila larva, merkezi sinir sisteminde ve ekspresyon analizi için yeterli seviyelerde özel hücre tiplerinden çekirdeklerinin tutarlı izolasyonu sağlar doku. Bu yaklaşım, Drosophila embriyonik ve belirli Gal4 sürücüleri kullanarak larva hücre tipleri çok çeşitli çekirdek izole etmek için kullanılabilir, ve FACS veya lazer mikro-kesim için uygun değildir hücre tiplerinden olan çekirdek izole edilmesi için faydalı olabilir.

Repo-GAL4 sürücü (Bloomington stok no 7415) özel olarak bir gelişme 18 çeşitli aşamalarında Drosophila sinir sistemindeki glial hücrelerde ifade edilir. Sinekler stabil standart genetik teknikler kullanılarak repo-GAL4 sürücünün kontrolü altında UAS-EGFP :: Msp-300 KASH ifade eden üretildi. EGFP ifade deseni :: KASH transgen Bu sinekler karakterize etmek için, üçüncü instar larvaları arasındaki kesilerek optik lob ve göz hayali disk GFP ...

Watch this Scientific Journal Video about Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis | Biology | Video

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila dokusu sık sık hücre tipleri heterojen bir karışım içerir. Belirli bir doku, spesifik hücre tiplerinde gen ekspresyonunu incelemek için, çekirdekler, genetik olarak etiketlendi ve daha sonra bir afinite dayalı bir yaklaşım kullanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdek bu gen ekspresyon analizi ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için kullanılabilir.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

affinity-based-isolation-tagged-nuclei-from-drosophila-tissues-for

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Genetics

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

14.6K Görüntüleme.  Purdue University.  Drosophila dokusu sık sık hücre tipleri heterojen bir karışım içerir. Belirli bir doku, spesifik hücre tiplerinde gen ekspresyonunu incelemek için, çekirdekler, genetik olarak etiketlendi ve daha sonra bir afinite dayalı bir yaklaşım kullanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdek bu gen ekspresyon analizi ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için kullanılabilir. 

Video: Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Biyoloji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.