Maaşlar ve araştırma desteği Amerika Birleşik Soya Kurulu tarafından sağlanan ve Eyalet ve Federal fonları tarafından Ohio State Üniversitesi / Ohio Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Merkezi için tahsis edildi. Bu araştırma da kısmen CONACYT, Meksika, CMHG bir burs ile desteklenmiştir. Ticari marka veya tescilli ürünlerin Mansiyon OSU / OARDC ürünün garanti veya garanti teşkil etmez ve aynı zamanda uygun olabilir diğer ürünleri hariç olmak üzere onay anlamına gelmez. Dergi Makalesi yok HCS 09-17.

Aşağıdaki yöntem, otomatik bir görüntü toplama sistemi kullanılarak gen ekspresyonu görüntü analizi için bir protokol özetliyor. Açıklama kolaylığı için, genel yaklaşım dört adım bozuldu: 1) tohum hazırlama, 2) partikül bombardımanı, 3) robot resim koleksiyonu, ve 4) görüntü analizi kullanılarak gen giriş. Bu genel metodoloji diğer uygulamaların geniş bir aralığı için kullanılabilmesine rağmen, protokolleri mevcut setleri aynı parça izleme gen ekspresyonu için yararlı bir muhabir gen olan yeşil floresan proteininin (GFP) gen, kullanımı dayanmaktadır zaman içinde yaşayan doku. I. Tohum Hazırlama <ol><li> Lima fasulyesi (Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) tohum satın ya da ideal bir büyüme odasında yetişen bitkiler (% 50 bağıl nem, 16 / 8 saat aydınlık: karanlık, 25/23 ° C gün / gece) hasat edilebilir. Hasat sonrası tohum kalitesi, -20 ° C&#39;de depolama tohumları muhafaza edilebilir </li><li> Tohumların çimlenme için Kırmızı GA7 kapları hazırlayın. Kapak filtre kağıdı veya kağıt havlu Kırmızı kutuları altındaki uygun. Kağıt havlu nemlendirin ve emilmeyen su dökmek için her konteyner ~ 25 ml deiyonize su ekleyin. Otoklav 20 dakika ıslatılmış kağıt içeren kutularda. </li><li> 50 ml tek kullanımlık santrifüj tüpleri kullanarak, 60 rpm&#39;de Konili çalkalayıcı sallayarak 20 dakika% 10&#39;luk ticari çamaşır suyu çözeltisi (20-40 ml 20 tohum) tohumlar sterilize edin. Not: sonraki adımları bir laminer akış kaputu yapılmalıdır. </li><li> 30 saniye süreyle yavaşça sallanarak her durulama sırasında steril deiyonize su ile tohum 4-7 kez durulayın. </li><li> Her steril Kırmızı kutusunda bulunan katlanmış kağıt tabakaları arasında 5-6 kısır tohumlar yerleştirin. </li><li> 4 gün boyunca 25 ° C, saat aydınlık 16 / 8:: koyu ve 40 μEm -2 s -1 aşağıdaki koşullar altında tohumları inkübe edin. </li></ol> II. Partikül Bombardıman kullanarak Gen Giriş <ol><li> Gen yapıları ile favori canlı dokularda izlenebilir bir muhabir gen ekspresyon vektörü kullanarak oluşturun. Biz organizatörü ve organizatörü element analizleri için yüksek bir kopya sayısını ifade vektör yararlı mühendislik var. Bu vektör, GFP geninin promotör / dönüştürülmüş dokularda organizatörü elementi fonksiyonu görselleştirmek için kullanılan içerir . </li><li> 1-2 civarındadır, fide çimlenme bombardımanı, tüketim lima fasulyesi kotiledonlarında önce saat ve tohum kat çıkarın. Bombardımanı için uygun kotiledonlarında sarı, yeşil, düz ve daha fazla görüntü analizi engel olabilecek herhangi bir hasar serbest ışık olmalıdır. </li><li> OMS MS tuzları 1, B5 vitaminleri hemen eksize edildikten sonra 2,% 3 sakkaroz ve% 0.2 Gelrite (pH 5.7) içeren kültür ortamı yerleştirin kotiledonlarında. </li><li> DNA M10 tungsten parçacıklar (Sylvania, Towanda, PA, USA) üzerine inşa çöktürün. 0.6 ml mikrofuge&#39;de tüp, 25 ul tungsten parçacıklar (partiküller sağ kullanmadan önce steril su, 100 mg ml -1 yeniden süspanse), 5 ul DNA (1 mg ul -1), 25 ul 2.5 M, kalsiyum klorür ( Sigma -Aldrich Kedi C3881-500G) ve 10 ul 100 mM spermidin (Sigma Kedi S-2626). Vortex kısaca tüm bileşenleri iyice karıştırın. </li><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde DNA hazırlığı inkübe edin. Sonra, kaldırmak ve 50 ul süpernatant atın. </li><li> Vorteks ile kaplı DNA parçacıkları yeniden süspanse edin ve hemen 2 ul kısım kaldırmak. Bu vorteks adım her zaman bir kısım tüp çıkarılır tekrarlayın. Buz Kaplı parçacıklar tutulur ve 15 dakika içinde kullanılmalıdır. </li><li> Filtre ekranın ortasında top, yerden bir şırınga filtresi 2 ul kaplı partiküller. Partikül silah odasının içine filtre tutan birim kaplı partikül filtre ünitesi yerleştirin. </li><li> Lima fasulyesi kotiledon adaxial tarafında bir siper üzerine yerleştirin ve partikül silah odasının baffle. Bir kabın dibine erimiş bir ekran oluşur baffle, bombardıman sırasında dokuları desteklemek için bir platform olarak kullanılır. </li><li> Parçacık Gun (Bu metodoloji, biz laboratuarımızda tasarlanmış basit ve ucuz bir Partikül Girişlerinin Ülkelere Göre Silah 3, PIG,) kullanarak Bombard dokuların aşağıdaki gibidir; a) &#39;den sonra odanın tahliye için vakum giden vana, b) açık vakum parçacık bombardımanından sonra, vakum hattı vanasını kapatın ve egzoz vanası kullanarak vakum bırakın (30), 760 mm Hg, solenoid etkinleştirmek ve parçacıklar sevketmek için helyum serbest, c) ulaşır. Parçacıkları hızlandırmak için kullanılan helyum basıncı 50 PSI. </li><li> Vakum yayımlandıktan sonra, bombardıman kotiledonlarında almak ve OMS kültür ortamı, kotiledon adaxial tarafına iade odasının kapısını açmak. Not: kantifikasyon ve ifade profili için, biz genellikle üç kotiledonlarında her DNA oluşturmak için en az bombardıman. Genellikle bir DNA pozitif kontrol,iyi çalışılmış bir gen ekspresyon profil veren yapı, bir referans olarak yer almaktadır. </li></ol> III. Otomatik Image Collection <ol><li> Cıva lambası açın ve ısınmak için lamba için 30 dakika bekleyin. </li><li> Spot RT CCD kamera (Diagnostic Instruments Inc, Sterling Heights, MI, USA) ve robotik platformu hareket sürücüleri robotik platformu motor kontrol, güç kaynakları açın. </li><li> MZFLIII diseksiyon mikroskobu (Leica, Heerbrugg, İsviçre); GFP algılama (Ex 480/40 nm, Em. GFP2 filtre seti 510 LP) için filtre seti. </li><li> % 70 etanol ile püskürterek kalınlaşmış polikarbonat Petri kabı kapaklarını sterilize edin. Özel kapaklar, resim koleksiyonu 4 Petri kabı tabanı sırasında yoğuşmayı önlemek karşılamak için kullanılır. </li><li> Otomatik görüntü toplama sisteminin robotik platformu (Arrick Robotik, Hurst, TX, ABD) bombardıman kotiledonlarında içeren tabak koyun. Robotik platformu bir step motor seti tarafından tahrik ve 8 Petri kutularına tutturulması için bir tablo oluşmaktadır. Bu platform, polikarbonat, polipropilen ve alüminyum inşa edilmiştir. Tabaklar, lateral plastik set-vida sıkma pozisyonda bağlanır. </li><li> Robotik platformu ve görüntü elde etme hem de kontrol eden özel yazılım uygulamasını açın. Ayrıca, yazılım beyaz ışık kontrol anahtarı açın. </li><li> &quot;Motor hareket&quot; sekmesinde, &quot;Motor&quot; ve &quot;motor ev&quot; tıklatın. Yazılım başlangıç ​​konumuna platformu yönlendirir sonra, biz her kotiledon pozisyonları girmeye başlamak için hazırız. </li><li> &quot;Motor hareket&quot; sekmesinde, ilk plaka seçin. Bu platform, mikroskop amacı altında Petri kabı merkezi yer alacak. Hareketli mesafe düğmelerini kullanarak, tam resim koleksiyonu için ilk kotiledon pozisyon. Beyaz ışık denetleyicisi ile, hedef bölge &quot;canlı mode&quot; özelliği çevirerek bilgisayar monitörü aracılığıyla gözlenebilir. </li><li> Ilk kotiledon için diseksiyon mikroskobu manuel düğmeleri kullanarak odağı ve büyütme (1.6x büyütme tercih edilir) ayarlayın. Her plaka altında bulunan üç tesviye vidaları kullanarak robotik bir platform üzerinde, aynı plaka üzerinde kalan kotiledonlarında için odak ayarlamaları yapılır. </li><li> Ilgi bölge edildikten sonra, &quot;Bu pozisyonda ekle&quot; düğmesini tıklatın. Yazılım, bir pozisyonda zamanlama dosyası bu bölgenin koordinatları katacak ve platform plaka merkezine geri dönecektir. </li><li> Konumlarını ayarlayın ve hareketli mesafe düğmeleri ve manuel tesviye vidaları kullanarak plakalar üzerinde kalan tüm kotiledonlarında için odak. Kotiledonlarında tüm koordinatları girildikten sonra, pozisyon program koordinatları kaydedin. </li><li> Resim koleksiyonu parametreleri girin. Beyaz ya da mavi &quot;görüntü ayarı&quot; sekmesinde, ışığın istenmediği türünü seçin. GFP tespiti için, sadece mavi ışık kullanılmalıdır. Ayrıca, pozlama ayarı girin. Biz bağımsız, kırmızı, mavi ve yeşil renk için maruz kalma zaman değiştirebilirsiniz olsa da, genellikle bizi doğrudan yapmak ve izin GFP foto-belgeler (20, 14 ve 14 sn sırasıyla kırmızı, yeşil ve mavi kanalları için) için aynı ayarları kullanabilirsiniz farklı DNA yapıları arasında tutarlı karşılaştırmalar. </li><li> Aynı &quot;görüntü ayarı&quot; sekmesinde, boş bir klasöre görüntüler saklanabilir belirtin. Her dizi görüntüyü kotiledonlarında için girilen pozisyonların sırasına göre sıralı olarak numaralandırılmış, bağımsız klasörlerde bu ana klasör içinde saklanır. </li><li> &quot;Yakalama zaman kontrolü&quot; sekmesine gidin ve görüntü elde etme zaman aralığı ve resim koleksiyonu döngüleri toplam sayısını ayarlamak. Görüntüler genellikle iyi tanımlanmış bir gen ekspresyon profilleri üreten, 100 saat boyunca her saat toplanır. </li><li> Tıklayarak görüntü elde Başlat &quot;programı çalıştırın!&quot; &quot;Konum programı&quot; sekmesinde yer alan düğmesine basın. </li><li> 100 saat görüntü toplama sonunda, daha fazla görüntü analizi için herhangi bir büyük kapasiteli sabit disk veya bilgisayar robotu kontrol eden bilgisayar tüm görüntüleri aktarabilirsiniz. Yüksek çözünürlüklü görüntüler (1600 x 1200 piksel) ~ 5 Mb her ölçüm TIF dosyalarını olarak toplanır. </li></ol> IV. Görüntü Analizi <ol><li> Adobe ImageReady kullanarak her bir klasör 100 ardışık görüntüleri birleştirin. <ol><li> ImageReady açın ve ithal çerçeveler gibi bir dizi oluşturan tüm sıralı görüntüleri. </li><li> 800 x 600 piksel orijinal görüntüleri yeniden boyutlandırma. Toplanan görüntüler, yüksek çözünürlüklü görüntü işleme yavaş yapabilir büyük dosyalar oluşturur. </li><li> Görüntüleri ilerleyin ve çoğu görüntü görünür bir yerinde (ler) bulabilirsiniz. </li><li> Seçilen nokta (lar)% 300 kadar yakınlaştırma. Daha kesin bir kayıt için daha yüksek büyütme kullanarak görüntüleri uyum sağlar. </li><li> Tüm resimlerin üstüne bir katman ekleyin ve emin tüm çerçeveler içinde görünür yapmak. &quot;Fırça&quot; aracını kullanarak spot (ler) konumu işaretleyin. </li><li> &quot;Taşımak&quot; aracını kullanarak tüm kareleri hizalayarak ve bir referans olarak katman işaretleri alarak başlayın. </li><li> Hizalama tamamlandığında, bir referans olarak kullanılan katman silmek ve tek bir &quot;PSD&quot; dosya olarak görüntüleri kaydedebilirsiniz. Ayrıca, en yüksek çözünürlükte tek bir &quot;mov&quot; dosyası olarak tüm kareleri ihracat. Her resim serisi Manuel uyum ~ 10 dakika sürer. </li></ol></li><li> ImageJ kullanarak gen ekspresyonu ölçümü yapın. <ol><li> ImageJ yazılımı açın ve &quot;mov&quot; dosyasını açın ImageReady önceden kaydedilmiş. </li><li> Seçim aracı kullanarak, 400 x 300 piksel alanı ve görüntü kırpma seçin. Bu yeni bir dosya, bir &quot;avi&quot; dosyası olarak kaydedilmesi gerekir. </li><li> &quot;Görüntü&quot;, &quot;renk&quot; ve ImageJ &quot;RGB split&quot; tıklayarak, kırmızı, mavi ve yeşil kanalları yeni &quot;avi&quot; dosyası bulunan sıralı resimler, ayırın. </li><li> , Yeşil ve kırmızı kanallar tüm görüntüleri arka plan floresan çıkarma. Yeşil kanal görüntü serilerini kullanarak, 20 x 20 piksel alanı olmayan ifade hücreleri ile bir bölge seçin ve aynı bölgede, her iki kanal seçilecektir, böylece &quot;ROI Yöneticisi&quot; aracı konumunu kaydetmek. Yeşil kanal aktif 20 x 20 piksel kare ImageJ görev çubuğunda bulunan &quot;plugins&quot; komutuna gidin ve sonra plugin-aracı &quot;her bir dilim için çıkarma ölçülen ROI&quot; tıklayın. </li><li> ImageJ, &quot;eşik&quot; GFP ifade piksel tanımlamak veya segment &quot;ayarlamak&quot;, &quot;Resim&quot; üzerine tıklayın. Eşik seviyeleri ortalama 20-30 piksel bir nokta boyutu elde etmek için eşik penceresinde çubuğunu sürükleyerek ayarlayın. </li><li> Piksel başına ortalama değeri ve toplam sayısı GFP ifade piksel gri tonlu ölçmek için tasarlanmış bir eklenti kullanarak GFP ifade belirleyin. </li><li> Microsoft Office Excel içine ImageJ ve yapıştırma değerleri ortalama çıkış kopyalayın gri tonlama. Toplam sayısına göre ortalama çarpılarak her bir kanal için (kırmızı ve yeşil), GFP ifade hesaplayın piksel başına değeri gri tonlama GFP-Her kanal için piksel ifade. Her iki kanal için ifade değerleri toplamı, GFP bir ifade verir. Değerler gen ekspresyon profilleri göstermek ve doğrudan karşılaştırmalar yapmak için kullanılabilir. Time-lapse animasyonlar da eşsiz bir gen ekspresyon profili ve net bir görselleştirme sağlayarak, &quot;mov&quot; veya &quot;avi&quot; dosyaları kullanarak oluşturulabilir. </li></ol></li></ol> V. Temsilcisi Sonuçlar Robot görüntü toplama ve analiz prosedürü (Şekil 1) gen ekspresyonu üzerine nicel veri kısa bir süre içinde büyük miktarda satın alma sağlar bildirdi. GFP geninin kullanarak bitki organizatörü karakterizasyonu için, bu yöntem sadece geçici ekspresyon profillerini (Şekil 2) oluşturmak için değil, aynı zamanda, geçici ve istikrarlı bir şekilde dönüştürülmüş bitki dokularında 5,6 detaylı bir şekilde GFP ifade izlemek için kullanışlı değildir . Kısa zaman atlamalı animasyonlar toplanan sıralı görüntüleri ile oluşturulan bitki dokularında zamanla gen ekspresyonu derinlemesine analizler için değerli bir araçtır. Bu metodoloji de gen ekspresyonu doğrudan etkileyen faktörleri değerlendirmek için harika bir uygulama vardır. Örneğin, geçici GFP ekspresyonu viral kökenli sessizliğini farklı bastırıcılarının varlığı altında başarılı bir şekilde otomatik görüntü toplama ve analiz sistemi 7,8 kullanılarak çalışıldı olmuştur. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Görüntü analizi prosedürü dört temel aşamadan oluşmaktadır. (A) kullanarak görüntü serisi robotik görüntü toplama sistemi, (B) ayrılması, kırmızı, mavi ve yeşil kanalları görüntüleri, (C), eşik seviyeleri ayarlayarak ifade piksel segmentasyon, ve (D) çıktı sonuçlar elde Alımı içeren gri tonlama değerleri ve GFP ifade odak sayma. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2, GFP için erimiş bitki rehberleri tarafından yönlendirilen farklı geçici ekspresyon profillerini gösteren Grafik . Veriler bizim robot görüntü toplama sistemi kullanılarak toplanan ve ImageReady ve ImageJ yazılım ile analiz edildi.

<ol>
	<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells.">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li><li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells.">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li><li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids.">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li><li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis.">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li><li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+two+highly+active+soybean+(Glycine+max+(L.)+Merr.)+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system.">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li><li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing.">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li><li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression.">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li></ol>

Robot kullanımı, insan hayatının farklı yönlerini büyük uygulamalar vardır; özellikle, robotlar sıkıcı ve karmaşık faaliyetlerin etkin bir şekilde otomatikleştirmek için, ve daha hassas bir şekilde görevlerini yerine getirmek için, tehlikeli ortamlarda faaliyetlerini gerçekleştirmek için kullanılır olmuştur. Moleküler biyoloji, ve özellikle gen ekspresyon analizi, robotlar, genlerin sadece özellikleri değil, aynı zamanda zamanla doku büyüme ve gelişme izlemenize yardımcı olabilir. Birçok biyolojik olayların tek bir zaman noktasında gözlemlerini kullanarak takip etmek zor olabilir, dinamik olarak ortaya çıkar. GFP geninin ekspresyon çalışmaları için kullanımı doku yanıtı ve büyüme gözlemlemek için ek avantajlar getiriyor. Deneysel prosedürleri için, GFP, GFP algılama tahribatsız olduğu gibi zaman içinde aynı doku parçası gen ekspresyonu takip sağlar. Ayrıca, GFP protein sürümü algılanmasına izin vermek için yeterince kararlı değil, aynı zamanda bize, yükseliş ve gen ekspresyonu düşüş takip etmesine, bitki dokularında birikmesi en aza indirmek için bazı ciro gösterir. Biz zaten çok geniş bir uygulama yelpazesi için robot görüntü toplama ve analiz sistemi kullanılmaktadır var. Biz bir fenomen dinamik bir anlayış istenilen birçok biyolojik uygulamaları için yüksek potansiyeli öngörüyoruz. Örneğin, bitki dokularında büyüme ve gelişme, değerli bilgiler / bu süreçleri hakkında bilgi veren sistemi kullanılarak takip edilebilir. Ayrıca, GFP gibi muhabir genleri kullanarak protein taşıma dinamikleri, zaman atlamalı animasyonlar kullanarak kolayca görüntülenebilmekte olabilir. Bu raporda açıklanan yöntem, teknik, karmaşık ama kavramsal olarak basittir. Bizim sonuçlarımız sağlam ve sürekli yeni uygulamalar keşfedilmektedir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>Software</td>
<td>U. S. National Institutes of Health</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

robotics and dynamic image analysis for studies of gene expression in plant tissues

Gen ifadesi, genellikle bitki dokularında bitki dokularında bileşiklerin yıkıcı ekstraksiyon çalışılmıştır.<em&gt; In vitro</em&gt; Analiz eder. Yöntemleri burada yeşil floresan protein (yararlanmak sundu<em&gt; GFP</em&gt; Zamanla dokuların aynı adet gen ekspresyonu sürekli izlenmesi için) gen.<em&gt; GFP</em&gt; Gen farklı yararlanıcı düzenleyici kontrol altına yerleştirilen ve lima fasulyesi cotyledonary dokulara partikül bombardımanı ile sunuldu. Kotiledonlarında sonra bir dijital fotoğraf makinesi ve kültür yemekleri güvenli bağlanma izin vermek için özel tasarlanmış bir robotik platformu 2-boyutlu bir floresan diseksiyon mikroskobu oluşan bir robot görüntü toplama sistemi yerleştirildi. Görüntüler her organizatörü ifade profilleri oluşturmak için her saat 100 saat cotyledonary dokuların toplanmıştır. Her 100 görüntü toplanan serisi ilk GFP-ifade odaklar sürekli analiz seçili alanları içinde muhafaza olduğu belirli yapmak için ImageReady kullanarak manuel resmi hizalaması maruz kaldı. 300 x 400 piksel ölçüm serisi belirli bölgelerde, sonra ImageJ yazılım kullanarak GFP Yoğunluk ölçümleri sağlamak için daha fazla analiz için seçilmiştir. Toplu görüntüleri, kırmızı, yeşil ve mavi kanalları ve GFP ifade alanlarda ImageJ eşik özelliğini kullanarak tespit edilmiştir. Ayrıldı Eşiğe çıkarıldıktan sonra, (gri değerler çıkarma olmayan ifade her piksel piksel) ilgili kırmızı ve yeşil kanalları, GFP yoğunluğu toplam sayısına göre her GFP ifade piksel piksel başına değeri gri tonlama ortalama çarpılarak hesaplanır kanal ve daha sonra kırmızı ve yeşil kanallarını hem de bu değerler ekleyerek. GFP Yoğunluk değerleri ifade profilleri verim için her 100 puan için toplanmıştır. GFP ifade profilleri Çeşitlemeler promotor gücü, bir susturulması baskılayıcı varlığı ya da organizatörü niteliği gibi faktörler farklılıklar sonuçlandı. GFP yoğunluğu ölçümü yanı sıra, görüntü serisi ayrıca, zaman atlamalı ImageReady kullanarak animasyonlar oluşturmak için kullanılır. Time-lapse animasyonlar net bir çoğunluk hücrelerinin yavaş bir düşüş takip GFP ifade görece hızlı bir artış gösterdiği saptandı. Bazı hücreler bazen floresan ani kaybı, hızlı hücre ölümü ile ilişkili olabilir görüntülenir. Membran ve hücre duvarı boyunca komşu hücrelere GFP görünür ulaşım da gözlendi. Zaman atlamalı aksi GFP Şiddeti profiller ya da tek bir zaman noktasında görüntü koleksiyonları kullanılarak elde edilememiştir sağlanan ek bilgi animasyonlar.

Watch this Scientific Journal Video about Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues at JoVE.com

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Biz giriş, izleme ve bitki hücrelerinde GFP ifade kantitatif analizi için bir yöntem raporu. Bu yöntem, zaman içinde, çok sayıda örneklerin yarı-sürekli bir resim koleksiyonu için özel olarak tasarlanmış bir robotik sistem kullanır. Ayrıca görüntü serisi analizi için ImageJ ve ImageReady kullanımını göstermek.

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

robotics-dynamic-image-analysis-for-studies-gene-expression-plant

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Görüntüleme.  The Ohio State University. Biz giriş, izleme ve bitki hücrelerinde GFP ifade kantitatif analizi için bir yöntem raporu. Bu yöntem, zaman içinde, çok sayıda örneklerin yarı-sürekli bir resim koleksiyonu için özel olarak tasarlanmış bir robotik sistem kullanır. Ayrıca görüntü serisi analizi için ImageJ ve ImageReady kullanımını göstermek.

Video: Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biyoloji

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Omurilik Elektrofizyoloji

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...