JB, Wellcome Trust doktora öğrencisi, SR laboratuvar bir CRUK Kıdemli Araştırma Bursu (C99667/A12918) tarafından finanse edilen AS, bir CRUK klinik üyesidir. Bu çalışma iki Wellcome Trust Stratejik Ödülleri (097945/B/11/Z ve 095931/Z/11/Z) tarafından desteklenmiştir.

1.. Hücre Kültürü ve Tedavi <ol><li> Kültür, insan osteosarkom (U2OS) hücreleri, Tablo 1 &#39;de listelenen reaktifler ve ekipmanı toplayın. Tüm reaktifler hazırlamak ve sterilite sağlamak için laminar hava akış başlığı içinde tüm doku kültürü teknikleri yürütmek </li><li> Aşağıdaki gibi hazırlayın kültür ortamı:% 10 (FCS) arasında nihai konsantrasyonlar elde etmek için 50 ml DMEM FCS, 5 ml L-glutamin, 5 ml penisilin / streptomisin ekleme, 2 mM (L-glutamin), 50 U / ml ( penisilin) ​​ve 50 U / ml (streptomisin). Bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de kültür ortamı ısıtın. </li><li> Tedavi için hücrelerin hazırlanması: <ol><li> % 70 etanol içinde çeşitli sterilize lamelleri, altı adet 3,5 cm plakaların altındaki bir kuru hava ve yer verir. </li><li> 2 ml lamelleri da kuyu altına yapıştırılır kalmasını sağlamak için lamel forseps ile bastırarak, tam bir DMEM (37 ° C) ısıtılmıştır bırakın. </li><li> Kendi dokusu kült U2OS hücreleri ayırmak4 ml uygulayarak, 3 ml PBS ile bir kez yıkanarak ure plaka% 0.05 tripsin-EDTA (% 1) ısıtılmış ve 7 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe. </li><li> 6ml içinde süspanse edin hücreleri tripsin-EDTA inaktive ve hemasitometre kullanarak saymak için tam DMEM&#39;yi ısındı. </li><li> Alanına 1.3.1 &#39;de hazırlanan 3.5 cm plakalarının her biri için Plaka 2 x 10 5 hücre. Yavaşça bir hatta cep dağılımını sağlamak için plaka kaya. Hücreler, işlemden önce gece boyunca bağlı izin verin. </li></ol></li><li> Hipoksi iş istasyonu içine dört adet 3,5 cm tabak yerleştirerek hücreleri tedavi ve normal oksijen şartlarında 37 ° C&#39;de inkübatör içinde diğer iki 3.5 cm tabak bırakın. Hipoksi tedavi bitmeden (hipoksi tedavi hücreleri hipoksi odasında) tedavi koşulları altında RNA etiketleme tahlili 1 saat işbaşı yapmaya hazır olun. </li><li> 1 saat 15 dakika, 1 saat 30 dakika, 2 saat ve 24 saat boyunca hipoksi hücreleri Açığa. Bu zaman noktalarında, esnek ve kullanıcı tarafından belirlenmektedir. </li><li> Bir NORMO kullanınPozitif kontrol ve negatif kontrol olarak, 4 saat boyunca Aktinomisin D (10 ug / ml son konsantrasyon) ile muamele edilmiş bir normoksik 3.5 cm levha olarak xic 3.5 cm plakası. Aktinomisin D, küresel RNA sentezinin bir inhibitörüdür. </li></ol> Uyarılar: Hoechst 33342, bilinen mutajen olduğu. DMSO dokulara organik moleküllerin girişini kolaylaştırmak için bilinmektedir. NaOH yıpratıcıdır. HCl yıpratıcıdır. Paraformaldehyde tüm hayvanlar için son derece zehirli olan ve insanlarda ölüme neden olabilir. Triton X-100 doğrudan temas aşağıdaki cilt tahrişine neden olabilir. Aktinomisin D zaman deri ya da yutulması ile temas toksiktir. Tüm tehlikeli kimyasallar kullanırken gerekli önlemleri alın. 2.. Tıklayın-iT Tahlilin <ol><li> - 7.6, PBS içinde% 3.7 paraformaldehid (PFA),% 1 Triton X, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) pH 7.2: Click-iT deney kiti ek olarak gerekli olan aşağıdaki reaktifler toplayınPBS içinde -100, iyonu giderilmiş su (dH 2 O), dimetil sülfoksit (DMSO), 10 M sodyum hidroksit (NaOH) ve 37% hidroklorik asit (HCI); Opsiyonel - pH indikatör şeritleri. </li><li> Aşağıdaki gibi tıklayın-iT reaksiyonu yapmadan önce taze PFA stok solüsyonu hazırlayın: <ol><li> 1.85 g PFA, bir 50 ml Falcon tüpüne 3.5 ml dH 2 O ve M NaOH of10 10 ul koyun. Bir su banyosu yapmak ve davlumbaz bu durmak için mikrodalga büyük bir beher içinde H 2 O 400 ml - 300 kaynatın. </li><li> Su banyosu içine 50 ml Falcon koyun ve yavaşça PFA çözünene kadar periyodik olarak kapağı serbest, 10 dakika boyunca çalkalayın. </li><li> % 37&#39;lik bir çözelti elde, başka bir 50 ml Falcon tüpü içine, bir 0.2 mikron filtre içinden PFA çözelti, şırınga. </li><li> PBS ekleyerek 10x seyreltin ve konsantre HCI 12 | il ilave edilerek pH 6.8 &#39;e getirmek. Opsiyon: davlumbaz gösterge şeritleri ile doğru pH değeri onaylayın. </li><li> Hemen kullanın ya da o mağazayeterli olmasını at 4 ° C. </li></ol></li><li> Aşağıdaki gibi RNA görüntüleme kiti stok çözümleri hazırlayın: <ol><li> AB, 100 mM&#39;lik bir stok solüsyon elde bileşen A için 373 ul dH 2 O ekleyin. Bir aya kadar -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> B bileşeni (Alexa Fluor 594) DMSO içinde 85 ul eklenir ve pipetleme ya da vorteks ile karıştırın. Bir yıla kadar -20 ° C &#39;de hem de muhafaza edin. </li><li> RNA görüntüleme kiti reaksiyon tamponu katkı 10X bir çözüm oluşturmak için bileşen E 2 ml dH 2 O ekleyin. Çözelti, kahverengi bir renk geliştiğinde bir yıla kadar -20 ° C&#39;de saklayın, atın. </li></ol></li><li> AB ile Hücrelerinin Etiketleme: önceden ısıtılmış tam ortam (37 ° C) içinde aşama 2.3 &#39;de hazırlanan 100 mM stoktan AB 2X&#39; lik bir çalışma çözeltisi hazırlayın bu aşamasının kalan yapın ve hipoksi ile muamele edilmiş hücreler için hipoksi odası içinde 2.5 adım. . ortam Devam için bu 2X çalışma çözeltisinin eşit hacimde eklenmesiyle 1X seyreltinhücreleri Aining. Muamele hücre kültürü koşulları altında 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Hücre Sabitleme: PBS ile bir kez, her yıkama ve muamele koşulları altında, yukarıda aşama 2.2 &#39;de hazırlanan% 3.7 PFA stoklar 1 ml. Işlem koşulları altında, 15 dakika boyunca inkübe edin. Hipoksi ile muamele örnekler, bu noktada hipoksi haznesinden çıkarılabilir. Fiksatif çıkarın ve PBS ile de bir kez her yıkayın (sorumlu atık PFA atmanız dikkat edin). Oda sıcaklığında bir sonraki adımları uygulayın. </li><li> Permeabilization: yıkama çözeltisi çıkarın ve her bir oyuğa, PBS içinde% 1 Triton X-100, 1 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Permeabilization tamponu çıkarın ve PBS ile de bir kez her yıkayın. </li><li> Etiketli RNA Algılama: <ol><li> DH 2 O&#39;da 10X çözeltisi (aşama 2.3 &#39;de elde edilmiş) 1:10 seyreltilmesiyle RNA görüntüleme kiti reaksiyon tamponu ilave taze bir 1X çalışma çözeltisi hazırlayın </li><li> RNA görüntüleme kiti hazırlamahazırlandıktan hemen sonra kullanım için Tablo 2&#39;ye göre tepkime kokteyli. </li><li> Yıkama çözüm çıkarın ve her bir örnek için RNA görüntüleme kiti reaksiyon kokteyl 500 ul ekleyin. , Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe ışıktan koruyunuz. </li><li> RNA görüntüleme kiti Reaksiyon kokteyl çıkarın ve RNA görüntüleme kiti Reaksiyon yıkama tamponu (bileşen F), 1 ml ile bir kere yıkayın, sonra RNA görüntüleme kiti Reaksiyon yıkama tamponu çıkarın. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı multipleks tepki: üreticinin önerilerine göre bu noktada ek bir numune antikor etiketleme gerçekleştirin. </li><li> DNA Boyama: PBS ile yıkayın Numuneler daha sonra yıkama çözeltisi çıkarın. PBS içinde Hoechst 33342 (Bileşen G) 1:1,000 seyreltin. Her bir oyuğa seyreltilmiş Hoechst 33342 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir, ışıktan koruyunuz. Hoechst 33342 çözüm çıkarın ve iki kez PBS ile hücreleri yıkayın. Yıkama eriyik çıkarınn ve ışık mikroskobu geçin. </li></ol> 3.. Işık Mikroskopisi <ol><li> Dağı Lameller: <ol><li> Standart bir mikroskop lamı ortasına orta montaj 10 ul koyun. </li><li> Montaj orta kısım kapak aşağı mikroskop lamı ortasına hücre yüzü lamel yerleştirin. Bu daha sonraki görüntü alımı belirsiz gibi montaj orta kabarcıklarının oluşmasını önlemek için dikkat edin. </li><li> Onun çevresine şeffaf tırnak vernik uygulanarak mikroskop lamı lamel sopa. Oda sıcaklığında 5 dakika kurumasını bekleyin. Işıktan koruyun. Örnekler Aşağıdaki montaj -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> Görüntü edinimi: floresan algılama yeteneğine sahip, geniş bir alan mikroskobu kullanarak görüntüleri edinin. DNA&#39;ya bağlanan Alexa Fluor boya ve Hoechst 33342 için yaklaşık floresans / uyarma Maksimum emisyon değerleri, Tablo 3&#39;te gösterilmiştir. </li><li> Performanssoğutmalı bir CCD kamera ile bir 40X/1.30 NA immersiyon yağı lens ve yakalama görüntüleri kullanarak m Görüntüleme. </li></ol> 4.. Veri Analizi <ol><li> Görüntü işleme yazılımı (Malzeme tabloya bakınız) öncesinde omero müşteriye ithal kullanarak Deconvolve görüntüler. Diğer tüm koşullar kontrol Normoksik hücrelerinden render ayarlarını uygulayarak mikroskop görüntü analizi ve görselleştirme yazılımı aynı deneyde tüm görüntüler için ayarları render normalleştirmek. </li><li> Her görüntünün nükleuslann seçmek için mikroskop görüntü analizi ve görselleştirme yazılımları İlgi Of Bölgesi (ROI) aracı (Malzemeler tabloya bakınız) kullanın. Her ROI için ortalama yoğunluklarını elde etmek ve 30-50 hücreler arasında bir numarası dahil, yoğunluk analizi seçeneğini seçerek, her durum için ortalama ve standart sapma hesaplamak. </li><li> Adım 4.2 t elde edilen tüm bireysel ortalama yoğunluk değerlerini komplo tarafından bir veri grafik yazılımı (Malzeme tabloya bakınız) kullanılarak Dağılım araziler Constructo, her koşul altında hücreler arasındaki değişkenlik göstermektedir. Alternatif ortalama ortalama yoğunluğunu artı doğmakta RNA standart sapmasını temsil çubuk grafikler oluşturun. </li></ol>

<ol>
	<li>Kenneth, N. S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gene+expression+by+hypoxia.">Regulation of gene expression by hypoxia.</a> Biochem J. 414, 19-29 (2008).</li><li>Appelhoff, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+function+of+the+prolyl+hydroxylases+PHD1,+PHD2,+and+PHD3+in+the+regulation+of+hypoxia-inducible+factor.">Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor.</a> J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).</li><li>Lancaster, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+dimerization+and+substrate+phosphorylation+inhibit+factor+inhibiting+hypoxia-inducible+factor+(FIH)+activity.">Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity.</a> Biochem J. 383, 429-437 (2004).</li><li>Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+under+low+oxygen:+holding+your+breath+for+transcription.">Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription.</a> Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).</li><li>Schodel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+genome-wide+mapping+of+HIF-binding+sites+by+ChIP-seq.">High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq.</a> Blood. 117, (2011).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).</li><li>Breinbauer, R., Kohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azide-alkyne+coupling:+a+powerful+reaction+for+bioconjugate+chemistry.">Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry.</a> Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconjugation+by+copper(I)-catalyzed+azide-alkyne+[3+++2]+cycloaddition.">Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMERO:+flexible,+model-driven+data+management+for+experimental+biology.">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nat Methods. 9, 245-253 (2012).</li><li>Culver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+hypoxia-induced+NF-kappaB.">Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB.</a> Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).</li><li>Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+of+DNA+replication+and+RNA+synthesis:+Historical+perspective+and+recent+advances+based+on+"click+chemistry.">Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry.</a> Cytometry A. 79, 328-337 (2011).</li></ol>

JRS Glencoe Yazılım, Inc omero katkıda bulunan bir açık kaynak ABD merkezli ticari şirketin kurucusudur.

Biz osteosarkom (U2OS) hücreleri RNA sentezi üzerine hipoksi etkilerini incelemek için bir RNA görüntüleme kiti bizim kullanımını tarif etmişlerdir. Bu teknik, nispeten basit olan ve tek hücre düzeyinde genel transkripsiyon ile ilgili verileri sağlar. Biz bir hipoksi odasında etiketleme dahil, bu kit için geleneksel protokolünü değiştirilmiş. Bildiğimiz kadarıyla bu hipoksi RNA sentezi değişiklikleri ölçmek için bu tekniğin kullanımı ilk rapordur. Hiçbir radyoaktif izotoplar gerektirir ve kontrollü atmosfer iş istasyonunda çalışma sınırlamaları ile teknik uyumlu olduğu için kullanılan RNA görüntüleme kiti hipoksi deney için uygundur. Bu teknik endişe verimli tespit ve numune etiketleme ile ortak sorunları. Bu PFA örnek taze ve numunenin düşük arka plan boyama sağlamak için tarif edildiği gibi &#39;tık&#39; reaksiyonu takip yıkama adımlar gerçekleştirilir düzeltmek için kullanılan son derece önemlidir. Eğer background floresan bu aşama 2.7.4 sonra 1 ml RNA görüntüleme kiti Reaksiyon yıkama tamponuyla bir kez daha yıkama için tavsiye edilir bir sorun haline gelir. Burada sözü RNA görüntüleme kiti kullanımı ve reaksiyon özgüllük ve hız kolaylığı açısından RNA görüntüleme teknolojisinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Bu teknik, öncelikle numune etiketlemek için gereken zaman ile sınırlıdır. RNA görüntüleme kiti, genellikle bu süre içinde oluşacak küresel RNA hızlı değişimlerin incelenmesini engelleyen bir 1 saat etiketleme süre gerektirir. Bu nedenle bizim ilk zaman noktası, 1 saat ve 15 dakika ile sınırlı olduğunu. Bu teknik, büyük ölçüde, örneğin, bu RNA görüntüleme kiti phalloidin lekelemesi ile uyumlu değildir, diğer floresan işaretleri ile uyumluluk reaktif madde ile ilgili birkaç diğer sınırlamalar ile ilişkilidir. Hücrelerde RNA sentezini okuyan tüm mevcut yaklaşımlar içine tadil edilmiş nükleosidlerin dahil dayanmaktadırYeni oluşan RNA ve farklı yollarla dahil etiketlerin tespiti. Öncü yaklaşım otoradyografi ile algılama ve ardından radyoaktif işaretli RNA öncüleri kullanılarak dayanıyordu. Bu yöntem, hücre döngüsü aşamalarında ve diğer önemli bulgular bir keşfine yol açtı; Ancak, bu tür radyoaktivite çalışmaları, uzun pozlama süreleri ve otoradyografiye 6 düşük çözünürlüklü görüntülerinin hantal doğası gibi dezavantajları bir yeri vardır. Alanındaki bir sonraki önceden radyoaktivite gereğini ortadan kaldırmak için immüno-kimya araçlarını kullandı. RNA immunokimya tespiti ardından Bru katılmasıyla etiketli oldu. Bununla birlikte, etkili bir antikor, DNA ya da hücre morfolojisi kaybına sebep olmuş ve floresan etiketli antikorlar 13 ile ayrıca algılama önlenmesi, pek çok protein epitoplarının zarar RNA erişimi geliştirmek için nükleik asit denatürasyonu gerekli bağlanma. &#39;Tık kimya&#39; teknolojisinin tanıtımı adım algılama ve t basitleştirilmişO prosedürü otoradyografi ve immüno-kimya ile karşılaştırıldığında. Bu teknoloji, 5-ethyniluridine terminal alkin, Cu (I) &#39;in varlığında, florofor ile konjuge azit ile bağlanan azid-alkin Hüsgen siklo reaksiyona dayanır. Reaksiyon, hızlı ve özel olan herhangi bir ek adımlar gerektirmez ve diğer hücre bileşenleri immunokimyasal tespiti kolayca uyumludur. Bu RNA görüntüleme teknolojisi kullanılarak biz hücreleri, aynı tek tabakalı popülasyonda, hipoksiyaya tepki olarak farklı RNA sentez düzeyde olduğunu göstermiştir. Biz RNA üretiminin sadece etkisini incelemek için deney sınırlı; Bununla birlikte, bu RNA üretimi için daha karmaşık bir analiz için tadil edilmiş, çok katlı, ek tepkileri gerçekleştirmek için bu RNA görüntüleme kiti ile tamamen mümkündür. Örneğin, bu tür fosforlu RNA polimeraz II veya transla hatta bileşenlerinin düzeyleri gibi aktif transkripsiyon belirteçleri için özel bir antikor kullanılarak ikinci boyamaprotein dönüştürülür, bu yeni üretilen RNA miktarının bir göstergesini vermek tion amaçlı mümkündür. Örneğin aktin, hipoksi ile önemli ölçüde değiştirmemelidir bir protein gibi ek protein, ek bir kontrol olarak test edilebilir. Farklı hücrelerin farklı RNA sentezi oranları ve hipoksi bile farklı tepkiler olacağı çok muhtemeldir Dahası, farklı hücre tipleri, test edilebilir. Bu RNA görüntüleme kitin kullanımı tarif edildiği gibi adımlar gerçekleştirilir Resim oldukça basittir. Protokolünde kritik adımlar hücre kaplama, hücre fiksasyon ve boyama ve görüntü alımı içerir. Bu önemli sonucu etkileyecek deney at üzerinde ya da altında birleştiği önlemek için tarif edilen yoğunlukta hücreleri plaka önemlidir. Bu alınan hücrenin en iyi &#39;anlık&#39; sağlanması, taze fiksatif kullanmak ve bac azaltmak için boyandıktan sonra hücrelerin yıkarken dikkat çekmek için de önemlidiretkili bir analiz için kabul edilebilir bir düzeye kground. Son olarak, görüntü elde etme yöntemi sonraki analiz için yeterince iyi bir kalitede görüntüler elde etmek son derece önemlidir. Biz gibi optik dünyada en çok araştırma yoğun merkezlerinde kullanılan bu protokolde kullanılan mikroskop gibi örnekleri incelemek için mevcut en iyi ışık mikroskobu kullanmanızı öneririz.

Hipoksi (Düşük oksijen gerilimlerinin) bir doku için normal oksijen rahatsız olduğu zaman meydana gelir. Çevre oksijen birçok hücre türleri için önemli ipuçları veren, bir besleyici ve bir sinyal molekülü hem de. Çevre oksijen değişiklikler Hipoksi İndüklenebilir faktörler (HIFs) olarak bilinen önemli bir transkripsiyon faktörü ailesinin aktivitesini kontrol dioxygenases bir grup tarafından algılanır. HIFs iki alt-birimden, α ve β oluşmaktadır. Bilinen üç HIF-α izoformu (1, 2 ve 3) ve HIF-1β çoklu ekleme varyantları bulunmaktadır. HIF-1β yapıcı bir şekilde ifade ve çevresel oksijen düzeyleri 1 ile düzenlenmemiştir. HIF-α aile üyeleri dinamik Prolile hidroksilazları (doktora) bir sınıf tarafından düzenlenir ve Faktör HIF (FIH) inhibe edilir; HIF-α 2,3 hidroksilasyon katalize etmek üzere bir ko-faktör olarak oksijen gerektirdiği her ikisi de. Normoksi olarak HIF-α aile üyeleri olarak hidroksilite edilmiş ve proteosom için etiketliE3-Ligazını, von Hippel Lindau (VHL) tarafından al bozulması. Hipoksi ve doktora FIH aktif olmayan ya da düşük bir aktiviteye sahiptir. HIF-α izoformlar, kararlı hale HIF-1β ile bir heterodimer oluşturan ve hipoksik bir ortamda (Şekil 1A), hücresel cevabı sağlayan genlerin transkripsiyonu etkileyebilen 4. RNA analizi için mevcut teknikler, belirli bir hücre popülasyonu arasında ortalama değerlerinin ölçümü odaklanır. Hücreler onlara düşmanca bir ortamda 5. uyum sağlayan genlerin sayısız transkripsiyonunu başlatarak bir hipoksik uyarana cevap. Bununla birlikte, hipoksi, genellikle bir gradyan olarak mevcut ve hipoksik bir ortamda hücrelerin muntazam hipoksik uyarıcı tabi değildir. Biz hipoksi tek hücre düzeyinde küresel RNA sentezini incelemek için bir oksijen kontrollü bir iş istasyonu tıklayın-iT RNA görüntüleme kitleri bir uygulama tarif. RNA görüntüleme kiti a kullanırlkyne modifiye edilmiş nükleosid, 5-etinil üridin (AB) ve hücre ve dokuların 6, geçici ve mekansal olarak küresel RNA sentezinin saptanmasını sağlamak için kemoselektif ligasyonu. Kısaca, hücreler hipoksi ve AB mevcudiyetinde kültürlenmiş ile muamele edilir. Daha sonra sabit ve geçirgenleştirildi ve doğmakta olan RNA&#39;ya AB şirketleşme bir azid içeren boya ile AB Kemoselektif ligasyonu ile tespit yapılmaktadır. Bu reaksiyon için tipik bir iş akışı Şekil 1B &#39;de gösterilmiştir. Biz hipoksi ile muamele sonucu tek hücre düzeyinde RNA sentezini incelemek için RNA görüntüleme kiti kullanıldı. Alkin etiketinin küçük boyutlu, özellikle RNA&#39;ya modifiye nükleositin etkili bir birleşme sağlar. Kemoselektif ligasyonu veya &#39;klik&#39; tepkisi yüksek, verimli, hızlı ve 7-10 özgüdür. Reaksiyon bileşenlerinin tümü bioinert ve reaksiyon, herhangi bir aşırı sıcaklıklara veya çözücü gerektirir. Click reaksiyonu olumsuzlarGeleneksel radyoetiketlenmeye gereksinimi ve çıkış beri sonuçların direkt görüntülenmesini sağlar ışıktır. Buna ek olarak, tespit molekülü kolayca RNA etkileşimli proteinlerin saptanması için antikorlar da dahil olmak üzere multipleks analizine imkan kompleks örnekleri nüfuz edebilir. Bu RNA görüntüleme deney Alexa Fluor ve flöresin (FITC) de dahil olmak üzere, organik boyalar ile uyumludur. Biz uzaktan nesneler için açık mikroskopi ortamda (omero) bir uygulama kullanarak bizim hücre tedavisi sonrasında RNA sentezi değişimi ölçülür. Omero mevcut açık kaynak kodlu yazılım, <a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> . Bu mikroskop görüntü analizi ve görselleştirme yazılım erişimi ve çok boyutlu, heterojen veri setlerinin yönetimi dahil olmak üzere biyolojik verilerin geniş bir yelpazede, kullanımı sağlar. Istemci uygulaması uzaktan görselleştirme ve karmaşık biyolojik görüntü verileri 11 analizini sağlar;küresel ve tek hücre RNA sentezi görsel değişiklikleri ölçmek için kullanılır. Bu mikroskopta görüntü görselleştirme ve analiz yazılımı kullanarak bu verileri ve bizim RNA görüntüleme deney analiz etmek için gerekli adımlar aşağıda gösterilmiştir. Bu en fazla 24 saat için hipoksi insan osteosarkom tedavisinde (U2OS) hücreleri aşağıdaki genel RNA sentezinde değişikliklere görünüyordu. Tüm koşullarda olarak, RNA üretim düzeyinde hücre-hücre değişimini tespit edildi. Hipoksi maruz kısa zamanlar hücrelerinde olgunlaşmamış RNA seviyesinde önemli değişiklikler ile sonuçlanmamıştır. Bununla birlikte, hipoksi, 24 saat maruz hücrelerinde üretilen RNA miktarında önemli bir artış ile sonuçlanmıştır. Hipoksiye hücresel tepkilerin çoğu, 4-24 saat kadar uzun süre maruz kalma, aşağıdaki ölçülür. Ancak, bazı mekanizmalar örneğin, çok daha erken yerine konur; NF-KB aktivasyonu hipoksiyaya maruz kalma 12 5-15 dakika içinde gerçekleşir. Kısa hipo Araştırılmasıxia pozlama süreleri bu nedenle garanti edilir ve bu, hücre döngüsü ve apoptoz gibi daha karmaşık tepkiler azaltacağından.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1313px;" width="1314">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">U-2 OS Primary Cells</td>
			<td style="width:92px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td align="right" style="width:115px;">92022711</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:703px;"><a href="http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&amp;dosearch=true">http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&#38;dosearch=true</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">14190094</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">41966029</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029">https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10270106</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-603E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin-EDTA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hypoxia Chamber</td>
			<td>Ruskinn</td>
			<td>InVivo2 300</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ruskinn.com/products/invivo2300">http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-10329/C10330</td>
			<td></td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&#38;catKey=601107&#38;filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&#38;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76240</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10M NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37% HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20252.335</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&amp;searchOp=or">https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&#38;searchOp=or</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VectaShield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483">http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Actinomycin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deltavision Core Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.appliedprecision.com/">http://www.appliedprecision.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">softWoRx [Refered to in text as image processing software]</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.api.com/softworx.asp">http://www.api.com/softworx.asp</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CoolSnap HQ2 CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php">http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software]</td>
			<td>OME</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software]</td>
			<td>Systat Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php">http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of global rna synthesis at the single cell level following hypoxia

Oksijen kullanılabilirliği Hipoksi ya da düşürülmesi, pek çok fizyolojik ve patolojik proses yer almaktadır. Moleküler düzeyde, hücreleri uygun ve koordine hücre tepkisi için özel bir kopyalama başlatma programı. Hücre aktiviteleri için kofaktör olarak moleküler oksijen gerektiren çeşitli oksijen sensörü enzimlere sahip. Bu prolile-hidroksilazları ikinci histon demethylases değişir. Hipoksiye hücresel yanıtları analiz çalışmaların çoğu hücresel popülasyonlar ve ortalama çalışmalara dayanmaktadır ve hipoksik hücre bu tip bir tekli hücre analizi olarak nadiren gerçekleştirilir. Burada mikroskopi analizi ve miktar tayini, ardından kontrollü bir oksijen iş istasyonu Click-iT RNA görüntüleme kitleri kullanılarak hipoksi tek hücre düzeyinde, küresel RNA sentezinin analizi için bir metod tarif eder. Farklı zaman uzunlukları için hipoksiye maruz kanser hücrelerini kullanarak, RNA, her hücrede etiketlenir ve ölçülür. Bu analiz sağlar:hipoksik strese aşağıdaki genel RNA sentezinde zamansal ve hücreden hücreye değişiklik görselleştirme.

RNA görüntüleme kiti reaksiyonun bir şematik Şekil 1B &#39;de gösterilmiştir. Biz kantitatif bir birey (tek hücreli) ve küresel düzeyde (hücre popülasyonu) hem hipoksi ile tedavi sonrası U2OS hücrelerde toplam RNA sentezini belirlemek için bu reaksiyonu kullanılır. Hücreler, hipoksi ve AB mevcudiyetinde kültürlenmiş ile muamele edilmiştir. Daha sonra sabit ve geçirgenleştirildi ve AB kuruluş bir azid içeren boya ile AB Kemoselektif ligasyonu ile tespit edilmiştir edildi. Bu tespit ve floresan ışık mikroskobu kullanılarak belirlenebilir bir floresan emisyon reaksiyon sonucu &#39;tıklayın&#39;. Şekil 2A Bu deneyde tipik bir sonucu gösterir. Floresan etiketli hücreleri kırmızı yalancı ve görüntü uzaktan nesneler için açık mikroskopi ortamda (omero) açılmıştır. Bu mikroskop görüntü görselleştirme ve analiz yazılımı yerleşik bir bireysel alt hücresel yapılara, seçmek için kullanılabilir ROI aracıkantitatif kırıkları ve seçilen bölge içinde görüntü yoğunluğunu analiz. Istemci programda bu aracın kullanımından sonra, veri çıkışı tipik bir örneği, Şekil 2B&#39;de görülebilir; bireysel hücre yoğunlukları veri geçerliliğini sağlamak için görsel bir kontrol olarak hizmet deney temsili bir görüntünün yanında gösterilir. Tek tek hücre floresan yoğunlukları, tedavi edilen hücre popülasyonu içindeki tek tek hücre yoğunluğu dağılımını gösteren bir dağılım grafik olarak çizilebilir. Grafiğin Bu tür bir örnek, Şekil 2C&#39;de görülür. Bu tedavi sonuçlarının hızlı bir karşılaştırma sağlar ve aksi açıkça standart veri temsilini kullanarak gizlenmiş bir tedavi hücre popülasyonu içinde önemli heterojenite göstermektedir çünkü bu şekilde yoğunluk veri komplo yararlıdır. Yanıt heterojenlik Bu deneyde ilginç muntazam hipoksik uyarıcı bir olmasına rağmen, çünkühücrelere pplied, aynı tek tabakalı hücre popülasyonundan her farklı bu uyarıcıya tepki olduğu açıktır. Şekil 2B bizim deneyde genel sonuç gösteriyor. Bir tedavi nüfus içinde tüm hücrelerin ortalama flüoresan yoğunlukları ve daha sonra bu çubuk grafik olarak çizilmiştir. Bir student t-testi kontrolünden önemli ölçüde farklı olan her tedavi grubu arasında istatistiksel olasılığını hesaplamak için kullanılmıştır. İlginç bir şekilde, bu veriler zamanlarda daha fazla 1 saat 30 dakika (U2OS hücreleri hipoksi ile muamele edilir zamanla küresel RNA sentezi istatistiksel olarak önemli bir artış olduğunu göstermektedir * p &lt;0.01;. ** P &lt;0.05 ve *** p &lt;0.001 ve n&gt; 30). Bu veriler, hipoksi tedavinin uzun süre sonra, hücre bile düşmanca hipoksik ortamda RNA üretimi üzerinde çabalarını odaklanmış göstermektedir. Aktinomisin D tedavi tamamen beklendiği gibi floresan ablates.<img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> Şekil 1. A. HIF sistemi, hücre oksijen değişikliklere cevap verir. Bu basitleştirilmiş şematik hipoksi olarak prolil hidroksilaz enzimler (doktora) ve von Hippel-Lindau protein (VHL) tarafından daha sonra polyubquitination tarafından HIF-α hidroksilasyon (-OH) engelleyerek HIF heterodimer dengeler. . B. RNA sentezi, Click-IT deneyi kullanılarak tespit edilebilir hücre hipoksiye hücre cevap yardımcı sayısız genlerin aktivasyonunda HIF stabilizasyon sonuçlar; hücreler tıklayın reaksiyonu floresan yoğunluğu ve ışık mikroskobu ile tayin edilebilir RNA sentezini algılar tedaviden sonra AB ile etiketlenmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">daha büyük bir vers görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın iyon. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> Şekil 2.. Omero A. Screenshot RNA etiketleme aşağıdaki tipik mikroskobik çıktıyı göstermek için. Bu mikroskop görüntü analizi ve görselleştirme yazılımları hızlı bir şekilde dahili ROI makro kullanarak tek bir hücre düzeyinde yoğunluk veri elde edebilirsiniz. Bu komutun çıkış bir ekran B. Küresel RNA sentezi gösterilmektedir bir hücre yoğunluğu elde edilebildiği için, aralığı * p C. Bu toplam veri bir resmi temsil D görülebilir dağılım çizim görülebilir &lt;0.01; ** P &lt;0.05 ve *** p &lt;0.001 ve n&gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <table border = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reaktifler Hücre Kültürü </td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7,2-7,6 </td></tr><tr><td> Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM) </td></tr><tr><td> Fetal dana serumu (FCS) filtre sterilize </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td></tr><tr><td> L-glutamin </td></tr><tr><td> % 0.05 tripsin-EDTA (% 1) </td></tr><tr><td> % 70 etanol </td></tr><tr><td> Aktinomisin D (1 mcg / ml stok) </td></tr><tr><td> Hücre Kültürü Ekipmanları </td></tr><tr><td> Steril Pasteur Pipetler </td></tr><tr><td> Kültürde hücrelerin korunması ve tedavi edilmesi için uygun hücre kültürü-işlenmiş plastik eşya aralığı </td></tr><tr><td> Su banyosu, 37 ° C&#39;de ayarlanmış </td></tr><tr><td> Laminer hava akış kaputu </td></tr><tr><td> Kuluçka 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ayarlanmış </td></tr><tr><td> Hipoksi İstasyonu 37 ° C,% 5 CO 2,% 1 O 2 set </td></tr><tr><td> Cam lamelleri </td></tr><tr><td> hassas forseps </td></tr><tr><td> Hemositometre </td></tr></tbody></table> Tablo 1. U2OS hücrelerinin kültür için gerekli Reaktifler ve ekipmanlar. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reaksiyon Bileşenleri </td><td colspan="6"> Lameller sayısı </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Tıklayın-iT RNA reaksiyon tamponu (Bileşen C) </td><td> 428 ul </td><td> 856 ul </td><td> 1.7 mi </td><td> 2.1 mi </td><td> 2.58 ml </td><td> 4.3 mi </td></tr><tr><td> CuSO 4 (Bileşen D) </td><td> 20 ul </td><td> 40 ul </td><td> 80 ul </td><td> 100 ul </td><td> 120 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Alexa Fluor Azit (Adım 2.3 olarak hazırlanmıştır) </td><td> 1.8 ul </td><td> 3.7 ul </td><td> 7.4 ul </td><td> 9.3 ul </td><td> 11.28 ul </td><td> 18.8 ul </td></tr><tr><td> Tıklayın-iT reaksiyon tamponu katkı (adım 2.3 olarak hazırlanmıştır) </td><td> 50 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td><td> 250 ul </td><td> 300 ul </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> Yaklaşık Toplam Hacim </td><td> 500 ul </td><td> 1 mi </td><td> 2 mi </td><td> 2.5 mi </td><td> 1.5 mi </td><td> 5 mi </td></tr></tbody></table> . Tablo 2. RNA görüntüleme kiti reaksiyon kokteyller: lekeli edilecek lamelleri sayısına göre RNA görüntüleme kiti reaksiyon için ana karışım bileşenlerinin oranını ayrıntılı Referans tablo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fluoroforun </td><td> Uyarma (nm) </td><td> Emisyon (nm) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> 495 </td><td> 519 </td></tr><tr><td> DNA&#39;ya bağlanmıştır Hoechst 33342, </td><td> 350 </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> . Tablo 3 Floresan / uyarma Maksimum emisyon değerleri,: DNA bağlanmıştır Alexa Fluor ve Hoechst 33342 boya için yaklaşık floresans / uyarma emisyon maksimum.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia at JoVE.com

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Bu görüntüleme kullanılarak hipoksi küresel RNA sentez analizi için bir tekniği açıklar. RNA tıklayın-kimya etiketleme önceden hipoksi altında gerçekleştirilen ve tek hücre düzeyinde küresel RNA değişikliklerin görselleştirme sağlar olmamıştır. Bu yaklaşım, küresel RNA sentezinde hücreden hücreye değişiklik doğrudan görselleştirme sağlayan, mevcut ortalama RNA tekniklerinin tamamlar.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

analysis-global-rna-synthesis-at-single-cell-level-following

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Görüntüleme.  University of Dundee, UK.  Bu görüntüleme kullanılarak hipoksi küresel RNA sentez analizi için bir tekniği açıklar. RNA tıklayın-kimya etiketleme önceden hipoksi altında gerçekleştirilen ve tek hücre düzeyinde küresel RNA değişikliklerin görselleştirme sağlar olmamıştır. Bu yaklaşım, küresel RNA sentezinde hücreden hücreye değişiklik doğrudan görselleştirme sağlayan, mevcut ortalama RNA tekniklerinin tamamlar. 

Video: Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biyoloji

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Tek Çekirdek Düzeyde HAT-1 Retrotransposition Analizi

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebra balığı adacıkları tek hücreli çözünürlük kalsiyum Imaging'i kullanma Beta hücre fonksiyonu Analizi

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...