Bu çalışma Max Planck Derneği tarafından desteklenmiştir.

Plazmitlerin 1. Yaratılış <ol><li> (Şekil 1), standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, iki pLuc ve pYFP vektörlere ilgi her protein için cDNA&#39;lar alt-klonlanmıştır. Detaylı protokollerin Yeşil ve arkadaşları 13 bkz. </li><li> Sıra tüm ilgi duyulan proteinlerin herhangi bir araya giren durdurma kodonları ile Luc / YFP sekansı ile çerçeve içinde olduğunu doğrulamak için oluşturur. </li><li> Füzyon proteinleri biyolojik etkinliğini korumak olduğunu teyit etmek için arzu edildiği gibi fonksiyonel deneylerde yapın. Burada yer alan durumunda YFP füzyon proteinlerin hücre içi lokalizasyonu floresan mikroskobu ile tespit edildi. </li><li> PLuc ve pYFP ekspresyon vektörleri içine uygun hedefleme sinyalleri mühendislik tarafından uygun Luc ve YFP kontrol proteinleri için sentezleme plasmidleri olun. Burada yer alan durumunda, pLuc ve pYFP vektörlere bir nükleer lokalizasyon sinyali sokulmasıyla nükleer hedefli Luc ve YFP yapıları oluşturur. </li><li> YapmakLuc ve YFP tek polipeptid halinde birleşmiş olduğu bir pozitif kontrol yapısı. Burada yer alan durumunda, YFP kodlama dizisi pLuc vektör içine sokulduğu bir pozitif kontrol üretir. </li><li> Transfeksiyon karışımları DNA kütlesini eşitlemek için kullanılacak nötr dolgu plazmid seçin. Herhangi bir ökariyotik promoter içeren bir plazmid kullanarak ve bu nedenle, bir bakteri klonlama vektörü gibi memeli hücrelerinde transkripsiyonel olarak etkin olacaktır. </li></ol> DNA karışımlar 2. Hazırlanması <ol><li> 260 nm&#39;de absorbans göre Bölüm 1 &#39;de tarif edilen tüm plasmidlerin konsantrasyonunu tahmin (1 absorbans birimi 50 ug / ml DNA eşdeğerdir). 650 Da ile baz çiftlerinin sayısı çarpılarak her plazmid moleküler kütlesi belirler. Her bir plazmid hazırlama molar konsantrasyonunu hesaplamak için, konsantrasyon ve moleküler kütlesi kullanın. 36 nM&#39;lik bir konsantrasyonda plasmid DNA preparatları seyreltin. Bunlar çalışma stokları olacakBu transfeksiyon için DNA karışımları hazırlamak için kullanılacaktır. </li><li> Su 20 ul&#39;lik bir son hacim içinde dolgu plazmid 1800 ng DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. </li><li> PLuc kontrol konstruktunun 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir. </li><li> PLuc kontrol konstruktunun 5 ul pYFP ve kontrol yapısının 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir. </li><li> Pozitif kontrol konstruktun 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir. </li><li> Aşağıdaki DNA, ilgili pLuc oluşturmak 5 ul ve py 5 ul birleşerek DNA karışımı için ilgi, X bir proteinin homodimerizasyon test etmek için karışımları hazırlamakFP inşa. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir. A) pLuc-kontrolü ve pYFP-X B) pLuc-X ve pYFP kontrol C) pLuc-X-X ve pYFP </li><li> Aşağıdaki DNA ilgi konusu olan proteinlerin bir çifti arasında bir etkileşim için test etmek için karışımları hazırlamak, X ve Y, her bir DNA karışımı için, ilgili pLuc oluşturmak 5 ul birleştirmek ve pYFP 5 ul oluştururlar. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir. A) pLuc-kontrolü ve pYFP-X B) pLuc-X ve pYFP kontrol C) pLuc-kontrolü ve pYFP-Y D) pLuc-Y ve-kontrol pYFP E) pLuc-X-Y ve pYFP F) pLuc-Y ve-X pYFP </li></ol> 3. Transfeksiyon <ol><li> Hasat 75 cm 2 şişeden HEK293 hücreleri alt konfluent. Kültür ortamında 13 ml toplam hücrelerin% 10 seyreltin. Beyaz her oyuğuna hücre süspansiyonu 130 ul koyunnet 96 oyuklu doku kültürü plakası dipli. 24 saat boyunca kültür hücreleri. </li><li> 3 ile DNA karışımları sayısını çarpılarak transfekte edilecek kuyu sayısını hesaplayın., Oda sıcaklığına kadar, serum içermeyen kültür ortamı getirin. Serum-barındırmayan ortam içinde 6.3 ul ve oyuk başına 0.18 ul transfeksiyon reaktifi ihtiva eden bir ana karışımı hazırlayın. Vorteks ile karıştırılır ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Serum-barındırmayan ortam / transfeksiyon reaktifi ana karışımı 20 ul DNA karışımı 2 ul ekleyerek transfeksiyon karışımları hazırlayın. Vorteks. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Oyuk başına transfeksiyon karışımı 6.5 ul tevzi her transfeksiyon karışımı ile üç kuyu transfekte. Bir başka 36-48 saat için kültür hücreleri. </li></ol> Bret Sinyal 4. Ölçümü <ol><li> Vorteks ile DMSO içinde 34 mg / ml &#39;de, canlı hücre lusiferaz alt-tabaka içinde çözündürülür. </li><li> Alt-tabaka seyreltme ortamı p 1:1,000 ile yeniden canlı hücre lusiferaz alt-tabaka seyreltik37 ° C&#39;ye yeniden ısıtıldı 50 alt-tabaka seyreltme ortamı ul başına de izin verir. Karıştırmak için Vortex. Bir çökelti meydana getirebilir, ancak testi ile engel olmaz. </li><li> 96 oyuklu plaka kültür ortamı aspire. Her bir seyreltilmiş canlı hücre lusiferaz alt-tabaka 50 ul koyun. En az 2 saat (en fazla 24 saat) için Kültür hücreleri. </li><li> 96 oyuklu plaka kapağı çıkarın ve luminometre içinde, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Ayrıca bir anda Luc ve YFP itibaren emisyonunu ölçün. Uzun ve 470 nm dalga boylarında daha engelleyen bir filtre kullanılarak Luc adlı emisyonunu ölçün. 500-600 nm bant geçişli filtre kullanılarak YFP salmaları ölçün. 10 sn emisyon sinyalleri entegre. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Sadece dolgu plazmid alınan 3 kuyulardan Luc emisyon ölçümleri ortalama. Arka plan çıkarılır Luc emisyon değerlerini üretmek için diğer tüm Luc emisyon okumalar bu Değ.Çıkar.</li><li> Sadece dolgu plazmid alınan 3 kuyulardan YFP emisyon ölçümleri ortalama. Arka plan çıkarılır YFP emisyon değerlerini üretmek için diğer tüm YFP emisyon okumalar bu Değ.Çıkar. </li><li> Her bir kuyu için, düzeltilmemiş Bret oranını vermek arka plan çıkarılır Luc emisyon değeriyle arka plan çıkarılır YFP emisyon değeri bölmek. </li><li> Yalnızca pLuc kontrol plasmidi ile transfekte edildi, üç kuyu düzeltilmemiş BRET oranlarını ortalama. Düzeltilmiş Bret oranlarını vermek için tüm diğer düzeltilmemiş Bret oranlarından bu Değ.Çıkar. </li><li> Düzeltilmiş BRET oranlar kalan kümelerinin her biri için, bir son BRET oranını elde etmek için, üç transfekte kuyulardan değerlerinin ortalamasını alın. </li></ol>

<ol>
	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).</li><li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Pfleger, K. D., Eidne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+protein-protein+interactions+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer.</a> BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).</li><li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening.">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening.</a> BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).</li><li>Pfleger, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+(eBRET)+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li><li>Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BRET+technology+for+the+monitoring+of+agonist-induced+and+agonist-independent+interactions+between+GPCRs+and+&#946;-arrestins.">Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and &#946;-arrestins.</a> Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).</li><li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li><li>Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+ubiquitination+in+living+cells+by+BRET.">Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET.</a> Nat Methods. 1, 203-208 (2004).</li><li>Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+DNA-binding+domain+of+NR2E3+affect+in+vivo+dimerization+and+interaction+with+CRX.">Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Deriziotis, P., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenomics+of+speech+and+language+disorders:+the+road+ahead.">Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead.</a> Genome Biol. 14, 204 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forkhead-domain+gene+is+mutated+in+a+severe+speech+and+language+disorder.">A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder.</a> Nature. 413, 519-523 (2001).</li><li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language.">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends Genet. 25, 166-177 (2009).</li><li>Graham, S. A., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+genetics+of+speech+and+language.">Decoding the genetics of speech and language.</a> Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+sporadic+autism+spectrum+disorders+identifies+severe+de+novo+mutations.">Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations.</a> Nat Genet. 43, 585-589 (2011).</li><li>Horn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP1+deletions+in+three+unrelated+patients+with+mental+retardation+and+significant+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits.</a> Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).</li><li>Hamdan, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+mutations+in+FOXP1+in+cases+with+intellectual+disability,+autism,+and+language+impairment.">De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment.</a> Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).</li><li>Talkowski, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+chromosomal+abnormalities+reveals+neurodevelopmental+loci+that+confer+risk+across+diagnostic+boundaries.">Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries.</a> Cell. 149, 525-537 (2012).</li><li>Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+DNA+binding+activity+of+the+Foxp1/2/4+family+is+modulated+by+heterotypic+and+homotypic+protein+interactions.">Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions.</a> Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).</li><li>MacDermot, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP2+truncation+as+a+novel+cause+of+developmental+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits.</a> Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).</li><li>Vernes, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Füzyon protein ekspresyon yapılarının tasarımı Bret tahlil kurma önemli bir adımdır. Burada yer alan deneylerde, ilgi duyulan proteinlerin veya lusiferaz YFP C-terminine kaynaştırılmıştır. De mümkündür, ve lusiferaz / YFP N-terminine proteinleri sigorta, gerekli olabilir. Bazı proteinler için, füzyonları, sadece protein yapısı ve işlevinin bozulmasını önlemek için N-veya C-terminalinde ya da kabul edilebilir. Ayrıca, zar proteinleri olarak N ve C termini lusiferaz / YFP protein etkileşim o...

Dizileme insan bozuklukları arasında bağlantı analizleri klasik ve yeni nesil Hem biyolojik yolların bir aralıkta yer alan proteinlerin klinik anlam açıklayıcıdır. Bu önce bu tür çalışmalarda kendi tanımlama, bu proteinlerin biyolojik rolünün çok az veya hiç soruşturma edildiğine, genellikle böyledir. Ilgi konusu bir proteinin biyolojik fonksiyonunu keşfetmek başlatmak için verimli bir yol onun fizyolojik bağlamında ile etkileşen diğer hangi proteinlerin tespit etmektir. Bu şekilde moleküler ağlar karakterize insan fenotip altında yatan biyolojik yollar içgörüler sağlar. En sık kullanılan büyük ölçekli tarama ilgi konusu olan proteinlerin aday etkileşim ortakları belirlenmesi için yaklaşımlar maya iki-hibrid eleme 1 ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik 2 &#39;dir. Bu yöntemler potansiyel etkileşim proteinler düşündüren çok başarılı olabilir, ancak ar olabilirYanlış pozitif sonuçlar savunmasız e. Bu nedenle, maya iki-melez ya da kütle spektrometrisi tarama ile belirlenen bir etkileşim onay ikinci bir teknik kullanılarak etkileşim doğrulaması gerektirmektedir. Tipik olarak, bir ko-immünopresipitasyon veya çekme-down deney bu amaçla 3 için kullanılır. Doğrulama için bu gibi teknikler kullanılarak bir dezavantajı, belirli bir protein etkileşimlerini muhafaza edilmesi için gerekli olabilir, hücre içi koşullar yok hücre lisisi, için bir gerekliliktir. İkinci bir dezavantaj, zayıf ya da geçici protein etkileşimleri yıkama adımları sırasında bozulabilir olmasıdır. Ayrıca, bu deneyler, önemli eller zaman talep aynı anda işlenebilir numune sayısı sınırlıdır ve genellikle reaktiflerin ve protokoller zaman alıcı optimizasyon gerektirir. Ko-immünopresipitasyon deneyleri ile ilişkili problemlerin bazılarının üstesinden gelebilmek için, çeşitli tahliller, floresan ve biolum göre geliştirilmiştircanlı hücreler olarak kullanılabilir inescent proteinleri. Bu alandaki ilk deneyler Floresans (veya Förster) rezonans enerji transferi (FRET), üst üste binen emisyon ve uyarım spektrumları 4, iki floresan protein arasındaki enerji radyatif olmayan transferi dayandırılmıştır. Enerji transferi etkinliği bu nedenle, FRET olgusunun gözlem verici ve alıcı floroforlar yakın olması gerekir, güçlü bir mesafe bağımlıdır. Ve akseptör-floroforu (yaygın sarı floresan proteini; YFP) ile bir füzyon olarak ikinci, ilgi iki protein arasındaki bir etkileşim test etmek için, bir protein, donor-florofor (CFP genel olarak mavi floresan protein) ile bir füzyon olarak ifade edilir. Ilgilenilen iki protein arasında bir etkileşim CFP donör YFP akseptör göreceli ışık emisyon ölçülebilir bir artışa neden olur ki, enerji transferi oluşabilmesi için yeterince yakın bir verici ve alıcı florofor getirebilir. FRET canlı hücreler 4 protein-protein etkileşimlerini tespit başarılı olmuştur. Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için FRET kullanılmasının başlıca dezavantajı, donor-florofor uyarma dış aydınlatma için bir gerekliliktir. Emisyon sinyali, alıcı istenmeyen uyarma ve verici ve alıcı florofor hem ışıkla ağartma yüksek arka dış aydınlatma sonuçlanır. Bu etkiler, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için, tahlilin hassasiyetini azaltır. Dış aydınlatma yüksek bir arka plan sorununu ortadan FRET deneyinin bir modifikasyonu Bio-ışıldama Rezonans Enerji Transferi (BRET) tahlili 5,6 olan. BRET sisteminde donor-floroforu bir lusiferaz enzimi ile değiştirilir. Bu durumda, alıcı fluorofor uyarılması için enerji gereksiz dış aydınlatma ile, bir lusiferaz alt-tabakanın oksidasyonu ile, sistem içinde oluşturulur. ÇoğundaBu tahlilin ortak bir yapılandırma, verici Renilla lusiferaz reniformis ve akseptör (alternatif donör ve akseptör proteinlere ilişkin bir tartışma için Pfleger et al. bakınız: 5) YFP olmasıdır. Bu duruma göre, bu sistemde, ilgi konusu bir protein lusiferaz ve potansiyel olarak etkileşen protein YFP için, veya tam tersi kaynaşır. BRET deney lusiferaz için bir substrat olarak koelenterazin eklenmesini gerektirir. Coelenterazine hücre-geçirgen olduğu için, canlı hücrelerde BRET deneyleri gerçekleştirmek mümkündür. Bununla birlikte, doğal coelenterazine sulu çözelti içinde kararsız olduğu ve koelenterazin enzim bağımsız arıza tahlil için alt-tabaka mevcut konsantrasyonunu azaltır ve lusiferaz aktivitesi ölçümlerinin hassasiyetini azaltır autoluminescence oluşturur, her ikisi de. Canlı hücrelerdeki BRET kullanılması, sulu çözelti içinde stabil olan, ancak sitosolik esteraz ile bölünen korunan coelenterazines, geliştirilmesi ile kolaylaştırılmıştırhücre 7 içindeki aktif coelenterazine oluşturmak için hücre zarından difüzyon sonra s. Lusiferazı ve YFP-füzyon proteinlerini eksprese eden hücrelere substrat ilave edildikten sonra, protein-protein etkileşimleri kaynaklanan enerji transferi lusiferaz ve YFP gelen emisyon izleyerek ölçülür. Protein etkileşimleri, çok oyuklu plakalar içerisinde canlı hücreler doğrudan izlenebilir için, BRET deney maliyet ve zaman tasarruflu, varsayılan etkileşimlerini doğrulamak için basit bir ölçeklenebilir bir yöntem içerir. Proteomik tarama çalışmalarda tanımlanan varsayılan inter aktörlerin onaylamaya ek olarak, BRET sistem aynı zamanda, ilgi konusu bir protein üzerinde önceden biyokimyasal ve yapısal çalışmalarından gelen test aday uygulayıcı için kullanılabilir. , Bir protein-protein etkileşiminin varlığı (BRET yöntemi kullanılarak ya da diğer teknikler yoluyla) bir kez kurulduktan sonra BRET deney emp olması için potansiyel vardırloyed ayrıca etkileşimlerini karakterize etmek için. Örneğin, etkileşim bölgeleri proteinlerinin kesilmiş versiyonları üreterek eşlenebilir ve bu etkileşimde belirli tortuların katılımı nokta mutasyonlar oluşturarak kanıtlanabilir. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri ile ilgili çevrim sonrası modifikasyon veya (ilaç veya ligandlar gibi) küçük moleküller modüle edici etkisinin 8-10 araştırılabilir. Tahlil, aynı zamanda, hasta BRET DNA tanımlanan mutasyonlar araştırmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Durumda, bir mutasyon için nedensel rol BRET fenotip 11 moleküler etiyolojisi hakkında daha fazla ortaya çıkarabilir kullanılarak protein-protein etkileşimlerine mutasyonun etkisi araştırılarak kurulmuştur burada. Çeşitli potansiyel olarak zarar veren mutasyonların rele olduğu açık değildir, bu durumda, bir birey içinde tespit edilmesi için yeni nesil dizileme yöntemleri gelişiyle bu yana, giderek daha yaygın olduğufenotip 12 adjuvant. Bu durumda BRET deney protein işlevi üzerindeki mutasyonlar etkisini değerlendirmek için de değerlidir ve bozukluğa dolayısıyla alaka olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

Bio-ışıldama Rezonans Enerji Transferi (BRET) dayalı tahliller, canlı hücrelerde protein-protein etkileşimleri izlemek için bir hassas ve güvenilir bir araç sağlar. BRET bir &quot;alıcı&quot; flüoresan protein için bir &#39;verici&#39; lusiferaz enzim enerji radyatif olmayan transferidir. Bu deneyde en yaygın yapılandırmada, verici Renilla reniformis&#39;e lusiferaz ve alıcı sarı floresan proteini (YFP) &#39;dir. Enerji transferi verimi güçlü mesafe bağımlı olduğu için, BRET olgusunun gözlem verici ve alıcı yakın olması gerekir. Kültürlenen memeli hücrelerde ilgi iki protein arasındaki bir etkileşim için test etmek amacıyla, protein, bir lusiferaz ve YFP ile bir füzyon olarak, ikincisi ile bir füzyon olarak ifade edilir. Ilgilenilen iki protein arasında bir etkileşim verici ve enerji transferi oluşabilmesi için yeterince yakın akseptörü getirebilir. Protein-protein araştırmak için başka teknikler ile karşılaştırıldığındateractions, Bret tahlil duyarlı, küçük ellerini-zaman ve kaç reaktifler gerektirir, ve, zayıf geçici, ya da canlı bir hücrenin içinde bulunan biyokimyasal çevresine bağlıdır etkileşimleri tespit edebiliyor. Bu nedenle, maya iki-melez ya da kütle spektrofotometresi proteomik çalışmalar önerdiği varsayımsal etkileşimleri doğrulanması için ideal bir yaklaşımdır, ve ek olarak protein-protein etkileşimleri, çevirim sonrası değişikliklerin etkisini değerlendirmek, eşleme etkileşim bölgeleri için çok uygundur, ve Hasta DNA tanımlanan mutasyonların etkisini değerlendirmek.

BRET Analizin ilkesi Şekil 2&#39;de görüntülenmiştir. Burada yer alan deneyler boyunca kullanılan deney kurulumu, Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Bir lusiferaz-YFP füzyon proteini ile transfekte edilmiş hücrelerin güçlü bir BRET sinyalin tespiti enerji transferi gözlemlenebilir olduğunu doğruladı Bu deney düzeneğinde (Şekil 4). Bizim araştırma beyin gelişiminde transkripsiyonel baskılayıcıların FoxP ailenin rolü ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer at JoVE.com

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

investigating-protein-protein-interactions-live-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K Görüntüleme.  Max Planck Institute for Psycholinguistics.  Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir. 

Video: Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Biyoloji

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Floresans Rezonans Enerji Transferi Ligand-reseptör etkileşimleri gerçek zamanlı izleme

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...