Bu iş için finansal destek SIUC de Ulusal Bilim Vakfı, Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH), Malzeme Teknoloji Merkezi (MTC) ve Orda aracılığıyla sağlandı. Biz bir FE-SEM satın almak için bir hibe (CHE-0959568) için NSF ederim. Biz yararlı tartışmalar için Prof Matthew McCarroll teşekkür etmek istiyorum. Julia Reyes ona burs ve mali destek için COLCIENCIAS, Kolombiya Ajansı ve Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia teşekkür edecektir.

PDA Lipozomlar 4,5,6 A. Sentezi ve Karakterizasyonu Not 1: Tüm deney adımları boyunca her konteyner alüminyum folyo sarma kullanarak ışıktan PDA çözümü koruyun. Not 2: lipozom çözüm İki farklı setleri (B ve C) Aşağıdaki prosedür hazırlanmıştır A (PDA lipozomlar sentezi ve karakterizasyonu). 1. N-hidroksisüksinimid Diacteylene sentezi (NHS-PCDA) <ol><li> Lipozomlar hazırlamak için önemli bir madde PCDA-NHS gereklidir. Biz aşağıdaki prosedürü kullanarak PCDA-NHS sentezlenmiş adres: </li><li> (- 3 - (dimetilamino) propil)-3-etilkarbodiimid hidroklorid (0.144 g, 0.713 mmol 10,12-pentacosadiynoic asit (PCDA) (0.267 g, 0.713 mmol), N-hidroksisüksinimid (0,0914 g, 0.786 mmol) ve 1 ekleme ) kuru CH2 Cl 2 (20 ml) eklenmiştir. </li><li> 2 saat boyunca oda sıcaklığında çözelti karıştırılır. </li><li> Dikkatle r kullanılarak çözücü çıkarmakotary evaporatör bir kuru ince bir film elde edildi. </li><li> Dietil eter (25 ml) ve su (25 mL) ile üç kez kalıntı elde etmek için ayırma hunisi kullanarak. </li><li> Yarım saat için MgSO4 (1.0 g) ile organik katman kurutulur. Filtre ve beyaz bir katı toz (0.24 g,&gt;% 90) elde etmek üzere döner buharlaştırma ile çözgen çıkarın. </li><li> Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) altında son bileşik analiz edin. </li><li> 1H NMR (300 MHz, DMSO) δ (ppm): 0.893 (t, 3H), 1.268 (m, 26H), 1.512 (m, 4H), 1.754 (m, 2H), 2.252 (t, 4H), 2.365 (m, 1H), 2.610 (m, 1H), 2.842 (s, 2H). </li></ol> 2. Lipozom preparatı 5,6,7 <ol><li> PCDA-NHS: 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DMPC) :: 8: 1: 1 diklorometan içinde 20 ml PCDA çözülür. </li><li> Agrega kaldırmak için bir filtre kağıdı ile çözümü filtreleyin. </li><li> Monomerlerin ince bir film elde etmek için tamamen çözücü buharlaştırılır. </li><li> Vac altında ince film gecede kurulayınUUM. </li><li> İstenen bir konsantrasyon lipozom çözeltisi (0,65-1 mM) etmek için deiyonize su (50 ml) ile film hidratı. </li><li> 76&#39;da bir sonikatör probu ile ortaya çıkan süspansiyon sonikasyon ° C ~ 18 dak. </li><li> Dikkatle lipid agrega kaldırmak için bir kağıt filtre ile çözüm geçmek </li><li> 4. monomerlerin kendi montaj teşvik etmek için ° C&#39;da gece boyunca çözelti soğutulur. Nihai çözüm optik açık olmalıdır. </li><li> Havada bir Pen Ray UV kaynağı (4.5 mW / cm 2) kullanarak ~ 2 dakika süreyle UV radyasyon 254 nm ile ışınlama ile kendine monte Diasetilen monomerler (lipozom) Polimerize. </li><li> Lipozom çözelti, en azından iki hafta boyunca oda sıcaklığında yapıldı. Buzdolabında saklanan çözümü daha stabil oldu. </li></ol> Rodamin etiketli Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) modifiye PCDA lipozomlar B. Hazırlık 1. Lipozom yüzeye BSA-Rh Ciltleme <ol><li> PBS met BSA-Rh eritilirffer (iyonik konsantrasyon pH 7.2, 0.01 M idi) BSA-Rodamin çözelti 1.2 uM nihai konsantrasyon sağlamak için. </li><li> Oda sıcaklığında bir adım A.2. (Yukarıya bakınız) &#39;de hazırlanan bir lipozom çözelti, 10 ml BSA-Rodamin 2 ml (1.2 uM) ilave edilir. </li><li> Proteinlerin lizin kalıntısından NHS grup ile aktive edilmiş bir karboksilik asit ile amin gruplarının bağlayıcı için klasik tepkime (Şekil 2&#39;de Reaksiyon şeması) takip edilmiştir. NHS-PCDA NHS-amin reaksiyonları (bkz. Şekil 2, Aşama 2) kullanılarak lipozomlar ile kovalent olarak bağlayan protein molekülleri için (Şekil 2, adım 1) tasarlanmıştır. NHS ileri yönde amin-karboksilik asit reaksiyon tahrik mükemmel bir ayrılma ajandır. Uygun koşullar altında bu tepkimenin verimi kantitatif olmalıdır. </li><li> Ücretsiz BSA-Rh Temizleme: deiyonize w: Spectra / Por Biyoteknoloji Selüloz Ester (CE) membran (100.000 MW C Ç) Soak15 dakika için onra. Bu membran diyaliz için kullanılan deiyonize su içinde BSA ile Rodamin (Molekül ağırlığı ~ 66000 Da) uzaklaştırılmaktadır. </li><li> Diyaliz membran için çözüm dikkatlice aktarın. </li><li> Diyaliz sırasında 2 saatte su, 8 saat, 14 saat, 24 saat ve 36 saat değiştirin. </li><li> Alüminyum folyo ile kaplı bir şişe içinde nihai çözüm toplayın. </li></ol> C. hazırlanması SR-diamin ve Lipozomlar Biotin-etiketli 1. Bunun yerine adım 2.1 DMPC kullanmak yerine, biyotin-etiketli-(kullanır 1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-phosphoethanolamine-N-(biyotinil) (biyotin-DOPE). <ol><li> 2,9-2,2 aracılığıyla tüm adımları izleyin. </li><li> Bunun yerine BSA-Rh adım B&#39;de, (SR-diamin) tagged Sulphorhodamine Diamine kullanın. </li><li> B. tüm ileri adımlar takip </li><li> Bu hazırlık lipozomlar biotin içerdiği ve bunların yüzeylerinde SR-diamin. Müteakip adımlar bir istisna ile, A ve B (yukarıya bakınız) benzer olmuştur: Streptavidin soluti eklendideğişiklikler yoluyla biotin streptavidin etkileşimi araştırmak için verimlilik FRET. </li></ol> D. Temsilcisi Sonuçlar <img alt="Başlık Şekil" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" /> Başlık Şekil. Reaksiyon açıklayan bir karikatür ve lipozom yüzeyinde meydana işlemi (adım B izlenerek hazırlandı) FRET. Kullanarak lipozomlar protein bağlanma A. İzlenmesi 1 FRET İzlenmesi Rodamin ve adım B. hazırlanan PDA lipozomlar arasında FRET BSA-Rh uyarma ve emisyon spektrumları ve PDA emme spektrumu (Şekil 3A) alınır. Biz açıkça görebilirsiniz PDA absorpsiyon spektrumu ile BSA-Rh örtüşmektedir emisyon spektrumu. Bu FRET mekanizması için rezonans gereksinimi karşılar. Polimerizasyondan önce ve sonra BSA-Rodamin etiketli lipozomlar UV-V ile analiz edildive floresans spektroskopisi. Izole verici ve alıcı için, verimlilik donör-alıcı mesafesi (r) ve J 1 (j-değeri) bağımlı olduğu FRET. Emisyon Sertleştirme çünkü fotopolimerizasyon sonra mavi PDA elektronik absorpsiyon spektrum görünümü nedeniyle rodamin ve PDA arasındaki FRET (Şekil 3B) görülmektedir. Bizim durumumuzda, verimliliği unpolymerized lipozomlar ve Rodamin için sıfır FRET çünkü J görünür bölgede unpolymerized lipozomlar için = 0. Biz onların yüzeyinde NHS içermiyordu sadece PDA lipozomlarla benzer deneyler yaptı. Bu gibi durumlarda, BSA-Rh lipozomlar yüzeyine etiketlenmemiş edildi. Bu durumda, rodamin ve PDA (r ortalama) arasındaki ortalama mesafe Forster yarıçapı (R 0 = 2.8 nm) çok daha büyük oldu. Böylece, floresan yoğunluğunun büyük bir azalma gözlenmedi. Bu gözlemLSO zaman r &lt;2,8 nm floresan su verme baskın olduğunu göstermektedir. J ve R 0 değerlerini aşağıdaki formüller kullanılarak hesaplandı: [1] J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ R 0 = 0.211 [k 2 n -4 S D J (λ)] 1/6 Mavi-PDA sönme katsayısı (ε) -1 önceki streptavidin ilavesi için ~ 2000-10000 M -1 cm aralığındadır. Mavi-PDA sönüm katsayısı foto-polimerizasyon durumuna bağlıdır. [2] Örneğin, ε değerleri, daha uzun bir süre polimerize olan bir çözelti için daha büyük olacaktır. Ayrıca, Diasetilen monomerlerin kendi montaj da ε değerleri etkileyebilir. J Calculations Bu değişikliklerin dikkate almalarını, biotin streptavidin moleküler etkileşimler nedeniyle PDA söndürme katsayısı değişiklikleri yansıtacak. J değerleri deneysel PDA emilimi ve SR-101 emisyon verileri kullanılarak hesaplanmıştır. J değerlerindeki değişikliklerin çözelti (Şekil 4C) için streptavidin ve buna ek olarak aşağıdaki PDA elektronik emme spektrumu içinde kayması nedeniyle vardır. J değerleri ünitesi M -1 cm-1 nm 4&#39;tür. B. İzleme biyotin-etiketli lipozom çözümü için streptavidin ilavesiyle FRET Not 1: Rodamin ve yukarıdaki adım C hazırlanan PDA lipozomlar arasında FRET izlenmesi. Sulphorhodamine-etiketli bir eksitasyon ve emisyon spektrumlarına diamin (SR-diamin) ve PDA absorbsiyon spektrumunu (Şekil 4A) alınır. Unpolymerized ve polimerize biyotin etiketli lipozomlar UV-Vis kullanılarak analiz edildive floresans spektroskopisi. Rodamin (SR-101) emisyon FRET nedeniyle emisyon Sertleştirme düşündüren polimerizasyon (Şekil 4B) sonra yaklaşık% 45 azalmıştır. Lipozom çözelti, 2 ml solüsyon için streptavidin alikotları 40 ul (1 uM) ilave edilir. Çözümü için streptavidin ilavesi ile, J değerindeki değişiklikler (Şekil 4C) görülmektedir. Biyotin, streptavidin, PDA lipozomlar (Şekil 1 &#39;de ~ 645 nm de) mavi doruk şiddeti bağlar olarak (F ŞEKIL 1S) görülmektedir 540 nm&#39;de emme zirve de bir artış ise azalmıştır. Şekil 4D FRET değişiklikler gösterir verimlilik. Streptavidin konsantrasyon artışı ile azalmış FRET verimliliği de bizim tahmini ile tutarlıdır. Streptavidin her 40 ul kısım eklendikten sonra SR emisyon kaydedin. Biz strept ilavesinden sonra rodamin emisyon sürekli bir artış gözlenmektediravidin (Şekil 5). Rodamin emisyon bu artış biotin streptavidin etkileşimi izleyerek sulphorhodamine emisyon spektrumu ve PDA absorbans spektrumu J değerinde bir azalma nedeniyle. Moleküler düzeyde, biotin streptavidin etkileşimi daha termodinamik olarak kararlı kırmızı-PDA formu 2 mavi-PDA şeklinde bir azalma ile sonuçlanır PDA etkin konjugasyon uzunluğu ince değişikliklere yol açar. Bu J değerleri değişikliklerin temelini oluşturmaktadır. İlginç bir şekilde, PDA lipozom ile kovalent veya kovalent bağlı olmayan biotin için moleküler etkileşim içinde ince farklar bizim algılama tahlil kullanılarak 4 probed edilebilir. Ayrıca, kontrol deneyleri yapıldı ve streptavidin-biotin sistem için olanlarla aynı deneysel koşullar altında kontrol numunelerinin emisyon takip ettik. Kontrol deneyleri oluşur: bunların üzerine (1) bulunan Liposome çözümleri biyotinyüzey aynı hacim ve konsantrasyon tampon çözelti ilave edildi, ve (2), yüzey üzerinde biyotin reseptörleri olmadan Lipozom çözelti aynı hacim ve konsantrasyon streptavidin ilave edildi. Streptavidin ilave edildikten sonra biyotin-etiketli lipozom çözeltisinin yoğunluğu geliştirilmiş yoğunluk gösterdi fakat kontrol deneyleri lipozom çözelti yoğunluğunu (örneğin, Şekil 2S bakınız), diğer yandan, bir emisyon yoğunluğu azalma sergiledi. Bu çözelti bir seyreltme bağlanmaktadır. Bu deneyler açıkça çözeltisi geliştirilmiş emisyon spesifik molekül etkileşimleri nedeniyle olduğuna işaret etmektedir. Rodamin ve PDA çifti için Forster yarıçapına (R 0) (eq.2) ~ 2.80 nm olarak hesaplanır. Bu r 2.80 nm olduğunda izole PDA-rodamin çiftleri için, uyarılmış durum rodamin moleküllerinin% 50 PDA transfer onların enerjiye sahip olacağı anlamına gelir. Biz atıl<html> biotin kovalent PDA omurgaya takılı olduğunda, emisyon artış lipozomlar olmayan kovalent bağlı biotin oranla 2-3 kat daha büyük olduğunu. 4. Bu sonuçlar Önemle önerilen sistem etkileşimleri ince farkları ayırt duyarlı olduğunu düşündürmektedir Çeşit dönüştürücü de (biotin ve lipozom bilayeri arasındaki linker) lipozomlar bağlı kovalent ve non-kovalent bağlı reseptörler nedeniyle. Protein etkileşimlerinin spektrofotometre, gerçek zamanlı izleme (milisaniye içinde ikinci kez ölçeksiz) (UV-Vis spektroskopisi olarak) tarama ve veri toplama yetenekleri bağlı olarak bu algılama sistemi ile mümkündür. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" /> Mavi ve kırmızı PDA çözümleri Şekil 1. Absorpsiyon spektrumu. (Ankastre) optik mikroskop, bir dijital kamera ile çekilen. g &quot;/&gt; Şekil 2. PCDA-NHS sentezi (adım 1) için reaksiyon şeması. Proteinlerin amin ikame edici (adım 2) PCDA-NHS reaksiyon. Adım 2 PCDA monomer karboksilik asit proteinlerin lizin kalıntısı bağlayıcı temelidir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" /> Şekil 3A. Gözlenen değişim verimliliği PDA absorpsiyon spektrumunda değişiklikler nedeniyle FRET. Polimerizasyon önce BSA-Rh emisyon ve PDA emme arasında ancak FRET için gerekliliktir BSA-Rh emisyon ile polimerleşme PDA emilim çakışıyor sonra hiçbir çakışma yoktur. Rodamin bir donör (kırmızı) ve polimerize PDA lipozomlar bir alıcı (mavi) olarak hareket ederler. <img alt="Şekil 3B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" /> Şekil3B. Önce (mavi) ve PCDA polimerizasyon (kırmızı) sonra BSA-Rh etiketli lipozomlar floresans spektrumları. Rodamin emisyon büyük bir azalma rodamin ve PDA arasındaki FRET nedeniyle gözlenmiştir. <img alt="Şekil 4A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" /> .. Şekil 4A spektral örtüşme (J) PDA (mavi veya kırmızı) emilme tayfı ve Sulphorhodamine emisyon spektrumunu (turuncu) değişimi Şekil 4A uç durum için temsili spektrumu; streptavidin aşırı çözelti ilave edildiği zaman olmasıdır. Şekil 4A, streptavidin fazla miktarda ilave ardından hemen hemen tam bir mavi-to-kırmızı PDA dönüşüm gösterir. Açıkça J (spektral örtüşme) PDA absorbsiyon spektrumunun mavi-shift ile arttığı görülmektedir <img alt="Şekil 4B;" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" /> Şekil 4B. Floresans spektrumu önce (mavi) ve sonrası (red) lipozom polimerizasyonu. <img alt="Şekil 4C" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" /> Şekil 4C FRET için Durumu:. Donör (sulphorhodamine), lipozom çözeltiye ilave streptavidin ile alıcı (PDA) arasına J değişir. <img alt="Şekil 4D" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" /> Şekil 4D. Donör (sulphorhodamine), lipozom çözeltiye ilave streptavidin ile alıcı (PDA) arasındaki verim değişimi FRET. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" /> Şekil 5,. PDA lipozom çözelti için streptavidin hacimde ilave edildikten sonra Rodamin emisyon spektrumunu. Inset SR-101 spektrumları emisyon değişikliklerin büyük bir görünümdür.

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).</li><li>Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Colorimetric+Detection+of+a+Receptor-Ligand+Interaction+by+a+Polymerized+Bilayer+Assembly.">Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly.</a> Science. 261, 585-588 (1993).</li><li>Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Conceptual+and+Technological+Advances+in+Polydiacetylene-based+Supramolecular+Chemosensors.">Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).</li><li>Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Molecular+Interactions+in+Biosensors+Based+on+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer.">Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer.</a> J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).</li><li>Li, X., Matthews, S., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Polydiacetylene+Liposomes.">Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).</li><li>Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Conjugated+Liposomes.">Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes.</a> Langmuir. 22, (2006).</li><li>New, R. R. C., New, R. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).</li><li>Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+and+Fluorometric+Detection+of+Cationic+Surfactants+Based+on+Conjugated+Polydiacetylene+Supramolecules.">Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules.</a> Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).</li><li>Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Color+Display+System+Based+on+Thermochromic+Conjugated+Polydiacetylene.">A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene.</a> Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz, NHS-amin reaksiyonu kullanılarak bir lipozom yüzeyi üzerinde protein lisin artığının seçici bağlayıcı gerçekleştirdik. Bu tabanlı yöntem lipozom yüzeyine bağlama biotin streptavidin bağlayıcı protein (BSA) Gerçek zamanlı izleme yapma yeteneğine sahiptir FRET. Benzer işlem, seçici reseptörleri ile çeşitli protein etkileşimlerinin bağlayıcı dinamiklerini incelemek için uygulanabilir. Florofor spektral özelliklere bağlı J değerleri değişiklik sağlayacak floroforlar seç...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 10,12-pentacosadiynoic asit (PCDA) </td><td> GFS kimyasallar </td><td> 3261 </td><td> Hassas Işık </td></tr><tr><td> N-hidroksisüksinimid (NHS) </td><td> Acros organikler </td><td> 157270250 </td><td> Hassas Nem </td></tr><tr><td> 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilkarbodiimid hidroklorür (EDC) </td><td> Chem-impex Uluslararası </td><td> 00050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DMPC) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td> Rodamin etiketli Sığır Serum Albumin (BSA-Rh) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> (1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-phosphoethanolamine-N-(biyotinil) (biyotin-DOPE) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time monitoring of ligand-receptor interactions with fluorescence resonance energy transfer

FRET uzun menzilli dipol-dipol etkileşimleri 1 ile zemin-devlet alıcı moleküle bir heyecan verici molekül aktarılan enerji dışı ışınımsal olan bir süreçtir. Bir analit PDA 2,3,4,7 bağlanmış reseptörler ile etkileşime girer sonra PDA UV-Vis elektronik emme spektrumu (Şekil 1) mavi-kaydırma: Bu tahlil algılama olarak, PDA ilginç bir özellik kullanmaktadır. PDA absorpsiyon spektrumu bu kayma FRET verimliliği değişikliklere yol açar PDA (akseptör) ve rodamin (donör) arasındaki spektral örtüşme değişiklikler (J) sağlar. Böylece, analit (ligand) ve alıcılar arasındaki etkileşimleri donör floroforlar ve PDA arasındaki FRET ile tespit edilir. Özellikle, bir protein molekülünün streptavidin örnek bir algılama göstermektedir. Ayrıca ile sığır serum albümin (BSA) ile lipozomun yüzey kovalent bağlama yöntemi FRET göstermektedir. T arasındaki bu etkileşimlerO bilayeri lipozomlar ve protein molekülleri gerçek zamanlı olarak algılanabilir. Önerilen yöntem, küçük kimyasal ve biyokimyasal moleküllerin büyük duyulması için bir genel yöntemdir. Floresans Kalorimetresiz daha kendinden daha duyarlı olduğu için, testin saptama sınırının alt nanomolar aralığı ya da 8 daha düşük olabilir. Ayrıca, PDA FRET bir evrensel alıcı olarak hareket edebilir, bu çok sayıda sensör donör ve PDA lipozomlar yüzeyi üzerinde bağlanmış birçok farklı reseptör ile fonksiyonelleştirilmiş PDA (akseptör) ile geliştirilmiş olması anlamına gelir.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer at JoVE.com

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Bu konjuge polimer polydiacetylene (PDA), florofor biyomoleküllerin algılama için PDA lipozomlar yüzeyine bağlı arasında FRET göstermektedir. PDA lipozomlar da problar olarak kullanılmak üzere biyomoleküllerin için, yüzeyleri üzerinde reseptör molekülleri içermektedir. Ligand-reseptör etkileşimlerinin algılama mekanizmasının temelidir florofor ve PDA arasında FRET verim değişikliklere yol açmaktadır.

Floresans Rezonans Enerji Transferi Ligand-reseptör etkileşimleri gerçek zamanlı izleme

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

real-time-monitoring-ligand-receptor-interactions-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K Görüntüleme.  Southern Illinois University. Bu konjuge polimer polydiacetylene (PDA), florofor biyomoleküllerin algılama için PDA lipozomlar yüzeyine bağlı arasında FRET göstermektedir. PDA lipozomlar da problar olarak kullanılmak üzere biyomoleküllerin için, yüzeyleri üzerinde reseptör molekülleri içermektedir. Ligand-reseptör etkileşimlerinin algılama mekanizmasının temelidir florofor ve PDA arasında FRET verim değişikliklere yol açmaktadır.

Video: Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biyoloji

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Aurora kinazının Gerçek Zamanlı İzlenmesi Canlı Hücrelerde Konformasyonsal FRET Biyosensörleri Kullanılarak Aktivasyon

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...