NSF Oklahoma Üniversitesi (BZ) ve bir hibe (IOS-1.025.556, BZ ve RAB) bir iç fon destekleyen TRF, RAB, XP, AAO, MLW, CAS ve bu araştırma için teşekkür ederim. Bir NIH hibe (RO1 NS060878, BZ için) kısmen desteklenen RAB. RAB, Brandeis Üniversitesi&#39;nde verilen bir NIH NRSA (T32 NS07292) eğitim bursu, Brandeis Jeffrey Salonu&#39;nda verilen bir NIH hibe (RO1 GM21473), bu çalışmanın erken dönemlerinde destek için kabul eder. Biz bu proje için yaptığı sürekli teşvikler Jeffrey Salonu teşekkür ederim. Dr. Kristin Scott küvet P&gt; Gal80&gt; gerginlik bize sağlamak için teşekkür ederim .

1. Drosophila suşları <ol><li> Gal4 sürücü: Fotoreseptör hücrelerinin Gal4 ifade GMR-Gal4. </li><li> UAS hatları Gal4-ifade hücreleri, sinir dejenerasyonu neden UAS MJD78Q (veya UAS-polyQ). Gal4-ifade hücreler, GFP ifade UAS-GFP. </li><li> FLP hatları fotoreseptör ve beyin bölgelerinin altkümelerini FLP ifade ey-FLP. FLP iki kopya (FLP-IRES-FLP) içeren arttırıcı-trap hatları ET-FLPx2 hatları. Biz ekspresyonu karakterize henüz ~ 1.000 ET-FLP hatları (Bohm ve ark, 2010) yarattı. Burada, larva ve yetişkin bir sinek merkezi sinir sistemi (MSS) ET-FLPx2 seçin ifade deseninin karakterizasyonu açıklar. </li><li> FLP muhabir yw, aktin P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997) ile ET-FLPx2 ifade deseni raporları aktin P&gt; Gal4&gt; CD2 FLP aracılı recombinational eksizyon üzerine UAS-GFP. </li><li> İki tamamlayıcı Gal80 dönüştürme araçları Küvet P&gt; Gal80&gt; (Gordon ve Scott, 2009), yapısal olarak güçlü bir tubulin organizatörü tarafından yönlendirilen tüm dokulara Gal80 ifade flip-out bir yapım. FLP aracılı rekombinasyon üzerine&gt; Gal80 kalkan ve sadece Gal80 ifade sonlandırılır ET-FLPx2 ifade dokular. Küvet P&gt;&gt; Gal80 (Bohm ve ark, 2010), durdurmak, normal şartlar altında Gal80 ifade etmez inşa çevirin . Sadece tubulin organizatörü tarafından ifade Gal80 açık ET-FLPx2 ifade FLP&gt; durdurmak çevirir ve Gal80 döndürür dokular. </li><li> Bileşik göz FLP aktivitesi test için Sinekler GMR-Gal4 UAS-polyQ; tub P&gt;&gt; dejenere Gal80 (Bohm ve ark, 2010), ve depigmented gözleri durdurun. FLP-ifade fotoreseptör hücrelerinin, polyQ ifade Gal80 flip-aşağıdaki kapalı olan. GMR-Gal4, UAS-polyQ (Bohm ve ark, 2010) tub P&gt; Gal80&gt;, normal gözleri vardır. FLP-ifade fotoreseptör hücrelerinin, polyQ ifade Gal80 flip-out aşağıdaki açıktır. </li></ol> 2. Reaktifler Fosfat tamponlu salin (PBS, 1X), pH: 7.4. PFA, EM dereceli (Cat # 15.710, Elektronik Mikroskopi Bilimler, Hatfield, PA) PBS içinde seyreltilmesi% 16% 4 paraformaldehid (PFA), PBT,% 0.1 Triton-X 100 (Sigma) içeren 1XPBS Anti-Elav (mAb, 9F8A9 Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, Iowa Üniversitesi), lekeleri Drosophila bütün nöronlar. Anti-Repo (mAb 8D12 Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, Iowa Üniversitesi) Drosophila lekeleri glial hücreleri. Alexa 594 tavuk, fare sekonder antikoru karşı (Invitrogen) 3. Arttırıcı-trap FLPx2 hatları ifade desen Haritalama (* kritik adımlar) <ol><li> Yw bakireler kadın toplayın aktin P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP hattı ve erkekler için ayrı ayrı ET-FLPx2 hatları çapraz. Eski doku ET-FLP ifade GFP muhabir olarak hizmet vermektedir. </li><li> * 3. instar F1 larvaları dolaşıp parçalara ayır, 3X buz gibi soğuk PBS ile yıkama, buz üzerinde% 4 PFA 1 saat düzeltmek, CNS (yani beyin ve ventral sinir kablosu, VNC) ve vücut duvarı korumak izledi PBT 3X yıkar. Diseksiyon <ol><li> 3. instar F1 larvaları dolaşıp çıkarın ve temiz bir Sylgard çanak (35 mm 2 gram Sylgard ile dolu x 10 mm petri - karma talimatları üretimi göre) içine yerleştirin. <ol><li> Fırça ile yemek artıkları çıkarın </li></ol></li><li> Larvaları uyutmak için buz üzerinde buz 1XPBS ve yeri ile çanak doldurun </li><li> Forseps bir çift ile bir larva ağzında kanca tutun ve başka bir çift ile forseps uzanan ön hava deliği yakın ve arka sonuna doğru manikür soyma manikür kapmak. MSS, tükürük bezleri, gut, ve hayali diskler ile birlikte kanca ağız eklenecektir. </li><li> Aşırı doku ve MSS çevreleyen hayali diskleri çıkarın. </li><li> MSS bir PBS dolu 3 kabına aktarın. <ol><li> A silikonlu P200 pipet doku kurumasını önlemek için de kullanılabilir. </li></ol></li><li> 1 saat buz üzerinde% 4 PFA 200 ul saptamak için. <ol><li> MSS tamamen PFA batmış olduğundan emin olun. <ol><li> MSS yüzer ise, bu genellikle MSS çevreleyen doku temizlenir olmadığını göstermektedir. </li></ol></li></ol></li><li> PBT 3X yıkar takip 3X buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. </li></ol></li><li> * Yetişkin F1 sineklerin MSS parçalara ayır. <ol><li> CO 2 ile sinek anestezisi ya da 10 dakika boyunca buz üzerinde boş bir flakon içindeki sinekler yerde . </li><li> Yeri yetişkin için 30 saniye boyunca buz üzerinde% 95 EtOH dolu cam tabak içine uçuyor. </li><li> Yetişkin sinekler, cam tabak buz dolu bir 1XPBS içine aktarın. <ol><li> Artık EtOH kaldırmak için 1X PBS ile buz 3X yıkayın </li></ol></li><li> 35mm Sylga içine bir sinek yerleştirinrd çanak buz 1X PBS ile dolu </li><li> Ventral yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve karın yoluyla (minutiens pimler 0,1 mm) yarı yolda küçük bir böcek kalem eklemek. <ol><li> Forseps bir çifti kullanılarak bacakların tabanı tutun ve forseps başka bir çift bacakları kaldırmak. </li></ol></li><li> Baş manikür çıkarın <ol><li> Forseps bir çift burnumun kapma, göz altında ve sinek kafası dorsal orta hat doğru manikür kabuğu başka bir yerde. </li><li> Diğer göz tut ve diğer tarafta kalan manikür çıkarın. </li><li> Keskin forseps ve / veya bilenmiş tungsten iğne kullanarak, beyni çevreleyen trakeal doku çıkarmak <ol><li> Trakea yanlış temizlik GFP ifade engelleyen, güçlü bir oto-floresan sonucu, beyin sabitleme sırasında float izin </li></ol></li></ol></li><li> VNC Diseksiyon <ol><li> Torasik manikür çıkarın <ol><li> 3. preepisternum her iki tarafında iki forseps (yani, arka ayakları taban kapma), toraks arka sonunda başlayarak. </li><li> Yavaşça, manikür ventral orta hat çizgisi uzak ayrı bir boyun baz ulaşana kadar bu adımı tekrarlayın. </li><li> Yavaşça VNC açığa torasik manikür iki yarısı yayıldı </li></ol></li><li> Sonraki toraks karın çıkarın. Ikinci ayağı dibinde toraks tutmak için bir çift forseps kullanarak iken, 1. karın sternite yakın karın kapmak için başka bir çift forseps kullanımı ve karın çekin. </li><li> Çevredeki göğüs dokusundan VNC kaldırmak için. Forseps bir çift ve uzakta, forseps nazik gözyaşı torasik karkas çoğunluğu başka bir çift ile humerus alanda tutun. </li><li> Bu noktada, servikal bağ (boyun) çevreleyen bağ dokusunun bir halka olması gerekir. Iki forseps kullanma dışında halka gözyaşı. </li><li> VNC çevresindeki herhangi bir aşırı torasik dokular temizlenir </li></ol></li><li> Buz üzerinde 1X PBS içeren 9 iyi Pyrex çanak Transfer beyin ve VNC <ol><li> A silikonlu P200 pipet doku kurumasını önlemek için kullanılabilir </li></ol></li></ol></li><li> * 1 saat buz üzerinde% 4 PFA yetişkin MSS saptamak ve buz gibi soğuk PBS ve 3X PBT ile 3X yıkayın. </li><li> 4 yetişkin MSS hazırlanması veya larva merkezi sinir sistemi ve vücut duvarı ° C&#39;de karşı antikor (anti-Elav, 1:10) ya nöron veya glia (anti-Repo. 1:10) bir gecede. PBT 5X hazırlık yıkayın. </li><li> Alexa 594 tavuk 2 saat oda sıcaklığında fare sekonder antikoru (1:100) karşı olan erişkin veya larva hazırlanması ile inkübe ve hazırlık PBS ile yıkayın. </li><li> Mount bir slayt larva veya yetişkin MSS. CNS doğal şeklini korumak için, kapak kayma askıya için bir mini-köprü olarak slayt O-şeklinde bir plastik halka (Sil Takviye Etiket, Avery Dennison, Ofis Ürünleri, Brea, CA) kullanın. </li><li> GFP ve Elav (ya da Repo) bir floresan mikroskop altında ifade kalıpları için hazırlık inceleyin. </li></ol> 4. Fotoreseptörlerin baskı Gal4 iki tamamlayıcı Gal80-dönüştürücü araçlar uygulama <ol><li> Küvet aracılığıyla P Gal80 çevirme&gt; Gal80&gt; (Şekil 5A). <ol><li> Tub P&gt; Gal80&gt; hat; GMR-Gal4, UAS-polyQ erkek toplayın. Bileşik gözler bu sineklerin normal olduğunu unutmayın. </li><li> Ey-FLP bakireler çiftleşirler. </li><li> F1 sinekleri toplayın ve göz fenotip inceleyin. </li></ol></li><li> Yoluyla küvet Gal80 Flipping P&gt;&gt; Gal80 (Şekil 5B) dur. <ol><li> GMR-Gal4, UAS-polyQ toplamak; tub P&gt;&gt; Gal80 erkek sineklerin durdurmak ve göz fenotip incelemek. Not dejenere ve bu sinekler depigmente gözleri vahşi tip suşlar (Kanton-S) </li><li> Ey-FLP bakireler ile Mate; </li><li> F1 sinekleri toplayın ve göz fenotip inceleyin. </li></ol></li><li> Select ET-FLPx2 fotoreseptör hücrelerinin ifade hatlar </li></ol> 4.1 ve 4.2 Adımlar ET-FLPx2 çizgiler kullanılarak tekrar edilebilir olduğunu ifade FLP fotoreseptör hücrelerinin bir alt kümesi. Alternatif olarak, ya GMR-Gal4 UAS-polyQ tub P&gt; durdurmak&gt; Gal80 sinekleri ya da GMR-Gal4 UAS-polyQ tub P&gt; Gal80&gt; sinekler hatları için bireysel ET-FLPx2 hatları ekrana geçilebilir ifade fotoreseptör hücrelerinin FLP. Değerli ET-FLPx2 hatları olan ekspres FLP sadece bir alt kümesi veya tek fotoreseptör hücrelerinin (Şekil 6). 5. Temsilcisi sonuçları ET-FLPx2 belirli bir hattı ifade desen kolayca incelenir ve yw, aktin P arasında çapraz türetilmiştir F1 larvaları veya yetişkin uçar belgelenmelidir&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP bakireler ve ET-FLPx2 erkek (Şekil 1) . Tipik olarak, 04:57 disseke ve FLP ifade deseni (Bohm ve ark, 2010) tekrarlanabilirlik belirlemek için incelenir F1 hayvanların çoğaltır. <stRong&gt; Şekil 2, larva ve yetişkin MSS ET-FLPx2 hattı 173A FLP ifade deseni gösterir . FLP desen daha fazla nöron veya glial işaretleyici (Şekil 3 ve 4) kullanılarak analiz edilebilir. Şekil 7 de gösterilen sonuçlar Gal80 flip-etkinliğini göstermek ve Gal4 aşağıdaki FLP aracılı rekombinasyon intersectional baskı sistemleri çevirmek. Küvet P&gt; durdurmak&gt; Gal80 inşa Gal80 sızdıran herhangi bir ifade (fotoreseptör üniforması dejenerasyon ve depigmentasyon dayalı) sahip değildir ve henüz eyFLP yardımı ile bastırmak için Gal80 saygısız% 100 etkili GMR- Gal4 ve normal görünümleri (Şekil 7A) için göz geri. Aksine, küvet P&gt; Gal80&gt; tam eyFLP giriş öncesinde GMR-Gal4 bastırmıştır. GMR-Gal4 sürücüler UAS-polyQ ifade depigmente gözleri dejenere (Şekil 7B) ve önde gelen, Gal80, flip-out ardından. Bu örnekte, fotoreseptör &#39;devreleri&#39; harita için bir pan-Fotoreseptör FLP ancak davranışsal sonuçları incelemek vermedi. Davranışsal ilgili Gal4 hatları ile benzer yaklaşımlar kullanarak, erişkin sinek kanadı genişleme (Bohm ve ark, 2010) düzenleyen iki yöntem-Gal4 devre bir parçası eşlenen. Biz FINGR yöntemi davranış nöronal temelini anlamamıza yardım değerli olacağına inanıyoruz. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. ET-FLPx2 hattı ifade deseni incelenmesi ET-FLPx2 hattan FLP ifade deseni (mavi oval), ET-FLPx2 erkek (sol üst) bir aktin P&gt; CD2&gt; Gal4 geçerek belirlenebilir; UAS GFP bakire (sağ üstte). Ubiquitous Aktin P&gt; ebeveyn kadın Gal4 ifade FRT (siyah üçgenler) çevrili CD2 dizisi ekleme tarafından engellenmektedir. F1 döl, FLP tüketim CD2 dizisi, Aktin P&gt; Gal4 UAS-GFP ifade sürmek için izin. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Larva ve yetişkin merkezi sinir sisteminde bir ET-FLPx2 hattı İfade desen. Bu görüntüler çiftleşme yw, aktin P üretilen yavrular disseke santral sinir sistemi (beyin ve ventral sinir kablosu, VNC) tasvir&gt; CD2&gt; Gal4; ET-FLPx2 173A hattı UAS-GFP ebeveynler. &gt; CD2&gt; kaset dışarı yeniden birleştirilmesini, FLP aktin P&gt; GAL4 ifade (UAS-GFP sonucu ifade) harekete geçirir. Bu nedenle, GFP desen FLP-ifade hücreleri raporlar. Paneli B hattı 173A yetişkin ifade desen gösterir ise Paneli larva FLP ifade desenini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. ET-FLPx2 Hattı # 688A flippase ifade hücre tiplerinin karakterizasyonu, anti-REPO ET-FLPx2 hattı # 688A ve GFP Flippase raporlama hattı arasında bir haç ile boyanmış bir sabit F1 3. instar larva kompozit görüntü. 3. instar larvaları VNC arka ucunda alınan BD, yüksek büyütme (Zeiss Plan-Apochromat 63x yağ) görünümü. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4. ET-FLPx2 Hattı mantar bünyesinde hücre tiplerinin karakterizasyonu # 150 AC, anti-REPO ile boyanmış bir sabit F1 3. instar larva mantar vücut yüksek büyütmede (63x immersiyon yağı). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5. Flip-ve Flip-Gal80 Stratejileri İllüstrasyon. A., flip-out strateji tubulin organizatörü odaklı Gal80 (Küvet P&gt; Gal80&gt;), GMR-Gal4 baskı ve vahşi bir tip göz fenotip (kırmızı göz), yapısal olarak aktif . Bu baskı Gal80 (orta, kırmızı) çevirin ve GMR-Gal4 UAS-polyQ ifade sürücü sağlayacaktır FLP (mor), giriş kaldırılır. Bu fotoreseptör hücre dejenerasyonu (gözün beyaz noktalar ile gösterilmiştir) B. Önceki stratejinin karşılıklı tubulin Gal80 ifade organizatörü-odaklı &quot;dur&quot; kodon çevrili FRT (siyah üçgen) tarafından kesilir. Gal80 yokluğunda, GMR-Gal4 fotoreseptörlerde nöronal dejenerasyon (gözün beyaz noktalar ile gösterilmiştir) neden UAS-polyQ bağlanır. GMR-Gal4, UAS-polyQ geçerek; tub P&gt;&gt; GAL80 erkek fotoreseptör hücrelerinin FLP ifade bakire kadın, FLP (mor), &quot;dur&quot; kodon (orta eksize FRT siteleri rekombinasyon katalize durdurmak, kırmızı), böylece Gal80 ifade ve GMR-Gal4 bastırılması için izin verir. Bu fotoreseptör hücrelerinin (w eksikliği gösterilmiştir nörodejenerasyon tutargöz hite nokta). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="Şekil 6"/> Şekil 6. ET-FLPx2 Line # 688A kullanılarak Gal80 saygısız FINGR yöntemin uygulama ET-FLPx2 çizgisi arasında çapraz GMR-Gal4, UAS-polyQ # 688A bakire F1 döl; tubP&gt; GAL80 erkek. Göz ommatidia ortasında pigment eksikliği # 688A hattı FLP ifade temsil eder. Bu alanda Gal4 UAS-polyQ sürücü sağlayan GMR-Gal4 Gal80 bastırma rahatladım. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Şekil 7"/> Şekil 7. Içinde ya da dışında fotoreseptörlerde Gal4 kesiştiği Gal80 saygısız FINGR yöntemin uygulama. A. küvet P&gt;&gt; Gal80 flip-sistem FLP-bağımlı bir şekilde ifade GAL4 kısıtlayan durdurmak . GMR-Gal4, UAS-polyQ tub P&gt; durdurmak&gt; GAL80 sinekler, fotoreseptör hücrelerinin dejenere ve pigmentini kaybetmiş olan (sol sinek). EyFLP tanıtımı takiben, Gal80 sırayla ifade polyQ kapanır ve normal gözlerde sinek üreten (sağ sinek), GMR-Gal4, tam baskı, fotoreseptör hücrelerinin ifade edilir. B. küvet P&gt; Gal80&gt; Kapak -out sistemi, küvet gibi ters moda çalışır P&gt; ​​durdurmak&gt; Gal80 flip-sistem . Küvet P&gt; Gal80&gt; yapısal GAL4 bastıran ve polyQ ifadesi (normal göz ile, sinek sol) bastırır. Gal80 eyFLP tanıtımı takiben, GMR-Gal4 bastırma giderici ve ifade polyQ dönüm fotoreseptör hücrelerinin çevrilmiş. Bu dejenere ve depigmente göz (sağ sinek) sinekler yol açar.

<ol>
	<li>Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mosaic+approach+for+neural+circuit+mapping+in+Drosophila.">A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+genes+are+required+for+neural+stem+cell+survival+in+postembryonic+neurogenesis+of+Drosophila.">Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila.</a> Development. 134, 1091-1099 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. , 34-341 (2002).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302, 1765-1768 (2003).</li><li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+tissue+specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4.">A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[Switch],+a+system+for+spatial+and+temporal+control+of+gene+expression+in+Drosophila+melanogaster.">P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li></ol>

Gal4/UAS sistemi çeşitli biyolojik çalışmalar için Drosophilists (Duffy, 2002 Marka &amp; Perrimon, 1993) tarafından kullanılan yaygın ve başarılı olmuştur. Bugüne kadar, sinek toplum organizatörü odaklı ve arttırıcı-trap Gal4 hatları binlerce üretti. FINGR yöntemin önemli bir gücü mümkün Drosophila çalışmaları Gal4 gücünü önemli ölçüde genişletmek için, Gal4/UAS sistem ile uyumlu olduğunu. FINGR yöntemin önemli bir uygulama Gal4/Gal80 kesiştiği yoluyla davranışın altında yatan ince ayar sinir devreleri. Bu davranışlar içerebilir, ancak öğrenme ve hafıza, kur, uyku, ve sirkadiyen ritim, bunlarla sınırlı değildir. Ayrıca, Alzheimer gibi insan nörodejeneratif hastalıklar, Amyotrofik lateral skleroz (ALS), Parkinson hastalığı modelleme nörodejenerasyon eğilimli olan kritik nöronların haritaya FINGR yöntemi kullanılabilir. Benzer şekilde, aracılık kokain, alkol ve diğer madde bağımlılığı için çok önemli nöronların veya nöral devreleri odakları FINGR yöntemi kullanılarak eşleştirilmiş olabilir. FINGR yöntemi ile sinir devreleri ve davranışları zamansal kontrol kazanmak için olabilir; koşullu Gal4s (Roman ve ark, 2001 Osterwalder ve ark, 2001) dikkat edilmelidir. Gal80 dönüştürme araçları Modifikasyonu ısıya duyarlı Gal80 (Gal80 ts, McGuire ve ark, 2003) kullanarak üretebilir küvet durdurmak P&gt;&gt; Gal80 ts ya da küvet P&gt; Gal80 ts&gt; devre manipülasyon daha zamansal esneklikler ekleyerek. Sinir sisteminin ötesinde, FINGR yöntemi, kanat veya bacak olup olmadığını hücre altkümelerini Gal4 ifade kısıtlayan için de geçerlidir. ET-FLPx2 hatları MARCM (Lee ve Luo, 1999) de dahil olmak üzere FRT / FLP tabanlı klonal analiz (Xu ve Rubin, 1993), ilgilenen tüm Drosophila biyologlar için değerli bir kaynak olacaktır. Aynı zamanda bazı ET-FLPx2 hatları, tekrarlanabilir klonlar üretmek için ve tekrarlanan morfolojik ve davranışsal analizleri için heatshock FLP yerine bekleniyor. Arttırıcı-trap Gal4 hatları gibi, en ET-FLPx2 hatları faiz hücreler özellikle ifade edilmesi olası değildir. Çoğu hatları ilgi hücreler VE yanı sıra diğer hücreleri veya dokuları FLP ifade edecektir. Ancak, hem de Gal4 ve ET-FLPx2 &#39;doku özgüllüğü eksikliği sürece kendi örtüşen bölge belirli bir deney için arzu edilir FINGR yöntemi için önemli bir endişe olmaz. FINGR iki &#39;geniş&#39; sistemleri rafine bir birine çevirmek için tasarlanmıştır. Bu protokollerin gösterilen yöntemler oldukça standart ve tekrarlanabilir olmalıdır. Kişinin dikkatini gerektiren önemli bir uyarıcı adımları fiksatif seçimi ve kullanımı. GFP sinyal söndürmeye çünkü PFA daha başka Fiksatifler kaçınılmalıdır. Ayrıca PFA FLP ifade GFP tarafından güvenilir olmaz olasılığını önlemek için fiksasyon diseksiyon çanak gerektiğini kaydetti var.

mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns

Gal4 / UAS ikili yöntemi Drosophila gen ve nöral devreleri manipülasyon için güçlü. En nörobiyolojik çalışmalar için, ancak, Gal4 ifade nadiren davranışsal okuma ile devre arasında kesin bir ilişki için yetecek kadar doku-spesifik. Bu büyük bir engel aşmak için, son zamanlarda ilgi doku daha kısıtlayıcı bir Gal4 ifade elde etmek için FINGR yöntem geliştirdi. 2) FLP / FRT-aracılı Gal80 dönüştürme araçları kümesi; geleneksel Gal4/UAS sistemi 1) ve 3) arttırıcı-trap FLP (ET-FLP): FINGR yöntemi üç bileşeni vardır. Gal4 ilgi primer nöral devreleri tanımlamak için kullanılır. Gal4 Sebze UAS-efektör UAS-MJD78Q veya UAS-Shi ts gibi, sinek davranış değişiklikleri ile kendini gösteren nöronal aktivitenin, düzenler. UAS-GFP, belirli bir davranış katılan nöral devre gibi bir ek ile UAS-muhabiri aynı zamanda morfolojik analizi için eşlenebilir. Küvet P&gt; Gal80&gt; (&#39;çevirmek&#39;) ve küvet P&gt;&gt; Gal80 (&#39;çevirmek&#39;) durdurmak: Gal4 hatları için geniş bir ifade ile, Gal4 ifade birbirini tamamlayan iki Gal80-dönüştürme araçları ile sınırlı olabilir Son olarak, doku-spesifik ET-FLP yardımıyla araştırmacılar, sırasıyla, Gal80 açmak ya da kapatabilirsiniz. Kapak modu, Gal80 Gal4 ve ET-FLP kesiştiği yerde Gal4 ifade bastırmak. Flip-out modunda, Gal80 Gal4 ve FLP örtüşme hücrelerinde Gal4 baskı rahatlatmak olacaktır. Her iki yaklaşım Gal4 tanımlanmış devre hücrelerinin sayısını kısıtlama sağlar, ancak ters bir desen. FINGR yöntemi Gal4 sinek topluluk hatları ve geleneksel klonal analizi ve nöral devre haritalama için çok yönlü geniş bir koleksiyon ile uyumludur. Bu protokol, FLP ekspresyonu haritalama seçin ET-FLPx2 hatları ve fotoreseptör hücrelerinin FINGR yöntemin etkinliğini göstermektedir. FINGR yönteminin prensibi de Gal4/UAS, Gal80 ve FLP / FRT kullanıldığı diğer genetik model organizmalar için geçerli olmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS at JoVE.com

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Biz, doku-spesifik FLP Gal80 ifade kalıplarını belirlemek için izin bir Flippase indüklenen intersectional Gal80/Gal4 baskı (FINGR) yöntemi açıklanmaktadır. Her yerde Gal4 ve FLP örtüşme, Gal4 ifade açık (Gal80 yukarı ve aşağı döndürülebiliyor) veya kapalı (Gal80 içinde döndürülebiliyorlar,). FINGR yöntem klonal analizi ve nöral devre haritalama için çok yönlüdür.

Larvaların ve Yetişkin Enhancer-trap Flippase İfade Haritalama ve Uygulama Drosophila MSS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

mapping-application-enhancer-trap-flippase-expression-larval-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

16.5K Görüntüleme.  University of Oklahoma - Norman. Biz, doku-spesifik FLP Gal80 ifade kalıplarını belirlemek için izin bir Flippase indüklenen intersectional Gal80/Gal4 baskı (FINGR) yöntemi açıklanmaktadır. Her yerde Gal4 ve FLP örtüşme, Gal4 ifade açık (Gal80 yukarı ve aşağı döndürülebiliyor) veya kapalı (Gal80 içinde döndürülebiliyorlar,). FINGR yöntem klonal analizi ve nöral devre haritalama için çok yönlüdür.

Video: Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Nörobilim

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between cell types or even within a given type? What kinds of spatial rules do they follow? The answers to such fundamental questions in vivo have been hampered so far by a lack of tools for high resolution single cell labeling. Here, a detailed protocol to target single cells with a MultiColor FlpOut (MCFO) technique is provided. This method relies on three differently tagged reporters (HA, FLAG and V5) under UAS control that are kept silent by a transcriptional terminator flanked by two FRT sites (FRT-stop-FRT). A heat shock pulse induces the expression of a heat shock-induced Flp recombinase, which randomly removes the FRT-stop-FRT cassettes in individual cells: expression occurs only in cells that also express a GAL4 driver. This leads to an array of differently colored cells of a given cell type that allows the visualization of individual cell morphologies at high resolution. As an example, the MCFO technique can be combined with specific glial GAL4 drivers to visualize the morphologies of the different glial subtypes in the adult Drosophila brain.

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Cells display different morphologies and establish a variety of interactions with their neighbors. This protocol describes how to reveal the morphology of single cells and to investigate cell-cell interaction by using the well-established Gal4/UAS expression system.

Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

Davranış

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Gelişim Biyolojisi

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

In iştahlı İlişkilendirilebilir Olfaktör Öğrenme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Larvaların ve Yetişkin Enhancer-trap Flippase İfade Haritalama ve Uygulama Drosophila MSS

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler