NSF Oklahoma Üniversitesi (BZ) ve bir hibe (IOS-1.025.556, BZ ve RAB) bir iç fon destekleyen TRF, RAB, XP, AAO, MLW, CAS ve bu araştırma için teşekkür ederim. Bir NIH hibe (RO1 NS060878, BZ için) kısmen desteklenen RAB. RAB, Brandeis Üniversitesi&#39;nde verilen bir NIH NRSA (T32 NS07292) eğitim bursu, Brandeis Jeffrey Salonu&#39;nda verilen bir NIH hibe (RO1 GM21473), bu çalışmanın erken dönemlerinde destek için kabul eder. Biz bu proje için yaptığı sürekli teşvikler Jeffrey Salonu teşekkür ederim. Dr. Kristin Scott küvet P&gt; Gal80&gt; gerginlik bize sağlamak için teşekkür ederim .

1. Drosophila suşları <ol><li> Gal4 sürücü: Fotoreseptör hücrelerinin Gal4 ifade GMR-Gal4. </li><li> UAS hatları Gal4-ifade hücreleri, sinir dejenerasyonu neden UAS MJD78Q (veya UAS-polyQ). Gal4-ifade hücreler, GFP ifade UAS-GFP. </li><li> FLP hatları fotoreseptör ve beyin bölgelerinin altkümelerini FLP ifade ey-FLP. FLP iki kopya (FLP-IRES-FLP) içeren arttırıcı-trap hatları ET-FLPx2 hatları. Biz ekspresyonu karakterize henüz ~ 1.000 ET-FLP hatları (Bohm ve ark, 2010) yarattı. Burada, larva ve yetişkin bir sinek merkezi sinir sistemi (MSS) ET-FLPx2 seçin ifade deseninin karakterizasyonu açıklar. </li><li> FLP muhabir yw, aktin P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997) ile ET-FLPx2 ifade deseni raporları aktin P&gt; Gal4&gt; CD2 FLP aracılı recombinational eksizyon üzerine UAS-GFP. </li><li> İki tamamlayıcı Gal80 dönüştürme araçları Küvet P&gt; Gal80&gt; (Gordon ve Scott, 2009), yapısal olarak güçlü bir tubulin organizatörü tarafından yönlendirilen tüm dokulara Gal80 ifade flip-out bir yapım. FLP aracılı rekombinasyon üzerine&gt; Gal80 kalkan ve sadece Gal80 ifade sonlandırılır ET-FLPx2 ifade dokular. Küvet P&gt;&gt; Gal80 (Bohm ve ark, 2010), durdurmak, normal şartlar altında Gal80 ifade etmez inşa çevirin . Sadece tubulin organizatörü tarafından ifade Gal80 açık ET-FLPx2 ifade FLP&gt; durdurmak çevirir ve Gal80 döndürür dokular. </li><li> Bileşik göz FLP aktivitesi test için Sinekler GMR-Gal4 UAS-polyQ; tub P&gt;&gt; dejenere Gal80 (Bohm ve ark, 2010), ve depigmented gözleri durdurun. FLP-ifade fotoreseptör hücrelerinin, polyQ ifade Gal80 flip-aşağıdaki kapalı olan. GMR-Gal4, UAS-polyQ (Bohm ve ark, 2010) tub P&gt; Gal80&gt;, normal gözleri vardır. FLP-ifade fotoreseptör hücrelerinin, polyQ ifade Gal80 flip-out aşağıdaki açıktır. </li></ol> 2. Reaktifler Fosfat tamponlu salin (PBS, 1X), pH: 7.4. PFA, EM dereceli (Cat # 15.710, Elektronik Mikroskopi Bilimler, Hatfield, PA) PBS içinde seyreltilmesi% 16% 4 paraformaldehid (PFA), PBT,% 0.1 Triton-X 100 (Sigma) içeren 1XPBS Anti-Elav (mAb, 9F8A9 Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, Iowa Üniversitesi), lekeleri Drosophila bütün nöronlar. Anti-Repo (mAb 8D12 Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, Iowa Üniversitesi) Drosophila lekeleri glial hücreleri. Alexa 594 tavuk, fare sekonder antikoru karşı (Invitrogen) 3. Arttırıcı-trap FLPx2 hatları ifade desen Haritalama (* kritik adımlar) <ol><li> Yw bakireler kadın toplayın aktin P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP hattı ve erkekler için ayrı ayrı ET-FLPx2 hatları çapraz. Eski doku ET-FLP ifade GFP muhabir olarak hizmet vermektedir. </li><li> * 3. instar F1 larvaları dolaşıp parçalara ayır, 3X buz gibi soğuk PBS ile yıkama, buz üzerinde% 4 PFA 1 saat düzeltmek, CNS (yani beyin ve ventral sinir kablosu, VNC) ve vücut duvarı korumak izledi PBT 3X yıkar. Diseksiyon <ol><li> 3. instar F1 larvaları dolaşıp çıkarın ve temiz bir Sylgard çanak (35 mm 2 gram Sylgard ile dolu x 10 mm petri - karma talimatları üretimi göre) içine yerleştirin. <ol><li> Fırça ile yemek artıkları çıkarın </li></ol></li><li> Larvaları uyutmak için buz üzerinde buz 1XPBS ve yeri ile çanak doldurun </li><li> Forseps bir çift ile bir larva ağzında kanca tutun ve başka bir çift ile forseps uzanan ön hava deliği yakın ve arka sonuna doğru manikür soyma manikür kapmak. MSS, tükürük bezleri, gut, ve hayali diskler ile birlikte kanca ağız eklenecektir. </li><li> Aşırı doku ve MSS çevreleyen hayali diskleri çıkarın. </li><li> MSS bir PBS dolu 3 kabına aktarın. <ol><li> A silikonlu P200 pipet doku kurumasını önlemek için de kullanılabilir. </li></ol></li><li> 1 saat buz üzerinde% 4 PFA 200 ul saptamak için. <ol><li> MSS tamamen PFA batmış olduğundan emin olun. <ol><li> MSS yüzer ise, bu genellikle MSS çevreleyen doku temizlenir olmadığını göstermektedir. </li></ol></li></ol></li><li> PBT 3X yıkar takip 3X buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. </li></ol></li><li> * Yetişkin F1 sineklerin MSS parçalara ayır. <ol><li> CO 2 ile sinek anestezisi ya da 10 dakika boyunca buz üzerinde boş bir flakon içindeki sinekler yerde . </li><li> Yeri yetişkin için 30 saniye boyunca buz üzerinde% 95 EtOH dolu cam tabak içine uçuyor. </li><li> Yetişkin sinekler, cam tabak buz dolu bir 1XPBS içine aktarın. <ol><li> Artık EtOH kaldırmak için 1X PBS ile buz 3X yıkayın </li></ol></li><li> 35mm Sylga içine bir sinek yerleştirinrd çanak buz 1X PBS ile dolu </li><li> Ventral yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve karın yoluyla (minutiens pimler 0,1 mm) yarı yolda küçük bir böcek kalem eklemek. <ol><li> Forseps bir çifti kullanılarak bacakların tabanı tutun ve forseps başka bir çift bacakları kaldırmak. </li></ol></li><li> Baş manikür çıkarın <ol><li> Forseps bir çift burnumun kapma, göz altında ve sinek kafası dorsal orta hat doğru manikür kabuğu başka bir yerde. </li><li> Diğer göz tut ve diğer tarafta kalan manikür çıkarın. </li><li> Keskin forseps ve / veya bilenmiş tungsten iğne kullanarak, beyni çevreleyen trakeal doku çıkarmak <ol><li> Trakea yanlış temizlik GFP ifade engelleyen, güçlü bir oto-floresan sonucu, beyin sabitleme sırasında float izin </li></ol></li></ol></li><li> VNC Diseksiyon <ol><li> Torasik manikür çıkarın <ol><li> 3. preepisternum her iki tarafında iki forseps (yani, arka ayakları taban kapma), toraks arka sonunda başlayarak. </li><li> Yavaşça, manikür ventral orta hat çizgisi uzak ayrı bir boyun baz ulaşana kadar bu adımı tekrarlayın. </li><li> Yavaşça VNC açığa torasik manikür iki yarısı yayıldı </li></ol></li><li> Sonraki toraks karın çıkarın. Ikinci ayağı dibinde toraks tutmak için bir çift forseps kullanarak iken, 1. karın sternite yakın karın kapmak için başka bir çift forseps kullanımı ve karın çekin. </li><li> Çevredeki göğüs dokusundan VNC kaldırmak için. Forseps bir çift ve uzakta, forseps nazik gözyaşı torasik karkas çoğunluğu başka bir çift ile humerus alanda tutun. </li><li> Bu noktada, servikal bağ (boyun) çevreleyen bağ dokusunun bir halka olması gerekir. Iki forseps kullanma dışında halka gözyaşı. </li><li> VNC çevresindeki herhangi bir aşırı torasik dokular temizlenir </li></ol></li><li> Buz üzerinde 1X PBS içeren 9 iyi Pyrex çanak Transfer beyin ve VNC <ol><li> A silikonlu P200 pipet doku kurumasını önlemek için kullanılabilir </li></ol></li></ol></li><li> * 1 saat buz üzerinde% 4 PFA yetişkin MSS saptamak ve buz gibi soğuk PBS ve 3X PBT ile 3X yıkayın. </li><li> 4 yetişkin MSS hazırlanması veya larva merkezi sinir sistemi ve vücut duvarı ° C&#39;de karşı antikor (anti-Elav, 1:10) ya nöron veya glia (anti-Repo. 1:10) bir gecede. PBT 5X hazırlık yıkayın. </li><li> Alexa 594 tavuk 2 saat oda sıcaklığında fare sekonder antikoru (1:100) karşı olan erişkin veya larva hazırlanması ile inkübe ve hazırlık PBS ile yıkayın. </li><li> Mount bir slayt larva veya yetişkin MSS. CNS doğal şeklini korumak için, kapak kayma askıya için bir mini-köprü olarak slayt O-şeklinde bir plastik halka (Sil Takviye Etiket, Avery Dennison, Ofis Ürünleri, Brea, CA) kullanın. </li><li> GFP ve Elav (ya da Repo) bir floresan mikroskop altında ifade kalıpları için hazırlık inceleyin. </li></ol> 4. Fotoreseptörlerin baskı Gal4 iki tamamlayıcı Gal80-dönüştürücü araçlar uygulama <ol><li> Küvet aracılığıyla P Gal80 çevirme&gt; Gal80&gt; (Şekil 5A). <ol><li> Tub P&gt; Gal80&gt; hat; GMR-Gal4, UAS-polyQ erkek toplayın. Bileşik gözler bu sineklerin normal olduğunu unutmayın. </li><li> Ey-FLP bakireler çiftleşirler. </li><li> F1 sinekleri toplayın ve göz fenotip inceleyin. </li></ol></li><li> Yoluyla küvet Gal80 Flipping P&gt;&gt; Gal80 (Şekil 5B) dur. <ol><li> GMR-Gal4, UAS-polyQ toplamak; tub P&gt;&gt; Gal80 erkek sineklerin durdurmak ve göz fenotip incelemek. Not dejenere ve bu sinekler depigmente gözleri vahşi tip suşlar (Kanton-S) </li><li> Ey-FLP bakireler ile Mate; </li><li> F1 sinekleri toplayın ve göz fenotip inceleyin. </li></ol></li><li> Select ET-FLPx2 fotoreseptör hücrelerinin ifade hatlar </li></ol> 4.1 ve 4.2 Adımlar ET-FLPx2 çizgiler kullanılarak tekrar edilebilir olduğunu ifade FLP fotoreseptör hücrelerinin bir alt kümesi. Alternatif olarak, ya GMR-Gal4 UAS-polyQ tub P&gt; durdurmak&gt; Gal80 sinekleri ya da GMR-Gal4 UAS-polyQ tub P&gt; Gal80&gt; sinekler hatları için bireysel ET-FLPx2 hatları ekrana geçilebilir ifade fotoreseptör hücrelerinin FLP. Değerli ET-FLPx2 hatları olan ekspres FLP sadece bir alt kümesi veya tek fotoreseptör hücrelerinin (Şekil 6). 5. Temsilcisi sonuçları ET-FLPx2 belirli bir hattı ifade desen kolayca incelenir ve yw, aktin P arasında çapraz türetilmiştir F1 larvaları veya yetişkin uçar belgelenmelidir&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP bakireler ve ET-FLPx2 erkek (Şekil 1) . Tipik olarak, 04:57 disseke ve FLP ifade deseni (Bohm ve ark, 2010) tekrarlanabilirlik belirlemek için incelenir F1 hayvanların çoğaltır. <stRong&gt; Şekil 2, larva ve yetişkin MSS ET-FLPx2 hattı 173A FLP ifade deseni gösterir . FLP desen daha fazla nöron veya glial işaretleyici (Şekil 3 ve 4) kullanılarak analiz edilebilir. Şekil 7 de gösterilen sonuçlar Gal80 flip-etkinliğini göstermek ve Gal4 aşağıdaki FLP aracılı rekombinasyon intersectional baskı sistemleri çevirmek. Küvet P&gt; durdurmak&gt; Gal80 inşa Gal80 sızdıran herhangi bir ifade (fotoreseptör üniforması dejenerasyon ve depigmentasyon dayalı) sahip değildir ve henüz eyFLP yardımı ile bastırmak için Gal80 saygısız% 100 etkili GMR- Gal4 ve normal görünümleri (Şekil 7A) için göz geri. Aksine, küvet P&gt; Gal80&gt; tam eyFLP giriş öncesinde GMR-Gal4 bastırmıştır. GMR-Gal4 sürücüler UAS-polyQ ifade depigmente gözleri dejenere (Şekil 7B) ve önde gelen, Gal80, flip-out ardından. Bu örnekte, fotoreseptör &#39;devreleri&#39; harita için bir pan-Fotoreseptör FLP ancak davranışsal sonuçları incelemek vermedi. Davranışsal ilgili Gal4 hatları ile benzer yaklaşımlar kullanarak, erişkin sinek kanadı genişleme (Bohm ve ark, 2010) düzenleyen iki yöntem-Gal4 devre bir parçası eşlenen. Biz FINGR yöntemi davranış nöronal temelini anlamamıza yardım değerli olacağına inanıyoruz. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. ET-FLPx2 hattı ifade deseni incelenmesi ET-FLPx2 hattan FLP ifade deseni (mavi oval), ET-FLPx2 erkek (sol üst) bir aktin P&gt; CD2&gt; Gal4 geçerek belirlenebilir; UAS GFP bakire (sağ üstte). Ubiquitous Aktin P&gt; ebeveyn kadın Gal4 ifade FRT (siyah üçgenler) çevrili CD2 dizisi ekleme tarafından engellenmektedir. F1 döl, FLP tüketim CD2 dizisi, Aktin P&gt; Gal4 UAS-GFP ifade sürmek için izin. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Larva ve yetişkin merkezi sinir sisteminde bir ET-FLPx2 hattı İfade desen. Bu görüntüler çiftleşme yw, aktin P üretilen yavrular disseke santral sinir sistemi (beyin ve ventral sinir kablosu, VNC) tasvir&gt; CD2&gt; Gal4; ET-FLPx2 173A hattı UAS-GFP ebeveynler. &gt; CD2&gt; kaset dışarı yeniden birleştirilmesini, FLP aktin P&gt; GAL4 ifade (UAS-GFP sonucu ifade) harekete geçirir. Bu nedenle, GFP desen FLP-ifade hücreleri raporlar. Paneli B hattı 173A yetişkin ifade desen gösterir ise Paneli larva FLP ifade desenini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. ET-FLPx2 Hattı # 688A flippase ifade hücre tiplerinin karakterizasyonu, anti-REPO ET-FLPx2 hattı # 688A ve GFP Flippase raporlama hattı arasında bir haç ile boyanmış bir sabit F1 3. instar larva kompozit görüntü. 3. instar larvaları VNC arka ucunda alınan BD, yüksek büyütme (Zeiss Plan-Apochromat 63x yağ) görünümü. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4. ET-FLPx2 Hattı mantar bünyesinde hücre tiplerinin karakterizasyonu # 150 AC, anti-REPO ile boyanmış bir sabit F1 3. instar larva mantar vücut yüksek büyütmede (63x immersiyon yağı). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5. Flip-ve Flip-Gal80 Stratejileri İllüstrasyon. A., flip-out strateji tubulin organizatörü odaklı Gal80 (Küvet P&gt; Gal80&gt;), GMR-Gal4 baskı ve vahşi bir tip göz fenotip (kırmızı göz), yapısal olarak aktif . Bu baskı Gal80 (orta, kırmızı) çevirin ve GMR-Gal4 UAS-polyQ ifade sürücü sağlayacaktır FLP (mor), giriş kaldırılır. Bu fotoreseptör hücre dejenerasyonu (gözün beyaz noktalar ile gösterilmiştir) B. Önceki stratejinin karşılıklı tubulin Gal80 ifade organizatörü-odaklı &quot;dur&quot; kodon çevrili FRT (siyah üçgen) tarafından kesilir. Gal80 yokluğunda, GMR-Gal4 fotoreseptörlerde nöronal dejenerasyon (gözün beyaz noktalar ile gösterilmiştir) neden UAS-polyQ bağlanır. GMR-Gal4, UAS-polyQ geçerek; tub P&gt;&gt; GAL80 erkek fotoreseptör hücrelerinin FLP ifade bakire kadın, FLP (mor), &quot;dur&quot; kodon (orta eksize FRT siteleri rekombinasyon katalize durdurmak, kırmızı), böylece Gal80 ifade ve GMR-Gal4 bastırılması için izin verir. Bu fotoreseptör hücrelerinin (w eksikliği gösterilmiştir nörodejenerasyon tutargöz hite nokta). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="Şekil 6"/> Şekil 6. ET-FLPx2 Line # 688A kullanılarak Gal80 saygısız FINGR yöntemin uygulama ET-FLPx2 çizgisi arasında çapraz GMR-Gal4, UAS-polyQ # 688A bakire F1 döl; tubP&gt; GAL80 erkek. Göz ommatidia ortasında pigment eksikliği # 688A hattı FLP ifade temsil eder. Bu alanda Gal4 UAS-polyQ sürücü sağlayan GMR-Gal4 Gal80 bastırma rahatladım. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Şekil 7"/> Şekil 7. Içinde ya da dışında fotoreseptörlerde Gal4 kesiştiği Gal80 saygısız FINGR yöntemin uygulama. A. küvet P&gt;&gt; Gal80 flip-sistem FLP-bağımlı bir şekilde ifade GAL4 kısıtlayan durdurmak . GMR-Gal4, UAS-polyQ tub P&gt; durdurmak&gt; GAL80 sinekler, fotoreseptör hücrelerinin dejenere ve pigmentini kaybetmiş olan (sol sinek). EyFLP tanıtımı takiben, Gal80 sırayla ifade polyQ kapanır ve normal gözlerde sinek üreten (sağ sinek), GMR-Gal4, tam baskı, fotoreseptör hücrelerinin ifade edilir. B. küvet P&gt; Gal80&gt; Kapak -out sistemi, küvet gibi ters moda çalışır P&gt; ​​durdurmak&gt; Gal80 flip-sistem . Küvet P&gt; Gal80&gt; yapısal GAL4 bastıran ve polyQ ifadesi (normal göz ile, sinek sol) bastırır. Gal80 eyFLP tanıtımı takiben, GMR-Gal4 bastırma giderici ve ifade polyQ dönüm fotoreseptör hücrelerinin çevrilmiş. Bu dejenere ve depigmente göz (sağ sinek) sinekler yol açar.

<ol>
	<li>Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mosaic+approach+for+neural+circuit+mapping+in+Drosophila.">A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+genes+are+required+for+neural+stem+cell+survival+in+postembryonic+neurogenesis+of+Drosophila.">Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila.</a> Development. 134, 1091-1099 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. , 34-341 (2002).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302, 1765-1768 (2003).</li><li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+tissue+specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4.">A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[Switch],+a+system+for+spatial+and+temporal+control+of+gene+expression+in+Drosophila+melanogaster.">P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li></ol>

Gal4/UAS sistemi çeşitli biyolojik çalışmalar için Drosophilists (Duffy, 2002 Marka &amp; Perrimon, 1993) tarafından kullanılan yaygın ve başarılı olmuştur. Bugüne kadar, sinek toplum organizatörü odaklı ve arttırıcı-trap Gal4 hatları binlerce üretti. FINGR yöntemin önemli bir gücü mümkün Drosophila çalışmaları Gal4 gücünü önemli ölçüde genişletmek için, Gal4/UAS sistem ile uyumlu olduğunu. FINGR yöntemin önemli bir uygulama Gal4/Gal80 kesiştiği yoluyla davranışın altında yatan ince ayar sinir devreleri. Bu davranışlar içerebilir, ancak öğrenme ve hafıza, kur, uyku, ve sirkadiyen ritim, bunlarla sınırlı değildir. Ayrıca, Alzheimer gibi insan nörodejeneratif hastalıklar, Amyotrofik lateral skleroz (ALS), Parkinson hastalığı modelleme nörodejenerasyon eğilimli olan kritik nöronların haritaya FINGR yöntemi kullanılabilir. Benzer şekilde, aracılık kokain, alkol ve diğer madde bağımlılığı için çok önemli nöronların veya nöral devreleri odakları FINGR yöntemi kullanılarak eşleştirilmiş olabilir. FINGR yöntemi ile sinir devreleri ve davranışları zamansal kontrol kazanmak için olabilir; koşullu Gal4s (Roman ve ark, 2001 Osterwalder ve ark, 2001) dikkat edilmelidir. Gal80 dönüştürme araçları Modifikasyonu ısıya duyarlı Gal80 (Gal80 ts, McGuire ve ark, 2003) kullanarak üretebilir küvet durdurmak P&gt;&gt; Gal80 ts ya da küvet P&gt; Gal80 ts&gt; devre manipülasyon daha zamansal esneklikler ekleyerek. Sinir sisteminin ötesinde, FINGR yöntemi, kanat veya bacak olup olmadığını hücre altkümelerini Gal4 ifade kısıtlayan için de geçerlidir. ET-FLPx2 hatları MARCM (Lee ve Luo, 1999) de dahil olmak üzere FRT / FLP tabanlı klonal analiz (Xu ve Rubin, 1993), ilgilenen tüm Drosophila biyologlar için değerli bir kaynak olacaktır. Aynı zamanda bazı ET-FLPx2 hatları, tekrarlanabilir klonlar üretmek için ve tekrarlanan morfolojik ve davranışsal analizleri için heatshock FLP yerine bekleniyor. Arttırıcı-trap Gal4 hatları gibi, en ET-FLPx2 hatları faiz hücreler özellikle ifade edilmesi olası değildir. Çoğu hatları ilgi hücreler VE yanı sıra diğer hücreleri veya dokuları FLP ifade edecektir. Ancak, hem de Gal4 ve ET-FLPx2 &#39;doku özgüllüğü eksikliği sürece kendi örtüşen bölge belirli bir deney için arzu edilir FINGR yöntemi için önemli bir endişe olmaz. FINGR iki &#39;geniş&#39; sistemleri rafine bir birine çevirmek için tasarlanmıştır. Bu protokollerin gösterilen yöntemler oldukça standart ve tekrarlanabilir olmalıdır. Kişinin dikkatini gerektiren önemli bir uyarıcı adımları fiksatif seçimi ve kullanımı. GFP sinyal söndürmeye çünkü PFA daha başka Fiksatifler kaçınılmalıdır. Ayrıca PFA FLP ifade GFP tarafından güvenilir olmaz olasılığını önlemek için fiksasyon diseksiyon çanak gerektiğini kaydetti var.

mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns

Gal4 / UAS ikili yöntemi Drosophila gen ve nöral devreleri manipülasyon için güçlü. En nörobiyolojik çalışmalar için, ancak, Gal4 ifade nadiren davranışsal okuma ile devre arasında kesin bir ilişki için yetecek kadar doku-spesifik. Bu büyük bir engel aşmak için, son zamanlarda ilgi doku daha kısıtlayıcı bir Gal4 ifade elde etmek için FINGR yöntem geliştirdi. 2) FLP / FRT-aracılı Gal80 dönüştürme araçları kümesi; geleneksel Gal4/UAS sistemi 1) ve 3) arttırıcı-trap FLP (ET-FLP): FINGR yöntemi üç bileşeni vardır. Gal4 ilgi primer nöral devreleri tanımlamak için kullanılır. Gal4 Sebze UAS-efektör UAS-MJD78Q veya UAS-Shi ts gibi, sinek davranış değişiklikleri ile kendini gösteren nöronal aktivitenin, düzenler. UAS-GFP, belirli bir davranış katılan nöral devre gibi bir ek ile UAS-muhabiri aynı zamanda morfolojik analizi için eşlenebilir. Küvet P&gt; Gal80&gt; (&#39;çevirmek&#39;) ve küvet P&gt;&gt; Gal80 (&#39;çevirmek&#39;) durdurmak: Gal4 hatları için geniş bir ifade ile, Gal4 ifade birbirini tamamlayan iki Gal80-dönüştürme araçları ile sınırlı olabilir Son olarak, doku-spesifik ET-FLP yardımıyla araştırmacılar, sırasıyla, Gal80 açmak ya da kapatabilirsiniz. Kapak modu, Gal80 Gal4 ve ET-FLP kesiştiği yerde Gal4 ifade bastırmak. Flip-out modunda, Gal80 Gal4 ve FLP örtüşme hücrelerinde Gal4 baskı rahatlatmak olacaktır. Her iki yaklaşım Gal4 tanımlanmış devre hücrelerinin sayısını kısıtlama sağlar, ancak ters bir desen. FINGR yöntemi Gal4 sinek topluluk hatları ve geleneksel klonal analizi ve nöral devre haritalama için çok yönlü geniş bir koleksiyon ile uyumludur. Bu protokol, FLP ekspresyonu haritalama seçin ET-FLPx2 hatları ve fotoreseptör hücrelerinin FINGR yöntemin etkinliğini göstermektedir. FINGR yönteminin prensibi de Gal4/UAS, Gal80 ve FLP / FRT kullanıldığı diğer genetik model organizmalar için geçerli olmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS at JoVE.com

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Biz, doku-spesifik FLP Gal80 ifade kalıplarını belirlemek için izin bir Flippase indüklenen intersectional Gal80/Gal4 baskı (FINGR) yöntemi açıklanmaktadır. Her yerde Gal4 ve FLP örtüşme, Gal4 ifade açık (Gal80 yukarı ve aşağı döndürülebiliyor) veya kapalı (Gal80 içinde döndürülebiliyorlar,). FINGR yöntem klonal analizi ve nöral devre haritalama için çok yönlüdür.

Larvaların ve Yetişkin Enhancer-trap Flippase İfade Haritalama ve Uygulama Drosophila MSS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

mapping-application-enhancer-trap-flippase-expression-larval-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

16.4K Görüntüleme.  University of Oklahoma - Norman. Biz, doku-spesifik FLP Gal80 ifade kalıplarını belirlemek için izin bir Flippase indüklenen intersectional Gal80/Gal4 baskı (FINGR) yöntemi açıklanmaktadır. Her yerde Gal4 ve FLP örtüşme, Gal4 ifade açık (Gal80 yukarı ve aşağı döndürülebiliyor) veya kapalı (Gal80 içinde döndürülebiliyorlar,). FINGR yöntem klonal analizi ve nöral devre haritalama için çok yönlüdür.

Video: Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Nörobilim

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Yetişkin Koku Şok Öğrenme

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Yüksek alan fMRI kullanılarak Yetişkin kedilerde işitme korteksi Fonksiyonel Görüntüleme

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Yüksek-Kalite Dijital Video Edinme<em&gt; Drosophila</em&gt; Bir Yanal Perspektifinden Larva ve Yetişkin Davranışları

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Doğrusal Agaroz Kanallar kullanarak Okuyacak<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Tarama Davranış

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...