Bu çalışma, CPR, SCM ve EY018640 NIH hibe EY005102 tarafından finanse edildi

1. Japon balığı, fare ve tavşan için bozulmamış nöral retina hazırlıkları <ol><li> Sürekli ortam (arka plan) aydınlatma altında açıklanan olanlar da dahil olmak üzere aşağıdaki adımları, &quot;2) Cut-yükleme,&quot; gerçekleştirin. Bu protokolün amacı, prosedürleri (yani çok karanlık (yani &quot;scotopic&quot;) koşulları altında ≤ 0.0001 lux) gece görüş kızıl ötesi gözlük kullanarak sürekli karanlıkta olarak gerçekleştirilen açıklanan, ancak diğer yüksek yoğunluk seviyeleri sürekli ortam aydınlatma, unutmayın gap junction tracer kaplin ortam aydınlatma diğer seviyelerde etkisini belirlemek için yerine kullanılabilir. </li><li> Koyu ameliyat öncesi en az 1 saat süreyle deneysel hayvan (Japon balığı, fare ve tavşan) uyum. </li><li> Daha önce 7 açıklanan derinden tricaine methanesulfonate (MS222 balık deposu su tamponlu (sodyum bikarbonat içeren) 150 mg / L) koyarak goldfish uyutmak ve derin ketamin (100 mg olan farelerin uyutmak/ Kg, ip) ve rompun (10 mg / kg, ip). Derinden üretan ile tavşan uyutmak (yükleme dozu: 2,0 g / kg, ip) ve aynı zamanda yerel intraorbital anestezi (2% Xylocaine) kullanımı, daha önce 8 tarif. Hayvanların bakım ve kullanımını içeren tüm deneysel işlemleri federal kurallarına uygun olarak yapılmalı ve yerel üniversite hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından gözden geçirilmeli ve onaylanmalıdır. (Not: burada açıklanan deneyler, balıkların bakımı ve kullanımı ile ilgili tüm deneysel prosedürleri, fare ve tavşan NIH kılavuzunda uygun olarak yapıldı ve incelendi ve Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan) </li><li> Balık, fare ve tavşan için, aşağıdaki enükleasyon, her gözün ön kısmını kaldırın. Daha sonra, filtre kağıdı, gözün arka bölümünün altında böylece, gözün arka kısmının üstüne filtre kağıdı bir parçası yerleştirin ve filtre kağıdı ve göz ters. Daha sonra, ince kullanarakforseps yavaşça, nöral retina, filtre kağıdı bağlı, birbirlerine bağlıdırlar pigment epiteli / koroid / sklera, uzak soyma sağlam nöral retina gözün arka bölümünü teşrih. Bunu yaparken, ince yaylı makas kullanılarak optik sinir kesti. Nöral retina, fotoreseptör tarafı odaklı kadar, filtre kağıdı bağlı ve göz geri kalanından ayrılmış olmalıdır. </li></ol> 2. Cut-yükleme <ol><li> Ile sürekli ortam (arka plan) aydınlatma (örneğin, çok karanlık (yani &quot;scotopic&quot;) koşulları altında) altında 30 dakika için bir 6-iyi plaka (~ 5 ml / iyi) olarak ya da olmadan oksijenli Ringer Kullanıcı çözüm (Tablo 1) Batmak retina Bir test ilaç. Parafilm ile 6-iyi plaka mühürleme oksijenli içinde balık retina (5% CO 2 /% 95 O 2) 22 bikarbonat-tabanlı Zil ° C koruyun ve bir% 5 CO 36 ° C fare ve tavşan retina korumak 2 / 95% O <sub&gt; 2 inkübatör. Bir test ilaç kullanıldığı zaman, fiksasyon kadar sonraki tüm adımlar sırasında mevcut olmalıdır </li><li> Ringer çözeltisi ile kesme retinanın hemen önce neurobiotin (% 0.5), bir biotinlenmiş molekülü eriterek izleme çözümü (genellikle 100 mcL) hazırlayın. % 0.5 rodamin dekstran (yüksek (&gt; 10.000) MW) çözüm olabilir. Yüksek molekül ağırlığı nedeniyle, rodamin dekstran gap junction ve sadece etiket kesim tarafından zarar görmüş hücreleri geçemez. Şekil. 3, bu yaralandı çünkü gap junction aracılığıyla difüzyon tracer birikmiş bu neurobiotin biriken hücreler ayırt etmek için bir yoldur. </li><li> Neurobiotin çözüm bir cam veya plastik Petri kabı yerleştirin, aşırı Zil kaldırmak neurobiotin çözümü bir jilet (ya da başka bir keskin bıçak) daldırma ve retinaya bağlı olduğu filtre kağıdı, kağıt havlu üzerine dokununn retina ve filtre kağıdı ile radyal bir kesim olun. Ayırıcılar Tercih edilmesi durumunda, retina ile yapılan kesme, ancak filtre kağıdı olduğunu kullanılmalıdır olabilir. Kesilen retina yüzeyine dik odaklı olmalıdır. Neurobiotin çözüm jilet tekrar batırın ve retina ikinci kez kesmek. Retinanın başına 4 kesim (bkz. Şekil 1) Bu kadar tekrarlayın. Fare ve diğer küçük retina aracılığıyla jilet keser yaparken bir diseksiyon mikroskobu kullanın. </li><li> Şekil. 6 plaka (5 ml Ringer / kuyu) kullanarak ya da test ilaçsız 1, batığın taze Ringer ortamda tekrar retina,. Retina, yükleme ve difüzyon izin vermek için 15 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> 5 dakika, her taze Ringer orta ile veya test ilaçsız üç kez yıkayın. </li><li> % 4 paraformaldehid oda sıcaklığında 1 saat için 0.1 M fosfat tamponu (PBS, pH 7.4) ile retina sabitleyin. </li><li> 4 gecede 0,1 M PBS ile yıkayın ° C </li><li> Ertesi gün, tepki wi. 0.1M PBS streptavidin-Alexa 488 (son konsantrasyonu 10 mg / ml) +% 0.3 Triton X-100,% 2 ve 4 gecede tutmak ° C </li><li> 10 dakika her RT 0.1M PBS ile üç kez yıkayın </li><li> PBS, ince bir fırça kullanarak, retinaya sonra filtre kağıdı ayırmak ve bir slayt üzerine, retina, fotoreseptör-yüzü yukarı odaklı yerleştirin. </li><li> Yavaşça Vectashield montaj orta (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ile monte edin. </li><li> Ölçüde, farklı deneysel koşullar (aydınlatma koşulları örneğin test ilaçlar) etkilerini karşılaştırmak böylece, deneysel her durum için aynı büyütme, çözünürlük ve ayarları konfokal mikroskobu (örneğin Zeiss 510 META) bir lazer tarama ile fotoğraf çekmek gap junction tracer kavrama (Şekil 2A-C ve Şekil 4A-C). Etiketli tüm hücreleri tek bir görüntü içeriyor olsa da, ilgi alanı z-yığını toplamak ve tek bir sözlük tavsiyegörüntü. </li></ol> 3. ImageJ kullanarak tracer kaplin Kantitasyonu <ol><li> LSM görüntü tarayıcısı, görüntüyü açmak, İHRACAT tıklayın ve dosya sıkıştırıldığında sonuçlanır TIF-16 bit olarak resmi kaydedin. Ölçek çubuğu bu TIF resim dahil edilmelidir. </li><li> NIH ImageJ yazılımı kullanarak, tüm montaj retina düşük büyütmeli görüntü Alexa-488-etiketli neurobiotin floresan yoğunluğu ölçmek. ImageJ yazılımını kullanarak, TIF dosyası açın ve ölçek çubuğuna karşılık düz bir çizgi çizin. ANALİZ SCALE SET ve bilinen bir mesafe ve uzunluk birimi girin, sonra Tamam&#39;ı tıklatın. Şimdi ölçüm sonuçları bu milimetre olarak kalibre üniteleri, sunulabilir. </li><li> Dikdörtgen seçim aracını kullanarak ilgi alanı seçin. Floresan tepe seçim sol sınırında yerleştirilmelidir. Sağ sınırına yakın bir floresan sinyal olmadığından emin olun. Aksi takdirde, aktif (RESİM, sonra ROTATE) döndürün. </li><li> TıklayınANALİZ ve PROFİLİ ARSA. , Soldan sağa doğru bir üstel bozulma ile bir eğri göreceksiniz. </li><li> Pop-up penceresi KOPYA tıklayın ve EXCEL yapıştırın. Şimdi mesafenin bir fonksiyonu olarak kesme kesme (sol sütun) ve floresan (sağ sütun) mesafe gösteren iki sütun bakın. </li><li> Maksimum floresans değeri göreli floresan yoğunluğu elde etmek için her çiğ floresan değeri bölün. </li><li> Sonra kesme (X) ve (Y) göreli floresan mesafe karşılık gelen ve Kopyala iki sütun Kökeni yazılım içine yapıştırın. </li><li> Üstel bozulma şeklinde # 1 fonksiyonu (Şekil 2D ve Şekil 4D), Fit: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) Burada Y göreli floresan, Y o eşiğe, Y max maksimum bağıl floresan, λ space (uzunluk) sabit ve x kesim mesafedir. </li><li> T-testi veya ANOVA (Şekil 2E ve Şekil. 4E) kullanarak farklı deneysel koşullar altında uzay sabiti (λ) değerleri karşılaştırın. Not nicelikleme alternatif teknikler, başkaları 13,14 tarafından tarif edilmiştir . </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 2 ve 3 (balık) ve Şekil 4 (tavşan) yükleme kesim tarafından belirlenen kaplin fotoreseptör hücre tracer Temsilcisi örnekler sunulmuştur. Konfokal görüntüler kesim mesafe bir fonksiyonu olarak çizilen ve yukarıdaki No 3.8 &#39;de gösterildiği üstel fonksiyonu ile donatılmış karşılaştırma (Şekil 2A-C ve Şekil 4A-C) ve floresan yoğunluğu için aynı ayarları kullanarak alındı (Şekil 2D ve Şekil 4D). Uzay her bir durum için sabit değerlergap junction tracer kaplin ölçüde kesilmiş yükleme tekniği kullanılarak sayısal olabileceğini gösteren, 2E, 4E Rakamlarla gösterilmiştir. Buna ek olarak, yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar. Gap junction tracer kaplin ölçüde nicel bir araç olarak yükleme kesim tekniği kullanın floresans şiddeti her durumda kesme mesafenin bir fonksiyonu olarak katlanarak azalır bulgu tarafından da doğrulanır (7,8 incelendiğinde de Şekil bakın. neurobiotin, diğer retina sitelerinden jilet kesim ve ile fotoreseptör girdiğinizi belirten 2D ve 4D) . Ayrıca, fotoreseptör hücre tracer kaplin niteliksel benzer gündüz / gece fark tek koniler tracer enjeksiyonları ile goldfish ve kesme yükleme 7 ile gözlenen fotoreseptör kaplin ölçüde ölçme nispeten doğru bir araç olarak kesilmiş yükleme çiziyor. Kesme-lretinanın elektriksel sinaps diğer türlerini araştırmak için ukleniyor tekniği de kullanılabilir. Örneğin, Şekil 5, A-tipi (Şekil 5A) ve B tipi (Şekil 5B) yatay hücreler tracer kaplin homolog sergileyen bu tavşan göstermektedir aşağıdaki cut-yükleme ve koyu adapte koşullar altında neurobiotin yayılması . <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşik </td><td> Balık </td><td> Fare </td><td> Tavşan </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 3,1 </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> - </td><td> 0,1 </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Zil çözümleri goldfish, fare ve tavşan retina Kompozisyon. Konsantrasyonlarda mM sunulmaktadır. Zil çözümleri kabarmış ve% 5 CO 2 /% 95 O 2 ile 22 ° C (balık) veya 36 ° C (memeliler) korunur. &quot;-&quot;: Bu türler için Zil dahil değildir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" /> Şekil 1: cut-yükleme prosedürü gösteren akış şeması. İzolasyon o sonraf sağlam nöral retina, birkaç radyal ilk kez% 0.5 &#39;lik neurobiotin çözeltisi batırılmış bir bıçak keser tarafından yapılmıştır. Retina tracer yükleme ve difüzyon inkübe ve sonra 0.1M fosfat tamponu (PB)% 4 paraformaldehid (PFA) ile tespit önce yıkandı. Tracer kaplin Alexa-488 streptavidin-konjuge kullanılarak incelenmiştir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" /> Şekil 2 goldfish fotoreseptör tracer kaplin gün-gece fark yükleme kesme tekniği ile ortaya çıkar. Fotoreseptör hücre gap junction neurobiotin tracer kaplin, kontrolü koşullar altında (A) gün içinde spiperone (10 mcM), seçici bir dopamin D 2 reseptör antagonisti (C) uygulaması sonrasında gece (B) ve gün içinde yoğun olduğunu, ancak . D) Normalize kesim mesafe (AC oklarla gösterilen) bir fonksiyonu olarak göreceli floresan yoğunluğu. E) Uzay sabit valD ve diğer deneyler (n = 4) veri elde ues. *** P &lt;0.001. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" /> Şekil 3 neurobiotin ve rodamin dekstran hem de bir çözüm ile kesme yükleme ertesi gece karanlık bir adapte goldfish retina fotoreseptör hücre tabakası floresans gösteren bir temsili örnek. Yüksek molekül ağırlıklı (&gt; 10.000 MW), sadece kesme yakın etiketli hücreleri nedeniyle açık gap junction kanalları aracılığıyla diffüz değildir rodamin dekstran (kırmızı ile gösterilen). Buna karşılık, gap junction dağılmıştır neurobiotin (yeşil renkte) ve fotoreseptör hücrelerin kesim uzak görülebilir. Kesim yeri her panelinde ok ile belirtilir. Ölçek çubuğu: 200 mm. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" /> Şekil 4 gün-gece farklı.tavşan retinada kaplin fotoreseptör tracer varlığı, kesme yükleme tekniği ile ortaya çıkar. Fotoreseptör hücre gap junction neurobiotin tracer kaplin, kontrolü koşullar altında (A) gün içinde spiperone (10 mcM) (C) uygulaması sonrasında gece (B) ve gün içinde yoğun olduğunu, ancak. AC, dik kesme yakın tavşan fotoreseptörlerin 3D rekonstrüksiyon kez gösterilmiştir. D) Normalize keser mesafenin bir fonksiyonu olarak göreceli floresan yoğunluğu. E) Uzay sabit değerler, D ve diğer deneyler (n = 3) verilerden elde edilmiştir. *** P &lt;0.001. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" /> Şekil 5 Kes yükleme koyu adapte tavşan yatay hücreler tracer birleştiğinde ortaya koymaktadır. A-tipi (A) ve B tipi (B) yatay koyu adapte tavşan retina hücreleri homolog neurobiotin tracer kaplin sergilenmektedir.

<ol>
	<li>Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+and+neuronal+synchronization+in+the+mammalian+brain.">Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain.</a> Neuron. 41, 495-511 (2004).</li><li>Connors, B. W., Long, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+synapses+in+the+mammalian+brain.">Electrical synapses in the mammalian brain.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).</li><li>Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+diverse+types+of+retinal+neurons+show+tracer+coupling+when+injected+with+biocytin+or+Neurobiotin.">Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin.</a> Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).</li><li>Bloomfield, S. A., V&#246;lgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functional+roles+and+regulation+of+neuronal+gap+junctions+in+the+retina.">The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).</li><li>Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+coupling+between+retinal+horizontal+cells+by+retinoic+acid+and+endogenous+dopamine.">Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).</li><li>Xin, D., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nitric+oxide+on+horizontal+cells+in+the+rabbit+retina.">Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).</li><li>Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+in+the+retina+controls+rod-cone+coupling.">The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling.</a> Neuron. 59, 790-801 (2008).</li><li>Ribelayga, C., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+circadian+clock-controlled+neural+pathway+in+the+rabbit+retina.">Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina.</a> PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).</li><li>Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+A+mediates+regulation+of+gap+junctions+containing+connexin35+through+a+complex+pathway.">Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway.</a> Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).</li><li>Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gap+junction+coupling+through+the+neuronal+connexin+Cx35+by+nitric+oxide+and+cGMP.">Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP.</a> Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).</li><li>Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+modulates+intercellular+communication+among+cultured+chick+astrocytes.">Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes.</a> Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).</li><li>Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimar&#227;es, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+mediate+bystander+cell+death+in+developing+retina.">Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina.</a> J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).</li><li>Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina.">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina.">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina.">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada açıklanan kesme yükleme yöntemi, gece ve gündüz farklı zamanlarda, farklı aydınlatma koşulları altında ve retinal nöronlar arasındaki boşluk kavşak tracer kaplin boyutunu belirlemek için kullanışlı ve basit bir tekniktir. Bu tekniğin avantajları arasında gece ve gündüz çeşitli aydınlatma koşulları altında sağlam retina dokusunda nöronlar arasındaki boşluğu kavşak tracer kaplin derecesini ölçmek için ve küçük çaplı somata birleştiğinde nöronlar için bunu yapmak için yeteneği dahil. Iki genel kategoriye ayrılır sağlam doku sonbaharda gap junction çalışma tekniği Sınırlamalar. İlk olarak, izli açık gap junction aracılığıyla difüzyon a) küçük çaplı ya da açık kanalları ve b) birleştiğinde hücresel bölmelerinin göreceli hacimleri 1,14,15 ile ilişkili ücret nedeniyle gözlemlemek için nispeten zor olabilir . Yani, küçük bir hücre birleştiğinde hücreleri daha büyük bir hücre ya da grup, comp tracer difüzyondaha büyük bir hücre daha küçük bir hücreye tracer difüzyon ared tracer seyreltme nedeniyle tespit etmek daha zor olabilir. İkincisi, bazı fizyolojik koşullar altında, sağlam doku gap junction tracer difüzyon yoluyla ölçüde doğru nispeten büyük tracer geçirgenliği ile karşılaştırıldığında, küçük bir elektrik akımı taşıyan iyonları iletkenliği farklılıklar nedeniyle boşluk junctional iletkenlik gücünü yansıtmıyor olabilir molekülleri 1,14,15. Tracer kaplin kanıt, genel olarak, güçlü bir şekilde işleyen, açık gap junction kanalları varlığını önerir, ancak bazı fizyolojik koşullar altında, tracer difüzyon elektrofizyolojik kayıtlar işleyişi, açık gap junction varlığını düşündürmektedir bile oluşmaz ya da gözlenebilir. Bu kesim yükleme tekniği, aynı zamanda merkezi sinir sistemi diğer bölgelerden gelen sağlam doku nöron arasındaki boşluğu kavşak tracer kaplin ölçüde araştırmak için kullanılabilir olması olası görünüyortem.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Tricaine metan sülfonat (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 mg / L, tamponlu balık tank su </td></tr><tr><td> Üretan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 g / kgloading doz </td></tr><tr><td> Çift Tüp Gece Görüş Gözlüğü </td><td> Gece Optik ABD </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre Kağıdı, Sınıf No 4 </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Güzel Forseps, 11 cm uzunluğunda Dumont No: 5, biologie </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Güzel Makas, yaylı, 8 mm bıçak, düz </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Vektör </td><td> SP-1120 </td><td> % 0.5 </td></tr><tr><td> Streptavidin-konjuge Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> % 2 </td></tr><tr><td> Dekstran rodamin (yüksek (&gt; 10.000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> % 0.5 </td></tr><tr><td> Vectashield montaj orta </td><td> Vektör </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 META Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ Yazılım </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8.0 </td><td> OriginLab Corp. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons

Kimyasal sinaptik iletim ek olarak, gap junction bağlı nöronların elektrik sinaptik iletim yoluyla hızlı bir şekilde iletişim kurabilir. Giderek artan kanıtlar gap junction sadece elektrik akım ve birbirine bağlı veya birleştiğinde hücreleri arasındaki senkron faaliyet izni olduğunu gösterir, ancak birleştiğinde hücreleri arasındaki gücü veya elektrik iletişimin etkinliğini büyük ölçüde 1,2 modüle olabilir. Buna ek olarak, birçok gap junction kanalları büyük iç çapı (~ 1.2 nm), gap junction, metabolik ve kimyasal iletişim aracılık edebilir, böylece, hücre içi sinyal molekülleri ve birbirine bağlı hücreler arasındaki küçük metabolitleri difüzyon sadece elektrik akım izin verir, ancak . Nöron ve nörotransmitter ve diğer etkenlere göre modülasyon arasındaki junctional iletişim gücü birleştiğinde hücreleri aynı anda elektrikle kayıt ve t belirleyerek incelenecektir.iyontoforez tek hücre içine enjeksiyonu takiben GAP kavşak geçirgen tracer molekülleri, difüzyon ölçüde değil membran geçirgen. Ancak, bu işlemler, bozulmamış sinir dokusunda küçük somata nöronlar üzerindeki gerçekleştirmek için son derece zor olabilir. Her beş retina nöron tipi elektrikle gap junction 3,4 ile bağlı olduğundan, elektrik sinapslar ve elektrik iletişim modülasyon çok sayıda çalışmalar, gözdeki yapılmıştır . Artan kanıtlar, retina ışık stimülasyon ve değişiklikler sirkadiyen (24 saatlik) saat 3-8 kaplin boşluğu kavşak düzenlenmesi göstermiştir . Örneğin, yakın zamanda yapılan çalışmalar göstermiştir retina sirkadiyen saat, gün boyunca, artan dopamin D2 reseptör aktivasyonu ile D2 reseptör aktivasyonu azaltarak çubuk ve koni fotoreseptör hücreleri arasındaki kavşak kaplin azalır ve dramatik bir gece çubuk koni kaplin artar <sup&gt; 7,8. Ancak, sadece sağlam nöral retina dokusunun küçük somata nöronlar üzerinde gerçekleştirmek için bu çalışmalar son derece zor, ama yeterince boşluk kavşak ışık bağlı değişiklikleri önlemek için tek bir retina nöronlarının elektrofizyolojik çalışma sırasında aydınlatma koşullarını kontrol etmek zor olabilir iletkenlik. Burada, gece ve gündüz farklı zamanlarda, farklı aydınlatma koşulları altında ve retinal nöronlar arasındaki boşluk kavşak tracer kaplin ölçüde belirleyen basit bir yöntem mevcut. Bu kesim yükleme tekniği açık gap junction kanalları aracılığıyla boya yükleme ve difüzyon dayalı kazıma yükleme değişiklik, 9-12. Pençe yükleme kültür hücreleri sağlam retina gibi kalın dilim iyi çalışır, değil. Yükleme kesim tekniği bozulmadan balık ve memeli retina 7, 8,13 fotoreseptör kaplin çalışma olmuştur arasındaki kaplin incelemek için kullanılabilirburada açıklandığı gibi diğer retinal nöronların.

Watch this Scientific Journal Video about Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons at JoVE.com

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Retinal nöronlar arasındaki boşluk kavşak tracer kaplin kapsamını belirlemek için kolay ve kullanışlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu teknik, bir gece ve gündüz farklı zamanlarda farklı aydınlatma koşulları altında ve sağlam retina nöronlar arasındaki elektriksel sinaps işlevini incelemek için olanak sağlar.

Cut-yükleme: Retina Nöronlar arasında Gap Junction Tracer Kaplin Kapsamı incelenmesi için yararlı bir araçtır

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K Görüntüleme.  Ohio State University College of Medicine. Retinal nöronlar arasındaki boşluk kavşak tracer kaplin kapsamını belirlemek için kolay ve kullanışlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu teknik, bir gece ve gündüz farklı zamanlarda farklı aydınlatma koşulları altında ve sağlam retina nöronlar arasındaki elektriksel sinaps işlevini incelemek için olanak sağlar.

Video: Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Nörobilim

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems. The ability to produce highly specific antibodies to target proteins has allowed for very precise biological questions to be addressed. Importantly, antibodies have been implicated in the pathogenesis of a number of human diseases including systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), paraneoplastic syndromes, multiple sclerosis (MS) and human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) 1-9. How antibodies cause disease is an area of ongoing investigation, and data suggests that interactions between antibodies and various intracellular molecules results in inflammation, altered cellular messaging, and apoptosis 10. It has been shown that patients with MS and HAM/TSP produce autoantibodies to the intracellular RNA binding protein heterogeneous ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recent data indicate that antibodies to both intra-neuronal and surface antigens are pathogenic 3, 5-9, 11. Thus, a procedure that allows for the study of intracellular antibody:protein interactions would lend great insight into disease pathogenesis.
Genes are commonly transfected into primary cells and cell lines in culture, however transfection of antibodies into cells has been hindered by alteration of antibody structure or poor transfection efficiency 12. Other methods of transfection include antibody transfection based on cationic liposomes (consisting of DOTAP/DOPE) and polyethylenimines (PEI); both of which resulted in a ten-fold decrease in antibody transfection compared to controls 12. The method performed in our study is similar to cationic lipid-mediated methods and uses a lipid-based mechanism to form non-covalent complexes with the antibodies through electrostatic and hydrophobic interactions 13. We utilized Ab-DeliverIN reagent, which is a lipid formulation capable of capturing antibodies through non-covalent electrostatic and hydrophobic interactions and delivering them inside cells. Thus chemical and genetic couplings are not necessary for delivery of functional antibodies into living cells. This method has enabled us to perform various antibody tracing and protein localization experiments, as well as the analyses of the molecular consequences of intracellular antibody:protein interactions 9.
In this protocol, we will show how to transfect antibodies into neurons rapidly, reproducibly and with a high degree of transfection efficiency. As an example, we will use anti-hnRNP A1 and anti-IgG antibodies. For easy quantification of transfection efficiency we used anti-hnRNP A1 antibodies labelled with Atto-550-NHS and FITC-labeled IgG. Atto550 NHS is a new label with high molecular absorbtion and quantum yield. Excitation source and fluorescent filters for Atto550 are similar to Cy3 (Ex. 556 Em. 578). In addition, Atto550 has high photostability. FITC-labeled IgG were used as a control to show that this method is versatile and not dye dependent. This approach and the data that is generated will assist in understanding of the role that antibodies to intracellular target antigens might play in the pathogenesis of human diseases.

A rapid approach to investigate interactions and effects on molecular mechanisms related to the presence of antibodies in an intracellular environment is described. The method involves transfection of antibodies into live cells using a non-covalent complex formation based on a lipid formulation. The technique is adaptable to immortalized cell lines and primary cells.

Hastalık Patogenez Eğitim için Bir Araç Olarak Nöronlar içine Antikor Transfeksiyon

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sıralı Nöromusküler Kavşağı&#39;nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

Rat Bölgesel Beyin Enerji Yüzeyleri Alımına Kantitatif Tedbir için A Çift Tracer PET-MR Protokolü

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

A Standardized Pipeline for Examining Human Cerebellar Grey Matter Morphometry using Structural Magnetic Resonance Imaging

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond its historical association with motor control. Structural and functional neuroimaging studies have further refined understanding of the functional neuroanatomy of the cerebellum beyond its anatomical divisions, highlighting the need for the examination of individual cerebellar subunits in healthy variability and neurological diseases. This paper presents a standardized pipeline for examining cerebellum grey matter morphometry that combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation (Automatic Cerebellum Anatomical Parcellation using U-Net Locally Constrained Optimization; ACAPULCO) and voxel-based registration of the cerebellum (Spatially Unbiased Infra-tentorial Template; SUIT) for volumetric quantification. 
The pipeline has broad applicability to a range of neurological diseases and is fully automated, with manual intervention only required for quality control of the outputs. The pipeline is freely available, with substantial accompanying documentation, and can be run on Mac, Windows, and Linux operating systems. The pipeline is applied in a cohort of individuals with Friedreich ataxia (FRDA), and representative results, as well as recommendations on group-level inferential statistical analyses, are provided. This pipeline could facilitate reliability and reproducibility across the field, ultimately providing a powerful methodological approach for characterizing and tracking cerebellar structural changes in neurological diseases.

A standardized pipeline is presented for examining cerebellum grey matter morphometry. The pipeline combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation and voxel-based registration of the cerebellum for volumetric quantification.

Yapısal Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak İnsan Serebellar Gri Madde Morfometrisini İncelemek için Standartlaştırılmış Bir Boru Hattı

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond ...