The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.

NOT: Tüm hayvan prosedürleri onaylanmış ve Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Tel Aviv Üniversitesi Sackler Okulu (IACUC) standartlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Klima Medya Hazırlık <ol><li> Bir hacim içinde 10 cm&#39;lik bir kültür plakasına Tohum, 2 x 10 6 U 87 mg hücreler 8 mi Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin / nistatin çözeltisi ile desteklenmiş (DMEM). </li><li> 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri C °; 48 saat tam konfluense elde edilinceye kadar% 5 CO 2. </li><li> 10 ml&#39;lik bir şırınga kullanarak, 15 ml&#39;lik bir tüp içine 0.45 um&#39;lik bir filtre ile plaka tüm orta çekilme ve filtre edin. </li><li> Hücreler plakayı yıkayarak olmadan, 1 ml tripsin çözeltisi (% 0.25) ekleyin ve inkübe edilir. </li><li> Tüm hücreler müstakil zaman,% 10 FBS ile takviye edilmiş en az 5 ml DMEM kullanılarak tripsin inaktive etmek üzere ve bir hücre sayımı preform. </li><li<html> &gt; Bir hemositometre ya da diğer hücre-sayım aygıtı kullanılarak hücrelerin sayısını ve kullanılan sayım yöntemine göre hücre sayısını hesaplayın. NOT: Bu CM konsantrasyonunu normale için daha sonra kullanılacaktır. </li><li> Cam yuvarlak dipli bir şişeye CM aktarın ve yüksek vakum döner buharlaştırıcı ile konsantre edilmiştir. İstenirse sürecini hızlandırmak için, 37 ° C banyo sıcaklığı artar. CM macun-benzeri bir yapı elde kadar devam edin. </li><li> 400 ul tuzlu su içinde her kültür plaka CM süspanse. Birden fazla plaka kullanılırken, eşdeğer hacimde kullanılır. Örneğin, 2 kültür levhaları, 800 ul kullanın. 4 fare için her levha kullanın. </li><li> Farklı hücre hatları veya tedavileri karşılaştırmak amacıyla, adım 1.6 alınan hücre oranına göre ses seviyesini ayarlayın. Bir tabak 1.5x daha fazla hücre içeriyorsa, örneğin, önceden var olan 400 ul tuz çözeltisi 200 ul ilave edin. Bu düzeltilmiş CM olacak </li></ol>Fareler içine başlığı &quot;&gt; 2. ECM-mimik Jel Tak Aşılama <ol><li> Farelere ECM-mimik jel aşılayarak önce aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: <ol><li> Büyüme faktörleri (buz üzerinde 4 ° C de, deney bir gün önce, bir gece boyunca çözülme) fenol içermeyen ECM mimik jel azaltmıştır. </li><li> Elektrikli tıraş makinesi. </li><li> Fareler uyutmak için ketamin ve ksilazin. </li><li> Buz soğuk 1.000 ul steril ipuçları. </li><li> Buz soğuk 1 ml şırınga ve 27 G iğne. </li></ol></li><li> Her fare için CM arındırılmış 80 ul içeren 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüp hazırlayın ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Her bir tüpe, 600 ul buz gibi soğuk büyüme faktörlerinin buz üzerinde 4 ° C&#39;de gece boyunca çözülmüş azaltılmış fenol içermeyen ECM mimik jel ekleyin. ECM mimik Jel 4 ° C&#39;de sıvı olan ve vücut sıcaklığında katılaşan; katılaşan ECM-mimik jel önlemek için, buz gibi soğuk 1.000 ul ipuçlarını kullanın. Dikkatle kabarcıklar oluşturan olmadan tüpleri karıştırın ve buz üzerinde tutmak. </li><li> 6 haftalık B uyutmakKetamin (100 mg / kg) ve ksilazin (12 mg / kg) ile ALB / c farelerinde indüklenmiştir. Önce deney başlamadan kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, yani göre uygun anestezi onaylayın. Artık bir firma ayak tutam yanıt zaman hayvanlar anestezi onların doğru uçağı ulaştı. </li><li> Farelerin karın bölgesi Tıraş ve cerrahi fırçalayın / alkol kullanarak dezenfekte. </li><li> Eppendorf tüp subkutan içeriğini enjekte etmek soğuk 1 ml şırınga ve bir 27 G iğne kullanın. Kabarcık oluşmasmı önlemek üzere çok yavaş enjeksiyon yapın. Tüm ses uygulanır sonra katılaşma oluşuncaya kadar, birkaç dakika için iğne çıkarma yok. </li></ol> Ultrason kullanma 3. Değerlendirme ECM-mimik Jel Tak damarlanma NOT: protokol bu bölümü ultrason görüntüleme sistemi, veya yetkili teknisyen yardımı yapan önceki bilgi gerektirir. <ol><li> Başlamadan önce, f varmalzemeleri ve aletleri hazır ollowing: <ol><li> Elektrikli tıraş makinesi. </li><li> Tüy Dökücü Krem. </li><li> Fareler uyutmak için ketamin ve ksilazin. </li><li> Microbubbles olmayan hedefli. </li><li> Aktivasyon cihazı. </li><li> 55 MHz 708 prob ve 3D edinme mikromanipülatör dahil olmak üzere ABD görüntüleme sistemi. </li></ol></li><li> Fişler aşılamadan sonrası üç hafta içinde vaskülarizasyonunu ölçün: Not: A-87 MG-tabanlı bir hayvan modelinde, 3 hafta görüntüleme için ideal bir zaman noktasını temsil bulunmuştur. Farklı ayarlar altında, fişlerin aşılamayı takip eden birkaç gün başlayan vaskülarizasyon kinetik kalibre. <ol><li> Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (ug / kg 12 mg) kullanılarak fareler anestezi. Önce deney başlamadan kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, yani göre uygun anestezi onaylayın. Artık bir firma ayak tutam yanıt zaman hayvanlar anestezi onların doğru uçağı ulaştı. </li><li> Tıraşfarelerin karın bölgesi ve tüy dökücü krem ​​ile tedavi. </li><li> Mikro-manipülatör sahnede supinely fareler Fix. </li><li> 1 ml şırınga içeren tuzlu su ve 30 G iğne kullanarak, kuyruk ven içine iğne yerleştirin sıkıca iğne düzeltmek ve şırınga gevşetin. </li><li> Kontrast 3D modu görüntü elde etme oturumu için ayarlama: <ol><li> Basın &quot;3D&quot; 3D Motor sahne başlatmak ve istenen tarama alanının ortasında dönüştürücüyü yerleştirmek için. </li><li> Basın &quot;3D&quot; ve giriş tarama mesafe ve adım boyutu, daha sonra &quot;Scan&quot; tuşuna basın. </li><li> Tüm fiş görüntülenen 3D görüntü verileri tarandı emin olun. Değilse, tüm fiş tarama ve tekrar adım 3.5.2 görünür, böylece dönüştürücüyü ayarlayın. </li><li> Basın &quot;Kontrast&quot; ve zaman kazancı tazminat itin (TGC) Görüntüyü koyulaştırmak için sola kontrol eder. </li></ol></li><li> Desi bir şişe bir mikser kullanılarak mikro-kabarcıkları etkinleştirme45 saniye için mikro-kabarcıkların aktivasyonu için gnated. </li><li> 1 ml 50 ul serum fizyolojik ile kabarcıkların 50 ul şırınga içinde karıştırın. </li><li> Aktive mikrokabarcıkların içeren bir şırınga ile tuzlu içeren gevşek şırınga değiştirin. 3D edinimi motoru kullanarak, bir kararlı duruma ulaşması ve ardından fiş 3D kontrastlı sine döngü elde etmek baloncuklar için birkaç saniye bekleyin, farelerin kuyruk damar içine enjekte seyreltilmiş mikrokabarcıkları: <ol><li> Basın &quot;3D&quot; ve 3D kontrastlı görüntüler elde ve daha sonra görüntü verilerini kaydetmek için &quot;Cine deposu&quot; basın &quot;Scan&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Basın &quot;3D&quot; ve tıklayın mikrokabarcıkları imha etmek &quot;3D yok&quot;. </li><li> Basın &quot;3D&quot; Tekrar ve daha sonra, bir post-imha sine döngü elde &quot;Cine Mağaza&quot; basın &quot;Scan&quot; seçeneğini seçin. </li></ol></li><li> Görüntü çerçeveleri öncesi bindirme ve mikrokabarcıkların sonrası imha oluşturun: <ol><li> In &amp;# 8220; Referans Ayarları &quot;Referans oluştur&quot; Ekranın sol tarafındaki tıklayın &quot;. </li><li> Basın &quot;Çalışma Yönetimi&quot; kazanılmış öncesi imha sine döngü açmak için. </li><li> Daha sonra &quot;3D içine Load&quot; tıklayın, yeşil kontrast bindirme oluşturmak için &quot;Süreç Cine&quot; tıklayın. </li></ol></li><li> Fişler içinde kan hacmi için ortaya çıkan 3D görüntü ölçmek amacıyla ABD görüntüleme yazılımı kullanın: <ol><li> Basın &quot;Tarama / Freeze&quot; ve ardından &quot;Mod ayarları&quot; tuşuna basın. </li><li> &quot;Volume&quot; tıklayın ve &quot;Paralel&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Konturları bir dizi segmentlere hedef doku 3D birimi oluşturun. </li><li> Segmentasyonu tamamlamak için &quot;Finish&quot; tıklayınız. NOT: kontrast madde hacmi ekranın sol alt tarafında görüntülenir. </li></ol></li><li> Prosedürün sonunda, uzak bir sıcak, temiz, kuru, sessiz bir ortamda fareler yerleştirindiğer hayvanlar. Kemirgen 12-14 santim uzakta yerleştirilmiş bir piyasadan temin cerrahi ısıtma pedi ya da akkor lamba (50-75 watt) kullanarak sıcaklık sağlayın. Dik duruş korumak ve normal yürüme kadar sürekli fareler izleyin. </li></ol></li></ol> Fibered Konfokal endomikroskopi Kullanılması 4. Değerlendirme ECM-mimik Jel Tak damarları Morfoloji NOT: protokolün bu kısmı hemen ardından ABD görüntüleme yapılır ve lifli konfokal endomikroskopi görüntüleme sistemi, veya yetkili teknisyen yardımı yapan önceki bilgi gerektirir. <ol><li> Başlamadan önce, aşağıdaki malzemeler ve aletler hazır bulundurun: <ol><li> Forseps, makas ve emilebilir dikiş iplikleri gibi Cerrahi aletler. </li><li> FITC ile konjüge edilmiş dekstran (70 Kda). </li><li> Kalibrasyon çözeltiler (üç tüp, her biri hidrojen peroksit, su ya da floresan çözeltisi). </li><li> görüntüleme sistemi veÜreticiye göre, kan damarlarının görüntüleme için uygun prob. </li></ol></li><li> Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (ug / kg 12 mg) kullanılarak fareler anestezi. </li><li> , Kuyruk damarından, 10 mg / ml FITC-işaretli dekstran 200 ul iv uygulayın. </li><li> Cerrahi bodur / alkol kullanarak karın bölgesi dezenfekte ve fiş yaklaşık 1 cm küçük bir kesi uygulanır. </li><li> Sağlam fiş tutarken yavaşça tıkacın üstüne yerleştirilmesini endomikroskopi sonda yerleştirin. </li><li> Toplama: <ol><li> Prob fiş üzerinde ayarlandıktan sonra, basın ayak pedalını kullanarak &quot;lazer başlat&quot;. floresan ekranda gösterilir edilmelidir. </li><li> Ekranda &#39;Record&#39; tuşuna basarak veya ayak pedalı ile &#39;Seç&#39; tarafından (30 sn kadar) kısa film Edinme. </li><li> Filmler arasında, bir tüp içeren su ucu yerleştirerek prob yıkayın. </li><li> Bittiğinde, sonda kaldırmak ve bir pamuk uçlu ucu temizleyin. </li></ol></li><li> Ortalama A.Ş. analiz etmekSSEL çapı: <ol><li> Damar algılama modülü penceresini açmak için üst paneldeki &quot;mikrodamarlar algıla&quot; ikonuna tıklayın. </li><li> &quot;Tercihler&quot; tıklayın ve &quot;ilgi İstatistiğin&quot; ve &quot;Ekran&quot; modunda &quot;Ekran histogram barlarda&quot; in &quot;damar çapı ortalama&quot; işaretleyin. </li><li> Tıklayın Seçilen ölçümleri görüntülemek için &quot;Algılama&quot;. </li></ol></li><li> Kan damarlarının bitişik alanlarda floresan sinyal yoğunluğunu analiz için: <ol><li> Sol panelde &quot;daire yatırım getirisi oluştur&quot; üzerine tıklayın ve ilgi alanındaki bir daire oluşturun. </li><li> Bu bölgeye ilişkin değerlerini hesaplamak için &quot;ROI içinde Compute histogramı&quot; tıklayın. </li></ol></li></ol> Farelerin 5. Post-prosedürel Tedavi <ol><li> Her görüntüleme prosedürü sonunda, diğer hayvanlardan uzakta sıcak, temiz, kuru, sessiz bir ortamda fareler yerleştirin. Ticari-a kullanarak sıcaklık sağlayınullanılabilir cerrahi ısıtma yastığı veya akkor lamba (50-75 W), kemirgen uzak içinde 12-14 yerleştirilir. Dik duruş korumak ve normal yürüme kadar sürekli fareler izleyin. </li><li> Ek zaman noktalarında fişler &#39;damarlanma daha fazla analiz için, aşağıdaki kurtarma koşulları geçerlidir: <ol><li> Emilebilir sütürler kullanılarak küçük bir kesi sütür. </li><li> Deri altından gibi buprenorfin (1 mg / kg) olarak farenin ağrı kesiciler ve tek tek kafeslere geri döner. </li><li> Daha fazla analjezik tedavi gereklidir ve olup olmadığını belirlemek için tüm hayvanları gözlemlemek izlemek ve sıkıntı değerlendirmek için günlük yeniden değerlendirmek. </li></ol></li><li> Deneyin son noktada, sonra servikal dislokasyon yapılmıştır, ilk uygulama izofloran ile fare, euthanize. </li><li> Ek görüntüleme ilk görüntüleme adımları izleyerek haftalarda yapılacak ise, tüm işlemler mümkün olduğunca steril tutulmalıdır. Bir cerrahi cilt fırçalama yapılmalıdır, steril waTer ve steril pamuk ip uçları endomikroskopi probu temizlemek için kullanılmalıdır ve prob steril su kullanılarak her bir hayvan arasında dezenfekte edilmelidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth:+an+in+vivo+Matrigel+model.">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li><li>Passaniti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+quantitative+method+for+assessing+angiogenesis+and+antiangiogenic+agents+using+reconstituted+basement+membrane,+heparin,+and+fibroblast+growth+factor.">A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor.</a> Lab Invest. 67, 519-528 (1992).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49, 32-40 (2003).</li><li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice.">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).</li><li>Adini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+cytometry:+a+novel+method+for+quantifying+angiogenesis+in+vivo.">Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo.</a> J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).</li><li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy:+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs.">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).</li><li>Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubbles+in+medical+imaging:+current+applications+and+future+directions.">Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).</li><li>Kuliszewski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+endothelial+progenitor+cell+engraftment+using+contrast-enhanced+ultrasound+and+targeted+microbubbles.">Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles.</a> Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).</li><li>Stieger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+assessment+of+angiogenesis+in+a+matrigel+model+in+rats.">Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats.</a> Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).</li><li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent.">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li><li>Segal, E., Satchi-Fainaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymer+conjugates+as+anti-angiogenic+agents.">Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).</li><li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors.">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PLoS One. 7, 44395 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Tamamlayıcı görüntüleme yöntemleri birleştiren farklı anjiyogenez bileşenlerinin damar yoğunluk, fonksiyonellik ve morfolojisi hakkında bilgi iktisap izin verir. ECM-mimik jel fişler üzerinde yükleme CM fişi içine işe ve damar dışına olan endotel hücreleri gibi, diğer hücre popülasyonlarının ayrılan bir tümör mikro, üretir. Paralel, performans olarak, kontrastlı ABD görüntüleme ve lifli konfokal endomikroskopi görüntüleme mikrokabarcıkları, biz kanser h...

Matrigel fiş anjiyojenez tahlil, ilk önce Kibbey ve arkadaşları tarafından tarif edilmiştir. Bu peptid SIKVAV (Ser-lle-Lys-Val-Ala-Val) 1 ile anjiyojenez uyarılmasını elde etmek için kullanılmıştır 1992 yılında. Başka in vivo anjiyojenez deneylerinin aksine, fare korneal anjiyojenez veya tavuk koriallantoik zar deneylerinde olduğu gibi, bu deney 2 gerçekleştirmek için nispeten kolaydır. enjekte ECM mimik jel hücreleri, pro-anjiyojenik veya bir anti-anjiyojenik bileşikler ve / veya faktörler içerebilir. Bir anti-anjiyojenik bileşiğinin etkinliğini değerlendirerek, fiş normal vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) &#39;in bir karışımını ihtiva eder ve anti-anjiyojenik bir madde, doğrudan fiş ya da sistemik olarak 3 içine tatbik edilebilir, 4. Birkaç dakika içinde katılaşır nerede ECM-mimik jel deri altına enjekte edilir. Ortaya çıkan fiş kan damarı işe değerlendirilmesi typicall olduğunuY flöresin izotiyosiyanat enjeksiyonu (FITC), aşağıdaki flüoresan sinyal ölçümü ile, tıkacın içinde hemoglobin düzeyi ölçülerek yapılan endotel özel markörler için histoloji kısımlarının immün ya da sıralama floresan-aktive edilmiş hücre (FACS) 2,5 ile, dekstran -etiketli 6. Ancak, bu değerlendirme sadece uç nokta analizi sağlar ve kan damarlarının işlevleri ve morfolojisi hakkında bilgi yoksun. Kan içeriği damar büyüklüğü ve kan durgun su ölçüde etkilenir Ek olarak, plazma hacmi ölçümleri ya da hemoglobin düzeyleri ile ya da bir gösterge olarak dekstran-FITC ile, yanıltıcı olabilir. Işe damar gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisi 7 ile karakterizedir Bu özellikle önemlidir. Biz burada iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemleri birleştirerek işe kan damarlarının görüntülenmesi için yeni, daha hassas, yöntem öneriyoruz. Higkan damarı yoğunluğu hakkında değil, aynı zamanda kendi morfolojisi ve işlevselliği değil sadece bilgi verebilir Intravital lifli-konfokal endomikroskopi ile birlikte h-çözünürlüklü mikrokabarcıklar kontrast geliştirilmiş ultrason (US). Ayrıca, bu analiz, böylece anjiyojenez kinetik izlenmesine olanak veren çeşitli zaman noktalarında gerçekleştirilebilir. ABD vasküler bölmeye 8-11 münhasıran kalır mikrokabarcıkların intravenöz (iv) enjeksiyonu takiben kan damarları görüntüleme için yüksek uzaysal çözünürlüğü sahip bir yaygın kullanılan görüntüleme yöntemidir. Mikrokabarcıklar bir ABD darbesi ile heyecanlı ve böylece iyi bir kontrast madde olarak hizmet zaman güçlü bir ekojenik sinyal üretmek gaz dolu mikrokabarcıklar vardır. Fiş 3D görüntüler mikro kabarcıklar imha aşağıdaki ABD görüntüleme sistemi yazılımı kullanılarak elde edilir. Ortaya çıkan görüntüler mikro-kabarcıkların öncesi ve sonrası imha görüntü karelerinden oluşan ve renk video yoğunluğundaki farkı yansıtır. Bu yerleştirilmiştirGörüntüler otomatik olarak yazılım tarafından görüntülenir. Sonuç olarak, fiş içinde fonksiyonel damarların yüzde belirlenebilir. Konfokal endomikroskopi lifli Yüksek çözünürlüklü kan damarları morfoloji raporlanması ile tamamlayıcı görüntüleme yöntemi olarak hizmet vermektedir. Bu minimal invaziv yöntemde, görüntüler FITC konjuge dekstran 12 iv uygulamasını takiben elde edilir. floresan polimer kana boyayan ve böylece kan damarları morfoloji ve kan akışı için bir &#39;kontrast madde&#39; olarak hizmet vermektedir. Enjekte polimer 70 KDa bir boyutta olduğu tümör damar sistemi içinde bulunan Dahası, sadece sızan damarları geçebilir. Bu, kan damarlarının dışında FITC etiketli dekstran yüksek bir arka plan ile sonuçlanacaktır. Sonuç olarak, lifli konfokal endomikroskopi kör uçlar ile, tümör neovasculature- büyütülmüş, sızan, son derece karışık damarları EPR etkisi tipik özelliklerini görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Bu sistem modeli descri edildiU-87 MG insan glioblastoma ve uykuda klon 13 anjiyojenik potansiyeli karşılaştırıldığında yatak. Fişler içinde damarlanması üç hafta ECM-mimik jel aşılama sonrası değerlendirildi. Bu gösterildi bundan CM içeren fişler içinde vaskülarizasyon U-87 MG uyuyan tümör üreten hücrelerden CM içeren fişler içinde damarlanma ile karşılaştırıldığında tümör üreten hücreler önemli ölçüde sayı, yoğunluk ve işlevsellik bakımından artmıştır hızlı büyüyen. Bu nedenle, yazarlar CM izole sonucuna mümkün U 87 mg hızlı büyüyen tümör hücreleri üreten atıl tümör üreten hücrelerden CM kıyasla pro-anjiyojenik faktörler arasında yüksek düzeyde ihtiva etmektedir. Bu faktörler, (son olarak endotelyal hücrelerin tüp şekilli yapıların oluşumunu, yani, proliferasyon, çimlenme, göç ve) pozitif anjiyojenik kaskadın tüm adımları etkileyerek fonksiyonel kan damarlarının oluşumunu teşvik eder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Company</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Catalog number</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Rotary Vacuum Evaporator</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Growth-factors reduced phenol-free Matrigel</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">BD Bioscience</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">FAL356231</td>
			<td style="width:251px;">Thaw overnight, at 40C on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Depilatory cream&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 US imaging system</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">55 MHz 708 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 imaging software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">VialMix&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VMIX</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">DEFINITY microbubbles</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DE4</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Activate for 45 seconds using Vialmix before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ProFlex MiniO/30 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">70 kD FITC-labeled Dextran</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">46945</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ImageCell software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Calibration Kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td align="left" height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td align="left">Gibco Life Tecchnologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td align="left" height="37" style="height:37px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td align="left" height="39" style="height:39px;">Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring functionality and morphology of vasculature recruited by factors secreted by fast-growing tumor-generating cells

farelere subkutan olarak Matrigel fiş deney pro- ve anti-anjiyojenik faktörlerin in vivo değerlendirilmesi için tercih edilen bir yöntemdir. Bu yöntemde, arzu edilen faktörler, deri altına enjeksiyon sonrası, kanser ortamını taklit eden bir ortam oluşturmak üzere katılaşmaktadır soğuk sıvı ECM mimik jel içine yerleştirilir. Bu matris, endotel hücreleri ve damar nedenle oluşumu gibi konakçı hücreler, bir şekilde nüfuz etmesini sağlamaktadır. Bu yazıda, belirli bir etken (örneğin, bFGF ve VEGF) veya ajana karşı, kanser hücreleri tarafindan salgılanan faktörlerle havuzunun anjiyojenik potansiyelini göstermektedir için kullanılabilir yeni bir modifiye edilmiş Matrigel fiş deneyi önermektir. ECM-mimik jel içeren fiş-hızlı büyüyen tümör üreten glioblastoma hücrelerinin CM salgılanan faktörlerin bir havuzlu ev sahibi (yani, fare) tanıtmak için kullanılır. Biz daha önce anjiyojenik potansiyeli geniş bir karşılaştırma tarif varU 87 mg ana hücrelerde neden olduğu anjiyojenez gösteren U 87 mg insan glioblastoma ve bu sistem modeli olan atıl türetilmiş klon. CM 48 saat kuluçkadan sonra hücre hattı ya da bir birleşik doku kültürü plakalarından toplanan ortamı filtre edilerek hazırlanır. Dolayısıyla, bu hücrelerin kendileri olmadan hücreler tarafından salgılanan tek faktörler içerir. İki görüntüleme yöntemlerinin kombinasyonu burada açıklandığı fişleri içinde yeni oluşan kan damarlarının doğru, gerçek zamanlı ölçüde, morfoloji karakterizasyonu ve işlevsellik için, kontrastlı ultrason görüntüleme ve Intravital fibered-konfokal endomikroskopi mikrokabarcıkları.

Hızla büyüyen anjiyojenik tümör üreten hücre çizgisi U-87 MG, geniş anjiojenezis&#39;de sonuçları CM ile ECM-mimik jel fişlerini implanting. Bu damar yoğun iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemleri kullanılarak araştırılmalıdır edilebilir. Microbubbles kontrastlı ABD görüntüleme U-87 MG CM yüklü fişler, uyuyan tümör üreten hücrelerden CM içeren fişler içinde saptanamayan kan akımına karşı (Şekil 1) içinde yoğun kan akışını göst...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells at JoVE.com

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Hızlı büyüyen Tümör üreten hücreleri tarafından salgılanan faktörler tarafından işe alınmış İzleme İşlevsellik ve vaskülatürüne morfolojisi

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

monitoring-functionality-morphology-vasculature-recruited-factors

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Görüntüleme.  Tel Aviv University. We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Video: Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Biyoloji

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

FMRI İnsan Beyninin izlenmesi Akupunktur Etkileri

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

RNA Yapısı &#39;peroksidatif&#39; ve &#39;Oksidatif&#39; Hidroksil Radikal footprinting İzleme Denge Değişiklikler

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

Floresan Etiketli Suşların Cocultivation'ı ile Bakteri Hücre Popülasyonunda İntraspecies Rekabetini İzleme

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...