Biz nazik Vasa ve Trafik Jam antikorlar temin Ruth Lehman ve Dorthea Godt minnettarız. Biz NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi tarafından tutulan sağlanan hisse senetleri ve Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası korumak için Indiana Üniversitesi Bloomington Stok Merkezi&#39;ni kabul etmek istiyorum. Biz onların tavsiye ve destek için Wawersik laboratuar tüm üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma Monroe Scholars Program Grant ve NSF (AF ve LB) (MW) IOS0823151 hibe ile finanse edildi.

Bir Toplama Cage 1. Hazırlık <ol><li> CO 2 genç, bereketli sinekler uyutmak. Bir kafese sineklere aktarın. Optimal verim elde 4 yaşı 2-7 gün arasında değişen 100-120 yetişkin sinekler kullanmak için: erkeklerin kadın 1 oranında. Sinekler uygun bir alışma dönemi Veren, ~ 24 saat tespiti için numune alınması öncesinde. 48 saat alışma dönemi - kafes bakire kadın ile kuruldu ise, erkeklere bir kullanımı 36 evlendirdi. </li><li> Kafesin açık ucunda, kafesin açıklığın üzerine merkezi maya hamur bir bozuk para büyüklüğünde damla ile önceden hazırlanmış bir elma suyu agar plaka yerleştirin. Sonra, bant ile sabitleyin. Elma suyu agar plaka ve Parafilm ile kafesi arasında kavşak mühür. </li><li> Baz olarak elma suyu agar plakası ile ikincil bir kap içinde kafes yerleştirin ve deney ile belirlendiği gibi sineklerin uygun bir zaman süresi için, belirli bir sıcaklıkta yeniden sağlar. Not: Örnek toplama kez wideğişir ll. Geç aşama embriyolar erken / L1 larvaları toplamak, örneğin, (17-24 saat), sinekler 25 ° C&#39;de 17 saat boyunca önce numune yaşlanmaya karşı 25 ° C&#39;de 7 saat boyunca elma sulu agar tabakları üzerinde yumurta bırakmaya izin verir. Benzer şekilde, orta-geç birinci değişim safhasındaki larva toplanması için (36-48 sa) sinekler 25 ° C&#39;de 36 saat boyunca önce numune yaşlanmaya 25 ° C&#39;de 12 saat boyunca yumurta bırakmaya izin verir. </li><li> Süre tamamlandıktan sonra sinek anestezi olmadan uzakta elma suyu agar plaka damla böylece, bir masanın üzerine kafes dokunun. Çabuk maya hamur bir damla içeren bir taze, kullanılmış bir plaka değiştirin. Bant ve parafilm ile taze bir tabak Güvenli ve üs olarak elma suyu agar plaka ile kafesi saklayın. </li><li> Dikkatlice bir metal spatula ile kullanılan plaka maya damla çıkarın. Deneysel gerekirse Yer kullanılan elma suyu plaka üzerinde kapak ve yaş embriyolar koydu izin verir. Not: numuneler, yaşlanma, levhalar 25 ° C&#39;de muhafaza edilebilir, daha yüksek sıcaklıklar Experimenta olmadıkçaLly gerekli. Yukarıda açıklanan koleksiyonu için embriyolar yaş için nasıl örnekler (1.3 adım için nota bakınız). Yaşlanmayı örnek önce maya hamur çıkarılması mayaya tarama ve altında agar kesiliyor larvaları önlemek için yapılır. Kalan elma suyu agar ve maya yapıştırma kalıntı larva büyümesi için besin sağlar. Maya hamur direkt olarak belirtilen embriyolar maya hamur çıkarılması ile kaybolur da, bu kayıp boyama verimini azaltır numunede maya ve agar tortu tercih edilir. Bir maya macun kaldırmak için seçmek, maya, bir boya fırçası ile karıştırılmış Fosfat Tamponu, Triton X-100 (PBTx) ile sıvılaştırılmış ve daha sonra önce tespit üzere bir hücre filtresinden ile numuneden uzaklaştırılabilir. </li></ol> 2. Sabitleme <ol><li> Elma suyu ağan plakası üzerine döşenmiş embriyolar Arzu edilen zaman noktasında yaş arası sonra, dikkatli bir şekilde th örneği almak için Fosfat Tamponu, Triton X-100 (PBTx) bir eriyiği ile ıslatılır, küçük bir fırça kullanıne plakası. Not: Eski larva hareketlidir ve kapağın iç kısmına tarayabilir. Bu örnek, bir fırça ile uzaklaştırılarak elde edilmiş benzer şekilde elde edilebilir. </li><li> Bir hücre süzgeç iç bakan sırt karşı örnek yüklü fırça silin. Ardından, süzgeç duvarları ve PBTx çözüm içeren bir bücür şişe fırça durulayın. PBTx çözümü yakalamak için süzgeç altında bir petri kapağı yerleştirin. </li><li> Tüm numune filtresine transfer edilmesinden sonra, örgü kapalı numune yükseltmek için yeterli miktarda süzgeçten PBTx dökün. Daha sonra, süzgeç kaldırın ve bir sıvı atık kabına petri dökünüz. </li><li> Tekrarlayın Adım 2.3 üç kez maya kaldırmak ve numune ile birlikte aktarılmış olabilir atık uçmak. </li><li> Örgü larvalarını yükseltmek için yeterli% 50 çamaşır suyu içine süzgeçten (NaOCI) / su (GKD 2 O) çözeltisi dökün. Larvaları 5 dakika boyunca solüsyon içinde bekletin. Ardından, süzgeç kaldırın ve t dökmeko bir sıvı atık kabına petri içerikleri. Not: - koryonik membran kaldırmak amacıyla 22 sa Bleach sadece 0 yaş embriyonik örnekleri gereklidir. Büyük örnekler için çamaşır suyu uygulaması atlanabilir, ancak dahil zararlı değildir. Ihmal isteniyorsa, PBTx, bu aşamada ağartıcı değiştirin. Seyreltilmiş ağartıcı çözelti hazırlama, 24 saat içinde kullanılmalıdır. </li><li> Örgü kapalı örneği yükseltmek için süzgeç içine yeterince PBTx dökerek PBTx ile süzgeç örnek yıkayın. Örnek 3 dakika boyunca solüsyon içinde bekletin. Daha sonra, süzgeç kaldırın ve bir sıvı atık kabına petri dökünüz. </li><li> Tekrarlayın Adım 2.6 beş kez. </li><li> Hücre süzgecinden kuru alt Dab, daha sonra bir fırça ile PEMS çözeltisinin 1.75 ml&#39;sini ihtiva eden bir parıltı şişesine içine örnek aktarmak. </li><li> Bir havalandırılan bir duman başlığı içinde çalışan% 37 formaldehit ve 250 ul sintilasyon şişesine reaktif dereceli heptan 8 ml ekleyin. <br/&gt; Not: Formaldehit ve heptan tehlikelidir. 3.3 - Güvenlik amaçları için, bir havalandırmalı davlumbaz çalışmak ve adımlar 2.9 uygun eldiven giymeye devam. </li><li> Şişe 200 rpm&#39;de ve 20 dakika için de benzer bir orta hızda çalkalanır izin verin. </li><li> Önceki sulu fazın çıkarmadan sintilasyon şişesine 10 ml metanol eklenir ve şişe 1 dakika boyunca 500 rpm&#39;de sallamak kuvvetli bir şekilde izin verir. Not: Metanol tehlikelidir. Havalandırılan bir davlumbaz çalışmak ve uygun eldiven giymeye devam. </li><li> Kaputu bir sıvı atık kabına üzerinde bir hücre süzgeç içine içeriğini dökün hemen sallantýyý şişe çıkarın ve. Şişeye ilave metanol ekleyin ve bütün numune kaldırıldı temin etmek için önemli bir hücre süzgecinden çalıştırın. Not: Hücre süzgeçler yavaş boşalabilir. Bu sorunu çözmek için, daha hızlı bir şekilde süzgecinden çözelti çekmek için bir hücre süzgecinden altına laboratuar doku dokunun. Metanol, formaldehit, ve heptan &#39;dır olmalıdırkurumsal kurallarına göre uygun bertaraf kadar uygun bir atık kaplarda saklanır. </li><li> Laboratuar doku kullanılarak hücre süzgecinden kuru alt metanol ve daha sonra 0.5 ml ihtiva eden 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süzgecinden yakalanan örnek aktarmak için bir fırça kullanılır. Not: Birden fazla ışıma flakon kullanımda ise, tam adımlar 2.12 ve bir seferde 2.13 bir şişe hücre süzgeçler üzerinde kurumasını örnek önlemek için. </li><li> Örnek mikrosantrifüj tüpüne eklenmiştir sonra, bir pipetle, metanolün çıkması. Emin örnek tüpün dibine yerleşmiştir. </li><li> Tüpe metanol yaklaşık 0,5 ml ilave etmek suretiyle mikrosantrifüj tüpü içinde örnek durulayın. Bundan sonra da dinlendirilir, bir pipet ile metanolün çıkması için numune bekleyin. </li><li> Adım 15 tekrar üç kez. </li><li> Bir tüpe metanol içinde 0.5 ml ilave edilir, ve daha sonra kaydetmek daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C sıcaklıkta dondurucuya. </li></ol> 3. Rehidrasyon ve immün için Numune Hazırlama <ol><li> Tüp içinde örnek bırakarak bir pipet ile mikrosantrifüj tüpü ve metanol çıkarın. Uygun bertaraf zamanına kadar uygun bir atık konteynerine Mağaza metanol atık. , Sonikasyon verimliliğini artırmak için numunenin en fazla 3 mm, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü altındaki yerleşmiş kullanın: edin. Aşırı numunesi yukarıda adım rehidrasyon başlamadan önce bir pipet ile ayrı bir tüpe aktarılır. Temiz bir jilet ile pipet kesme pipet tıkanmasını önlemek için de kullanılabilir. </li><li> 3 dakika boyunca tüp ve kaya için% 50 metanol / Fosfat Tampon Tween, (PBTw) çözeltisi 1.0 ml ilave edilir. </li><li> Uygun atık kabına metanol çözüm çıkarın ve iki kez PBTw 1.0 ul ile yıkayın. Her durulama sonra, numune, bir pipet ile ortadan kaldırılmasından önce PBTw oturmasına izin verin. </li><li> Sığır Serumu Albümini / Fosfat Tamponlu Tween (BBTw) 1,0 ml ilave edilir ve şişe kaya karıştırın. Bir rocker 3 dakika sonra, SAMP sağlarle yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için. </li><li> Tekrarlayın Adım Son yıkamadan sonra, numune kaybetmeden mümkün olduğu kadar BBTw kaldırmak için dikkat 3.4 iki kere verilir. </li><li> Tüpe BBTw 0.5 ml ilave edilir ve buz üzerinde tüp yerleştirin. </li></ol> Örnek 4. Sonikasyon <ol><li> 10% maksimum genlik için sonikator ayarlayın ve 2 sn sabit sonikasyonun bir çalışma süresini tayin. Not: Bu ayarlar Malzeme ve Ekipmanları Tablo belirtilen sonikatöre özgü ve farklı sonicators için optimizasyon gerektirebilir. </li><li> Önceki örnek, sonikasyon işlemine, prob temizlemek için deiyonize su ve çalıştırma sonikatör ile dolu bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine prob ucunu yerleştirerek sonikatör probu temizleyin. Koşudan sonra laboratuvar dokusu ile kuru Sonikatör prob. </li><li> Bu numune üzerinde yaklaşık 3-4 mm konumlandığı şekilde numuneyi içeren mikrosantrifüj tüpü içine daldırın ve sonikasyon probu başlar. </li><li> M çıkarınicrocentrifuge boru sonikasyon ısı dağılımı ve örnek mikrosantrifüj tüp dibinde biriken izin vermek için en az 30 saniye boyunca buz üzerine yerleştirin ve. </li><li> Tekrar 4.3 ve işlenen numune yaşına göre gerektiğinde 4.4 adımları. Not: Optimum Sonication örnek hacmi için, Sonikasyon gerekmez daha genç 17 saat embriyolar, ancak bu saat 17 ila 24 (/ 17 aşama, erken-L1) iki sonikasyon gerektirir. Larva arası 24-36 (erken / orta-L1), 36-48, (orta /-L1 geç) 48 - 60 (erken / orta-L2), 60-72 (orta / geç-L2), 72-84 ( )-L3 erken, 84-96 (erken / orta-L3), 96-108 (orta / geç-L3) hr gerektiren 5, 9, 11, 13, sırasıyla 15, 18 ve 22 sonikasyon. Sonication kez daha hazırlanması için tartışma bakın. </li><li> BBTw iki kez 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile BBTw kapalı çizim önce yerleşmek için izin. </li><li> Flakon ve kaya BBTw 1.0 ml ekleyin. Rocker 3 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için izin verir. &lt;/ Li&gt; <li> Tekrarlayın Adım 4.7 iki kez. </li></ol> 5. immün <ol><li> Mikrosantrifüj tüpüne BBTw içinde seyreltilmiş,% 5, normal serumu ilave ederek örnek bloke eder. 1 saat boyunca sallanan sonra bloğunu çıkarın. Not: İkincil antikorlar uretıldığı türleri normal serum kullanın. </li><li> % 5 normal serumu / BBTw konsantrasyonu çözelti içinde çalışan mülk birincil antikorlar seyreltilir. </li><li> 4 ° C&#39;de ya da (yaklaşık 22 ° C oda sıcaklığında en azından 3 saat için primer antikor çözeltisi O kaya örnek / K. Not: Antikor inkübasyon süreleri ve sıcaklıklar değişebilir. O / N, oda sıcaklığında, 4 ° C&#39;de inkübasyon ya da 3 saat tipik olarak yeterlidir. Bununla birlikte, iki günlük bir inkübasyon süresi, daha eski numune ya da düşük affiniteli primer antikorlar ile kullanıldığında, boyama kalitesini artırabilir. Daha uzun bekletme tipik olarak 4 ° C&#39;de gerçekleştirilir. Sekonder antikor (5.10) kullanıldığında benzer sonuçlar elde edilmektedir gerekir. </li><li> Örnek yerleşmek için izin vermikrofüj tüpün alt. Pipet ile primer antikorlar kapalı çizin. Arzu edildiği takdirde yeniden kullanım için antikorlar kaydedin. </li><li> Iki BBTw 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile BBTw kapalı çizim önce yerleşmek için izin. </li><li> Flakon ve kaya BBTw 1.0 ml ekleyin. Rocker 3 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için izin verir. </li><li> Tekrarlayın Adım 5.6 beş kez. </li><li> Mikrosantrifüj tüpüne% 5 normal serumu / BBTw çözeltisi eklenerek Blok örneği. 1 saat 30 dakika boyunca sallanan sonra blok çıkarın. Bu ilave bir bloke etme adım gerekli değildir, ancak özel antikorlar için boyama kalitesini iyileştirebilir: edin. </li><li> % 5 normal serumu / BBTw konsantrasyonu çözelti içinde çalışan mülk sekonder antikorlar seyreltilir. </li><li> Işığa maruz kalma nedeniyle solmasını azaltmak için bir alüminyum folyo içinde mikrosantrifüj tüpü sarın. 4 ° C&#39;de 12 saat 48 için ikincil bir antikor ya da çözelti içinde, oda sıcaklığında (yaklaşık 22 ° C&#39;de en az 3 saat boyunca Kaya örneği. </li><li> Örnek mikrofuge&#39;de tüpünün dibine yerleşmek için izin ver. Pipet ile ikincil antikorlar kapalı çizin. </li><li> Iki PBTw 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile PBTw kapalı çizmeden önce yerleşmek için izin. </li><li> Flakon ve kaya PBTw 1.0 ml ekleyin. Kızağa üzerinde 5 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile PBTw kaldırmaktır. </li><li> Tekrarlayın Adım 5.13 üç kez. </li><li> İSTEĞE BAĞLI: 1,000 PBTw in: DAPI 1 seyreltilmiş ekleyin. Kaya örnek 3 dakika için alüminyum folyoya sarılmıştır; daha sonra bir pipet ile DAPI çözeltisi çıkarın. Örnek pipetle PBTw çıkarmadan önce çökmesine izin verdikten, PBTw 1.0 ml ile beş kez çalkalayın. </li><li> -20 ° C&#39;de mikrosantrifüj tüpüne ve saklamak için 1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan (DABCO) çözeltisi 100 ul - 80 ekleyin. Not: Başka bir gliserol tabanlı bir anti-solmaya madde için ikame edilebilir. </li></ol> 6. Analiz <ol><li> DABKO / p-phen 10 ul - slaytlar üzerine numuneyi monte etmeden önce, ekstra 5 ekleylenediamine (PPD) mikrosantrifüj tüpüne antifade çözüm. Not: Örnek diseksiyonu olmadan slaytlar eklenebilir. Bir slayta eklenen Numune hacmi kapak kayma boyutuna göre değişir. Slayt üzerine örnek pipetlerken, pipet ucu numune kesme önlemek için bir jilet kullanarak kesilebilir. Bu kolay analiz için satırları örnek sıraya genellikle faydalıdır. Ilave madde olarak antifade DSD eklenmesi gerekli olmayabilir, ancak örnekler uzun süreli saklandığı takdirde, ışıkla önleyebilir. </li><li> Yavaşça numune üzerinde cam kapak kayma yerleştirin. Sonra, yerde güvenli kapak kayma oje kullanarak. </li><li> Görünüm floresan mikroskopi kullanılarak örnek monte edilmiş. </li></ol>

<ol>
	<li>Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+controlling+germ+cell+migration+and+embryonic+gonad+formation+in+Drosophila.">Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila.</a> Development. 125, 667-678 (1998).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , 141-157 (2000).</li><li>Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+E-cadherin+is+essential+for+proper+germ+cell-soma+interaction+during+gonad+morphogenesis.">Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis.</a> Development. 130, 4417-4426 (2003).</li><li>Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Handbook. , 122-205 (2005).</li><li>Blair, S. S., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , 159-173 (2000).</li><li>Patel, N., Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. , 445-487 (1994).</li><li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries.">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+germline+stem+cell+niche+in+Drosophila.">Development of the male germline stem cell niche in Drosophila.</a> Dev Biol. 294, 92-103 (2006).</li><li>Sheng, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak-STAT+regulation+of+male+germline+stem+cell+establishment+during+Drosophila+embryogenesis.">Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis.</a> Dev Biol. 334, 335-344 (2009).</li><li>Sinden, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak-STAT+regulation+of+cyst+stem+cell+development+in+the+Drosophila+testis.">Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis.</a> Dev Biol. 372, 5-16 (2012).</li><li>DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonautonomous+sex+determination+controls+sexually+dimorphic+development+of+the+Drosophila+gonad.">Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad.</a> Dev Cell. 14, 275-286 (2008).</li><li>Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=raw+Functions+through+JNK+signaling+and+cadherin-based+adhesion+to+regulate+Drosophila+gonad+morphogenesis.">raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis.</a> Dev Biol. 367, 114-125 (2012).</li><li>Fuller, M., Bat, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+Lessons+from+Drosophila+testis.">The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li><li>Williamson, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+development+in+Drosophila.">Germ cell development in Drosophila.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).</li><li>Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gonadal+cells:+the+supporting+cast+for+the+germline.">Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline.</a> Genesis. 49, 753-775 (2011).</li><li>Spradling, A. C., Bat, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).</li><li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+niche:+studies+from+the+Drosophila+ovary.">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).</li><li>Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovary+morphogenesis:+Analysis+of+terminal+filament+formation+and+identification+of+a+gene+required+for+this+process.">Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process.</a> Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).</li><li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+a+brac.">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac.</a> Development. 121, 173-187 (1995).</li><li>Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+regulation+of+niche+and+stem+cell+precursors+by+hormonal+signaling.">Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling.</a> PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).</li><li>Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egfr+signaling+controls+the+size+of+the+stem+cell+precursor+pool+in+the+Drosophila+ovary.">Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary.</a> Mech Dev. 130, 241-253 (2013).</li><li>Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+anchored+by+adherens+junctions+in+the+Drosophila+ovary+niches.">Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.</a> Science. 296, 1855-1857 (2002).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila.+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> BioEssays. 26, 739-751 (2004).</li><li>Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+gene+negatively+regulates+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+larval+central+brain+of+Drosophila.">The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila.</a> Development. 133, 2639-2648 (2006).</li><li>Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brat+is+a+Miranda+cargo+protein+that+promotes+neuronal+differentiation+and+inhibits+neuroblast+self-renewal.">Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal.</a> Dev Cell. 10, 441-449 (2006).</li><li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li><li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila.">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li><li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+identity,+morphology,+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila.">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol, böylece başarılı bir diseksiyon için olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, in situ Drosophila embriyonik ve larva hedef dokulara immunostain için bir yöntem sağlar. Erken embriyolar 1,2,3 boyanması için önce protokoller gereğince, koryonik membran% 50 çamaşır suyu (NaOCl) kullanılarak kaldırılır. Numuneler formaldehit ve metanol giderilmiştir. Larva kütikül yüzer eski numune neden olduğu için, bütün numune daha sonra larva tutulmasını sağlamak için bir hücre...

Drosophila embriyoları ve larvaları birçok organda ve dokuda gelişim süreçlerini incelemek için mükemmel bir model sunmaktadır. Tek tek hücrelerin Görüntüleme hücrelerinin geliştiği karmaşık ortamları tespit etmek için, bu çalışmalarda genellikle gereklidir. Dokusunun Görselleştirme imüno yoluyla gerçekleştirilebilir. Protokolleri 17 saat Yumurtlayarak (AEL) 1-3 sonra embriyonik Drosophila dokular &lt;ana kadar immünolekeleme iyi tarif. Etkili antikor nüfuz etmesini önlemek embriyojenez sonuna doğru Bununla birlikte, koruyucu kütikül formlar. Bu nedenle, bu immün protokolleri son aşama embriyolarda dokuların analizi ve larva gelişimi (1. safha (L1), 2. safha (L2) ve 3. instar (L3)) daha sonraki aşamalarında verimsizdir. Bu verimsizlik bu genişletilmiş gelişme döneminde 4 sırasında meydana dinamik süreçleri anlamamıza engel dayatır. Tissue diseksiyonu bu engeli 5-7 aşmak için bir yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Ancak, diseksiyon verimsiz kanıtlayabilirim. Ekstraksiyon bulma veya embriyonik ve larva dokuları izole güçlüğü ile ipotekli olabilir. Bundan başka, hedef dokuların fiziksel giderilmesi, bunları kırılması ya da tamamen bunları elde etmek için başarısız olarak zarar görmesine neden olabilir. Sonikasyon arası etkileşimleri bozmak ses dalgaları kullanan bir yöntemdir. Nöral hücre tipleri 6 geliştirmek immunostain amacıyla Drosophila larva kütikül bütünlüğünü bozmak için kullanılmıştır. Bu protokol geç evre embriyonik ve çapı 8-10 50um kadar küçük olabilir larva organlarında, immunostain adapte edilmiştir. Bu çalışmaları sayesinde, erkek tohum çizgisi kök hücreleri (GSC) hücresi oluşum süreci sonunda aşamasında karakterize edilmiştir kök hücre gelişimini düzenleyen ve dif Drosophila embriyolar 8-10 ve mekanizmaGeç evre embriyonik gonadlar ve larvaları ferentiation 9-12 saptanamamıştır. Böylece, sonikasyon nedeniyle doku boyutu zor olabilir doku diseksiyonu etkili bir alternatif sağlar. Bundan başka, bütün organizmanın bağlamında hücreleri bırakarak ve in situ morfolojisinde muhafaza yerinde Drosophila dokuların imüno-boyanmasını sağlar. Burada, in situ / erken orta L3 dokular içinden geç embriyonik aşama floresanlığıdır immün için adım adım protokol açıklar. Drosophila gonadal ve sinir dokusunun analizi bu protokolün etkinliğini göstermek için Temsilcisi Sonuçlar gösterilir. Ayrıca, bu imüno protokol bir dış kütikül diğer organizmalardaki diğer Drosophila dokusunu ve dokularının analiz edilmesi için adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1: Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)</td>
			<td>For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)</td>
			<td>For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4</td>
			<td>Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEMS</td>
			<td>0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH</td>
			<td>Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>37% formaldehyde by weight in methanol</td>
			<td>Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>n-Heptane</td>
			<td>CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Methanol</td>
			<td>CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Tween (PBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%</td>
			<td>Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O</td>
			<td>Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td>
			<td>To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol</td>
			<td>In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution</td>
			<td>1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)</td>
			<td>Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple juice plates</td>
			<td>To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O</td>
			<td>Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept 10%</td>
			<td>To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol</td>
			<td>Store aliquots at -20 degrees C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast paste</td>
			<td>~50 g Dry Active Yeast</td>
			<td>Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2: Staining Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571 //// Stock at 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-Vasa</td>
			<td>1:250</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Ruth Lehmann</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Fasciclin III</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>7G10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-1B1</td>
			<td>1:4</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>1B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guniea pig anti-Traffic Jam</td>
			<td>1:2500</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prospero</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Prospero MR1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-Elav</td>
			<td>1:30</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Rat-elav 7EBA10 anti-elav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Repo</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>8D12 anti-Repo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa546</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-guniea pig Alexa633</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rat Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3: Materials and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Cages</td>
			<td>Hand-made; Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101</td>
			<td>Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model: Branson Digital Sonifier 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Probe</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model #: 102C (CE)</td>
			<td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-25-20</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software</td>
			<td>Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.</td>
			<td>Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>450-0020</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sonication-facilitated immunofluorescence staining of late-stage embryonic and larval drosophila tissues in situ

Drosophila yapılan çalışmalar embriyo ve larva gibi hücre kaderi şartname ve organogenezis gibi gelişimsel süreçlerine önemli bilgi sağlar melanogaster. İmmünoboyama doku ve organların geliştirilmesi görselleştirme sağlar. Bununla birlikte, embriyojenez sonunda oluşturan bir koruyucu üst deri geç dönem embriyo ve larvalarına antikorların geçirmesini engeller. Immün önce diseksiyon düzenli Drosophila larva dokularının analiz etmek için kullanılır iken, küçük dokular bulmak ve izole etmek zor olabilir çünkü, bazı analizler için verimsiz kanıtlıyor. Sonikasyon larva Drosophila immünoboyamasıdır protokoller diseksiyon için bir alternatif sağlar. Geç evre embriyo ve larvaların çok sayıda hızlı, eşzamanlı işleme izin verir ve yerinde morfolojisi tutar. Formaldehit içinde tespit sonra, bir numune ultrasonik banyoda tutulur. Numune, daha sonra antigen-spesifik primer ant ile imüno tabi tutuluribodies ve floresan etiketli sekonder antikorlar floresan mikroskobu ile hedef hücre tiplerini ve spesifik proteinlerin görselleştirmek için. Sonikasyon işlemi sırasında numunenin üstüne, bir sonikasyon probu, hem de sonikasyon süresi ve yoğunluğu, uygun yerleştirilmesi kritik öneme sahiptir. Standart immünoboyama protokolleri Ek bir küçük değişiklikler, yüksek kaliteli lekeler için gerekli olabilir. Gürültü oranı düşük sinyalli antikorlar için, daha uzun inkubasyon süreleri tipik olarak gereklidir. Bu Sonication kolaylaştırdı protokol konseptinin bir kanıtı olarak, gelişim aşamaları bir dizi üç doku tiplerinin (testisler, yumurtalıklar, ve nöral dokular) arasında immunohistokimyasal göstermektedir.

Geç evre embriyonik ve larva in situ dokularının analizi içinde sonikasyon bazlı imüno etkinliğini göstermek için, vahşi tip embriyoları ve larva testis, yumurtalık immün ve nöral doku için işlenmiştir. Numuneler konfokal mikroskobu ile görüntülendi ve temsili sonuçları (Şekil 1 ve Şekil 2) gösterilmiştir. Sonuçlar tarif edilen protokol Drosophila gelişiminin geç embriyonik erken aracılığıyla / orta L3 aşamalarında morfolojik özellik...

Watch this Scientific Journal Video about Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ at JoVE.com

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

12.6K Görüntüleme.  College of William & Mary. Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae. 

Video: Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Zebra balığı Embriyonik Göz Dokular, Mikrodisseksiyon

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Diseksiyon ve boyanması Drosophila Larvaların Yumurtalıkların

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Larvaların Faaliyet Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...