Name: in situ immunofluorescent staining of autophagy in muscle stem cells
Uploaded: 2017-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells at JoVE.com

Bu çalışma, NIAMS AR064873, Epigen Project PB tarafından desteklendi. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT - LL

Fareler, standart hayvan tesisi prosedürlerine göre yetiştirildi ve muhafaza edildi ve tüm deney protokolleri, Hayvan Refahı Güvencesi ve İtalyan Sağlık Bakanlığı&#39;na göre dahili Hayvan Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı ve NIH&#39;nin Bakım ve Kullanım Kılavuzu&#39;na Laboratuar hayvanları. 1. Otofajik Flux&#39;ın Kası Yaralanması ve In Vivo Blokları <ol><li> Kas yaralanması. <ol><li> Akut iskelet kası hasarını uyandırmak için yaklaşık 20 g ağırlığındaki 2 aylık C57BL / 6J farelerin sol tibialis anterior (TA) kas içine 20 uL 10 uM kardiyotoksin (CTX) stoğu enjekte edin. Eş sayıda erkek ve kadın kullanın. Hareketsiz kontralateral kolu bir kontrol olarak kullanın. NOT:% 0.9 sodyum klorür çözeltisi içinde 10 uM CTX süzülmeli (0.22 μm PVDF filtre) ve -20 ° C&#39;de saklanmalıdır. Dondurma-çözme döngülerini tekrar tekrar kullanmaktan kaçının. </li><li> Bir i kullanma30 G&#39;lik bir iğne ile nsulin şırınga, TA&#39;nın ortasına CTX enjekte edin. TA&#39;da doğru bir yaralanmaya neden olmak için, şırınganın iğnesinin, kasın altından üstüne doğru 5 mm derinliğinde tendonun yakınına girdiğinden emin olun ( Şekil 1A ). </li></ol></li><li> Pertürbantsız ve yaralı farelerde otofajik akının tıkanması. <ol><li> Otofajik akı, 24 saat Yaralanma Sonrası (pi) değerlendirmek için intraperitoneal (IP) enjeksiyonla 24 saatte bir 50 mg / kg klorokin (CLQ) uygulayın ( Şekil 1B ). <ol><li> CLQ&#39;yu (10 mg / mL) PBS 1X içinde eritin ve 0.2 um&#39;lik bir membran boyunca filtreleyin. Her fareyi tartın ve enjekte edilecek CLQ miktarını hesaplayın. NOT: Aynı gün CLQ çözümünü hazırlayın ve kullanın. CLQ stoğu -20 ° C&#39;de bir aya kadar saklanabilir. Otofaji metabolik bir süreç olduğundan, daima aynı anda ( örn . Sabah befo) CLQ tedavisini uygulayınSaat 10:00). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Kas Doku Bölümleri <ol><li> Fare feda et. <ol><li> Yaralanmadan 5 gün sonra fareleri euthanize edin. </li><li> Servikal dislokasyon veya CO 2 ile ötanazi uygulayın (onay için servikal çıkığı takip edin). Otofaji işlemi fare uykusu / beslenme alışkanlıklarıyla ilişkili olduğu için, fareleri daima tercihen aynı sabah, tercihen sabah 10: 00&#39;dan önce feda edin. </li></ol></li><li> TA izolasyonu ve kapsama. <ol><li> Diseksiyontan önce, fare içine% 70 etanol püskürtün. </li><li> Makas kullanmak, farenin dorsal cildi üzerinde kalçalarda küçük, dikey bir kesi (3 mm uzunluğunda) yapar. Cildin alınmasını basitleştirmek için kuyruğu ve ayakları kesin. Deriyi kuyruğa doğru çekin ve alttaki kasları açığa çıkartmak için çıkarın; Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, TA kasının lokalize edilmesi kolaydır </strong&gt;. </li><li> İki forseps yardımıyla distal tendonları tutun. </li><li> Distal tendonları kesin; TA ve ekstansör digitorium longus (EDL) tendonları sıklıkla birlikte kesilir ve daha sonra ayrılır (bkz. Adım 2.2.6). </li><li> Forseps kullanarak TA kasını tendonla tutun ve kası proksimal uca doğru dikkatle çekin ( Şekil 2B ). NOT: Bu noktada, EDL ve TA kasları kolayca tanınabilir; TA, EDL&#39;den daha büyük ve yüzeyseltir. </li><li> İki distal tendonu ters yönde çekerek TA&#39;yi EDL kasından ayırın ( Şekil 2C ). </li><li> Proksimal tendonu kesin. </li><li> Forseps kullanarak, dokuyu hasar görmeden kasları örten ince baş başparmağını kaldırın. </li><li> Kağıt havlu yardımı ile numunedeki aşırı nemi giderin. Aşırı nemin sig&#39;i üreteceğinden kasın ne ıslak ne de aşırı kuru olduğundan emin olun.Kaslara önemli miktarda hasar verir ve sonraki boyayı tehlikeye atar. </li><li> Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiğini bir kalıbın altına yerleştirin ve kası Şekil 2D&#39;de gösterilen oryantasyona yerleştirin. Yaklaşık 3-4 cm&#39;lik bir derinliğe ulaşana kadar bir behere% 100 izopentan ilave edin. Bir polistren kutusunda beher likit azot ile temas halinde yerleştirin. </li><li> Sıvı azottan behere girmesine izin vermeyin, çünkü bu kabarcık köpük üreterek içerikleri etkileyebilir ve kas bölümlerine zarar verebilir. </li><li> Izopentana dikkat edin ve uygun sıcaklığa ulaşana kadar bekleyin (-140 ° C ile -150 ° C arasında); Uygun sıcaklıkta, donmuş izopentan katı beyaz bir tabaka, beherin altında kristalleşecektir. </li><li> İzopentan tamamen katılaşırsa eritin ve bir sonraki adıma geçmeden önce soğutucu sıcaklığa soğutun. </li><li> Önceden soğutulmuş forseps kullanarak, kalıbı dikkatli bir şekildeIzopentan yaklaşık 20-30 s. Dondurulmuş numuneyi, -80 ° C&#39;lik bir dondurucuya aktarılıncaya kadar kuru buzlu bir kaba yerleştirin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. </li></ol></li><li> Kas dokusu kriyoseksiyonları. <ol><li> -80 ° C&#39;de en az bir gece sonra, kriyoterapi uygulayın. </li><li> Kriyostat bıçağını ve anti-roll plakasını -20 ° C&#39;lik dondurucudan çıkarıp kriyostat kabinindeki ilgili desteklerin üzerine koyun. </li><li> Şekil 2D&#39;de görüldüğü gibi, örnek saplama üzerine bir damla OCT koyun ve üzerine dikey NS yönünde dondurulmuş örneği yerleştirin. </li><li> Numuneyi saplamanın üzerine yerleştirin. </li><li> Rulo önleyici plakayı bıçak üzerine çekmeden kas dahil olmayan OCT&#39;den kurtulmak için 40 μm&#39;de kesimler yapın. Kas görünür hale geldiğinde, dilim kalınlığını 7-8 μm&#39;ye düşürün. </li><li> Rulo önleyici plakayı,Bıçağın kenarından veya biraz üstünden. </li><li> Enine kesitleri 7-8 μm kalınlığında kesin ve histolojik slayt başına 3-4 dilim yerleştirin. NOT: Önerilen kriyostat sıcaklığı -15 ° C ile -23 ° C arasındadır. Numunelerin kesitleri, kas kök hücrelerini uydu niş pozisyonunda tespit etmek için müteakip analiz için gereklidir. </li><li> Bölümün yapışmasını en üst düzeye çıkarmak için, antikor inkübasyonu sırasında ayrılmalarını önlemek için slaytları oda sıcaklığında 10-15 dakika tutun. NOT: Hava ile kurutma basamağı, belirsiz sonuç veren immün boyayı etkileyebilir. Slaytlar aylarca sabit olarak -80 ° C&#39;de saklanabilir. Protokol burada duraklatılabilir. </li></ol></li><li> Hematoksilin Eozin (H &amp; E) boyama yaparak TA kaslarının kriyoseksiyonlarında kas hasarını kontrol etme. <ol><li> Kasın kalitesini değerlendirmek ( yani yaralanmanın etkinliği, kas izolasyonu ve inklusu)Iyon ve cryosections), bir H &amp; E boyama yapın. Her deney zamanı için bir slaydı 10 dakika% 4 PFA ile düzeltin. Fiksasyondan sonra, slaytları bir kaç PBS değişiklikleri ile iyice yıkayın. NOT: Dikkat. PFA kanserojendir ve dikkatli kullanılmalıdır. </li><li> Her deney noktası için bir slayt alın ve bir boyama kavanozuna koyun. </li><li> Bölümler kaplanana kadar kavanozu 9 g / L hematoksilen ile doldurun ve 8 dakika inkübe edin. </li><li> Hematoksilini geri dönüştürün. </li><li> Hematoksilen fazlalığını gidermek için kavanozu akan suyun altında 10 dakika bırakın. NOT: Suları direkt olarak bölümlere akmamaya dikkat edin. </li><li> Steril su kullanarak yıkayın. </li><li> Kesitleri 1 dakika süreyle asitlendirilmiş% 90 etanol içindeki eozin ile% 0.5 (w / v) inkübe edin. </li><li> Eozini geri dönüştürün. </li><li> 3 dk / yıkama için steril su ile iki kez yıkayın. NOT: Aşağıdaki basamakları kimyasal bir kaputta gerçekleştirin. </li><li> Kesitleri% 70 etanol ile yıkayın. </li><li> Yıkama% 90 etanol içeren bölümler. </li><li> Kesitleri% 100 etanol ile yıkayın. </li><li> Kesitleri 0.879 g / mL o-Ksilen ile inkübe edin. NOT: Dikkat. O-Xylene yanıcı ve orta derecede toksiktir. Kimyasal kaputun altına, eldivenler, laboratuar önlüğü ve maske de dahil olmak üzere koruyucu ekipmanlar giyerek onları değiştirin. </li><li> O-Ksileni geri dönüştürün. </li><li> Slaytları kurutmak için bir kağıt parçası üzerine koyun. </li><li> Hızlı sertleşen, ksilen bazlı montaj ortamı kullanarak slaytları kapatın. </li><li> Bölümlerin kalitesini 10X büyütmede optik mikroskop altında kontrol edin (bkz. Şekil 3 ) NOT: Protokol burada duraklatılabilir. </li></ol></li></ol> 3. Hasar Görmüş Kas Dokusu Bölümlerinde LC3 ve MyoD için İmmünizasyon <ol><li> Kas doku kesitlerinin fiksasyonu. <ol><li> Bir kağıt parçasını ıslatarak ve kapatılabilir bir plastik kutusunun altına koyarak yüksek inklüzyon korumak için bir kuluçka haznesi hazırlayın.Oda içinde neme karşı. 10 dakika boyunca 1x PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ile doku bölümleri düzeltin. NOT: Numunenin kurutulmasını önlemek için ıslak bir kağıt parçası kullanılır. Yeni PFA hazırlayın veya -20 ° C&#39;de saklanan PFA kullanın. Dikkat. PFA toksiktir; Stok çözeltisi yapılırken tozun özenle ele alınması gerekir. Bu işlem, eldiven, laboratuar önlüğü ve maske de dahil olmak üzere koruyucu bir ekipmanla kimyasal bir kaputta yapılmalıdır. Ayrıca, çözüldüğünde, PFA dikkatle manipüle edilmelidir. </li><li> PFA çıkarın ve 5-7 dakika için bölümleri 1x PBS ile yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> Kas doku kesitlerinin geçirgenleştirilmesi. <ol><li> Bir kalem kullanarak doku bölümlerinin çevresine bir hidrofobik bariyer çizin. NOT: Bu adım, doku kesitlerinin çevresini tanımlar ve adım 3.4, 3.6, 3.7 ve 3.9&#39;da açıklanan antikor hacmini en aza indirir. </li><li> Bölümleri 200 μL soğuk (-20 ° C)Metanol ile inkübe edin ve kuluçka odasını yatay olarak 5 dakika için -20 ° C&#39;de bir dondurucuya koyun. </li><li> Dondurucudan kuluçka bölmesini çıkartın, metanolü aspire edin ve bölümleri oda sıcaklığında 5-7 dakika boyunca 1X PBS ile yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> bloke etme <ol><li> PBS 1x içinde% 4 Sığır Serum Albüminin (BSA) taze bir blok solüsyonu hazırlayın. NOT: BSA çözeltisi 1 ° C&#39;de 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Bölümleri oda sıcaklığında en az 60 dakika blok çözeltisi ile inkübe edin. </li><li> Bloke edici çözeltiyi çıkarın. </li><li> 1x PBS&#39;de 20 μg / mL anti-Fabrika seyrelterek 100 μL anti-Fab karışımı hazırlayın. Bölümleri RT&#39;de 1 saat boyunca anti-fare IgG&#39;sinin birleştirilmiş konformasyonlu afinite ile saflaştırılmış F (ab) parçası ile inkübe edin. </li></ol></li><li> Birincil antikor kuluçka. <ol><li> 1x PBS&#39;de% 4 BSA içinde LC3 ve MyoD antikorlarını eriterek her slayt için birincil antikor karışımı 100 mcL hazırlayın. 5 μg /ML anti-LC3 (tavşan poliklonal antikoru) ve 10 mg / L anti-MyoD (fare monoklonal antikoru). Primer antikor karışımını gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Yıkar. <ol><li> Primer antikor karışımını çıkarın. </li><li> 10 dakika boyunca 1X PBS&#39;de% 1 BSA ile bölümleri yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> İkincil antikor inkübasyonu. <ol><li> Her bir slayt için 100 uL ikincil antikor karışımı hazırlayın. 1x PBS içinde% 4 BSA içinde keçi anti-tavşan 488 (5 μg / mL) ve keçi anti-fare 594 (5 μg / mL) çözün. NOT: Florokrom ağartmayı önlemek için ışığa aşırı maruz bırakmaktan kaçının. Karanlıkta aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> Bölümleri ikincil antikor karışımı ile oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. </li><li> İkincil antikor karışımı çıkarın ve 5-7 dakika boyunca bölümleri 1x PBS ile yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> Birincil antikor kuluçka. <ol><li> Lamini inceltinHer bir slayt için 100 uL karışım kullanılarak 1x PBS içinde% 4 BSA içerisinde n-2 (a-2-zincir) monoklonal antikor (0.33 ug / mL). Birinci antikor karışımı içindeki bölümleri oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin. </li></ol></li><li> Yıkar. <ol><li> Primer antikor karışımını çıkarın. </li><li> 10 dakika boyunca 1X PBS&#39;de% 1 BSA ile bölümleri yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> İkincil antikor inkübasyonu. <ol><li> 1X PBS&#39;de% 4 BSA içinde keçi anti-sıçan 647 (5 μg / mL) seyrelterek her slayt için 100 uL ikincil antikor karışımı hazırlayın. Kısımları sekonder antikor karışımı içerisinde oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. </li><li> İkincil antikor karışımı çıkarın ve 5-7 dakika boyunca bölümleri 1x PBS ile yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kuluçka. <ol><li> Her bir slayda 1x PBS&#39;de 200 nL DAPI çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. DAPI özümünü 4 ° C deKaranlık. </li><li> 5-7 dakika boyunca bölümleri 1x PBS ile yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> Montaj lekeli kas parçaları. <ol><li> Fazla yıkama solüsyonunu bölümlerden çıkarın. </li><li> Slayt ortasında lekeli bölümlerde 1x PBS (3: 1) gliserol 10 mcL yerleştirin ve hava kabarcıkları oluşumunu önlemek, bir lamel eklemek. </li></ol></li></ol> 4. Konfokal Mikroskopi Edinimi <ol><li> Görüntü yakalama sistemi ve analitik yazılım ile entegre dört lazer konfokal mikroskop kullanarak görüntüleri elde edin. NOT: MyoD, 594 nm lazer (uyarma: 590 nm, emisyon: 617 nm) için uyartım ile parlak kırmızı-flüoresan boya olan 594 boya ile konjuge edilmiştir. LC3, 488 nm lazer hattına (uyarma: 495 nm, emisyon: 519 nm) uyanlmasıyla uyaran, parlak yeşil-flüoresan bir boya olan 488 boya ile konjuge edilir. Laminin, bir 647 boya ile konjuge edilir.647 nm lazer çizgisine (uyarılma: 650 nm, emisyon: 668 nm) uyanlmasıyla uyarılmış, parlak, uzak-kırmızı-flüoresan bir boya. </li><li> Slaytları mikroskop tepsisinde yerleştirin ve nükleer sinyalleri algılamak için 63X büyütme kullanın. Elle rejeneratif alanlara, kas oluşumuna dayanarak aktif mukavemet alanlarını ortalayarak odaklayın (bkz. Şekil 4 ). NOT: Miyofibre büyüklüğü hemen hemen sabitken ( Şekil 4A ), yaralanmadan kaynaklanan kas yenilenmesi, rejenerasyondan sonra yeni oluşturulmuş lifler olan daha küçük miyofiberlerin ortaya çıkmasıyla anlaşılabilir. Dahası, aktif rejenerasyondaki kas, makrofajlardan, fibro-adipojenik prekürsörlerden ve hasar gören kaslara lokalize olan kas rejenerasyonunu düzenleyen hücrelerden oluşan geniş bir sızıntı ile karakterizedir ( Şekil 4B ). </li><li> Yeniden oluşturulan immünofloresan boyayı değerlendirinMiyofiberlerinin bazal tabakasının altında bulunan MuSC&#39;lere odaklanarak, </li><li> MyoD boyaması için pozitif olan ve laminin boyaması ile işaretlenmiş miyofiberler içine yerleştirilen MuSC&#39;lere odaklanın (bkz. Şekil 4B , beyaz oklar). </li><li> En az 3 fare / deney grubu kullanın ve her deney grubu için en az 7 alan 63X büyütme görüntüsü elde etmek için mikroskop kullanın. </li><li> Rejeneratif alanlar belirlendikten sonra, DAPI boyama ile odaklanır ve diğer tek kanalları ayarlar. <ol><li> Aşağıdaki mikroskop ayarlarını kullanın: Kanal A594 İğne deliği 1.2 Airy Ünitesi, Kazanç 791; Kanal A488 İğne deliği 1.6 Hava Durumu Birimi, Kazanç 659; Kanal A647 İğne deliği 1.4 Hava Yolu Ünitesi, Kazanç 719. </li></ol></li><li> Tek kanalların odağını ayarladıktan sonra, görüntüleri 1,024 x 1,024 çerçeve boyutunda ve 12,61 μs piksel sürede elde etmeye devam edin. </li><li> MyoD pozitif hücrelerin yüzdesini sayın (tLC3 negatif olan yeri ve lamina altında doğru konumu belirtir) ve bir LC3 sinyali gösteren MyoD pozitif hücrelerin yüzdesi. NOT: LC3 boyaması gösteren MyoD-pozitif hücrelerin yüzdesi, bu protokolün okunmasıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Bentzinger, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+skeletal+muscles+to+mTORC1+signaling+during+atrophy+and+hypertrophy.">Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy.</a> Skelet Muscle. 3 (1), (2013).</li><li>Chakkalakal, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aged+niche+disrupts+muscle+stem+cell+quiescence.">The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence.</a> Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).</li><li>Jang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+stem+cells:+effects+of+aging+and+metabolism+on+muscle+regenerative+function.">Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).</li><li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence.">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).</li><li>Collins, C. A., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+the+adult+skeletal+muscle+satellite+cell.">Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell.</a> Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).</li><li>Bentzinger, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche.">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li><li>Bernet, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+MAPK+signaling+underlies+a+cell-autonomous+loss+of+stem+cell+self-renewal+in+skeletal+muscle+of+aged+mice.">p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice.</a> Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).</li><li>Cosgrove, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rejuvenation+of+the+muscle+stem+cell+population+restores+strength+to+injured+aged+muscles.">Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles.</a> Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).</li><li>Sousa-Victor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geriatric+muscle+stem+cells+switch+reversible+quiescence+into+senescence.">Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence.</a> Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).</li><li>Madaro, L., Latella, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forever+young:+rejuvenating+muscle+satellite+cells.">Forever young: rejuvenating muscle satellite cells.</a> Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).</li><li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function.">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li><li>Tierney, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+signaling+controls+satellite+cell+expansion+and+skeletal+muscle+repair.">STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair.</a> Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).</li><li>Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+mesenchymal+stem/progenitor+cells+in+skeletal+muscle:+collaborators+or+saboteurs?.">Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?.</a> FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).</li><li>Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+the+integrated+stress+response.">Autophagy and the integrated stress response.</a> Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).</li><li>Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+for+tissue+homeostasis+and+neuroprotection.">Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection.</a> Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).</li><li>Jiang, P., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+human+diseases.">Autophagy and human diseases.</a> Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).</li><li>Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doctor+Jekyll+and+Mister+Hyde:+autophagy+can+promote+both+cell+survival+and+cell+death.">Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death.</a> Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).</li><li>Basile, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bis-Dehydroxy-Curcumin+triggers+mitochondrial-associated+cell+death+in+human+colon+cancer+cells+through+ER-stress+induced+autophagy.">bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy.</a> PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).</li><li>Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+autophagy:+a+new+metabolic+regulator.">Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator.</a> Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).</li><li>Sandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+skeletal+muscle.">Autophagy in skeletal muscle.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).</li><li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+defective+in+collagen+VI+muscular+dystrophies,+and+its+reactivation+rescues+myofiber+degeneration.">Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration.</a> Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).</li><li>Chrisam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+autophagy+by+spermidine+ameliorates+the+myopathic+defects+of+collagen+VI-null+mice.">Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice.</a> Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).</li><li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+rescues+muscular+dystrophy.">Autophagy induction rescues muscular dystrophy.</a> Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).</li><li>De Palma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+as+a+new+therapeutic+target+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy.</a> Cell Death Dis. 3, e418 (2012).</li><li>Hindi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+TRAF6+at+early+and+late+stages+of+muscle+pathology+in+the+mdx+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).</li><li>Pauly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+activation+stimulates+autophagy+and+ameliorates+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse+diaphragm.">AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm.</a> Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).</li><li>Spitali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+Impaired+in+the+Tibialis+Anterior+of+Dystrophin+Null+Mice.">Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice.</a> PLoS Curr. 5, (2013).</li><li>Whitehead, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autophagy+as+a+potential+mechanism+for+the+improved+physiological+function+by+simvastatin+in+muscular+dystrophy.">Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy.</a> Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).</li><li>Whitehead, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+therapeutic+effect+of+simvastatin+revealed+by+functional+improvement+in+muscular+dystrophy.">A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).</li><li>Fiacco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+regulates+satellite+cell+ability+to+regenerate+normal+and+dystrophic+muscles.">Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles.</a> Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).</li><li>Lee, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+NAD-dependent+deacetylase+Sirt1+in+the+regulation+of+autophagy.">A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).</li><li>Rubinsztein, D. C., Mari&#241;o, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging.">Autophagy and aging.</a> Cell. 146 (5), 682-695 (2011).</li><li>Colman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+delays+disease+onset+and+mortality+in+rhesus+monkeys.">Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys.</a> Science. 325 (5937), 201-204 (2009).</li><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132 (1), 27-42 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Calorie+Restriction+Enhances+Cellular+Quality-Control+Processes+in+Human+Skeletal+Muscle.">Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle.</a> Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).</li><li>Wenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+muscle+PGC-1alpha+expression+protects+from+sarcopenia+and+metabolic+disease+during+aging.">Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).</li><li>Carnio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Impairment+in+Muscle+Induces+Neuromuscular+Junction+Degeneration+and+Precocious+Aging.">Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging.</a> Cell Rep. , (2014).</li><li>Sandri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misregulation+of+autophagy+and+protein+degradation+systems+in+myopathies+and+muscular+dystrophies.">Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).</li><li>Cerletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+calorie+restriction+enhances+skeletal+muscle+stem+cell+function.">Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).</li><li>Gopinath, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3+promotes+quiescence+in+adult+muscle+stem+cells+during+the+process+of+self-renewal.">FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).</li><li>Tang, A. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+autophagy+supports+the+bioenergetic+demands+of+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation.</a> EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).</li><li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+maintains+stemness+by+preventing+senescence.">Autophagy maintains stemness by preventing senescence.</a> Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok

<html> Bu protokol telafi edici kas rejenerasyonu sırasında iskelet kası kök hücrelerinde otofajinin nasıl izleneceğini açıklamaktadır. LC3 ve MyoD&#39;nin birlikte lekelenmesi için çeşitli antikorlar denendi ve fare dokusu kesitlerinde çalışan ve başarılı sonuçlar oluşturan antikorlar burada listelenmiştir (bkz. Malzeme Tablosu ). Başarılı bir boyama için metanol ile permeabilizasyon (bkz. Adım 3.2.2) önerilir. Bu protokolün sınırlandırılması, en az 3 farenin / deney grubunun kullanımını zorlayan, farelerin içsel değişkenliği ile bağlantılıdır. Bu metodoloji, iskelet kası yenilenmesi sırasında otofajinin ilerlemesine bir adım önermektedir; sonuçların çoğu Şimdi izole edilmiş hücrelerde yapıldı. Yerinde yapılan analiz, otofaji gibi metabolik süreçleri etkileyebilecek bir hücre izolasyonuna ihtiyaç duymadan, otofajinin doğal ortamda incelenmesine izin verdi. &quot;&gt; Otofajik işlemin son derece dinamik doğası göz önüne alındığında, CLQ tedavileri, otofajik işlemi in vivo olarak izlemek için kritik bir adımdır CLQ, otofajik devam ettiği zaman LC3 birikimine yol açan otofajik işlemin sonraki aşamalarını engellediğinden, CLQ tedavisi LC3&#39;ü in situ inceleme ile saptanabilir hale getirir.Multranızlaşmış iskelet kaslarında, bazal otofajik süreç, tespit edilebilir LC3 birikimi olmadığı için ortaya çıktığı gibi, CLQ tedavisi ile daha da artmaz.Ancak, yeniden canlandırıcı kaslarda, LC3, CLQ tedavisi üzerine birikir ve otofajik aktivasyonu gösterir Kritik bir adım, sabahları aynı saatte ( yani saat 10: 00&#39;da) farelerden kurtulmaktır Protokoldeki bir diğer kritik adım, MuSC&#39;nin tanımlanmasıdır; bu MuSC, hasar gören kasları dolduran başka bir hücresel tipli ile değiştirilmemelidir. Rejeneratif cevap .MyOD pozitifliğini gösteren bazal lamina altındaki MuSC&#39;lerin tanımlanması, kEy uydu hücrelere odaklanmak için. Özetle, MKK&#39;larda otofajik işlemin rolünü tespit etmek için uygun bir yerinde yöntem sunmaktayız. Bu teknik, normal ve patolojik koşullarda iskelet kası yenilenmesini iyileştirmek için kullanılabilecek otofaji modülasyonuna yönelik farmakolojik yaklaşımların testleri için temel oluşturabilir.

İskelet kası rejenerasyonu, yetişkin kök hücreler (Kas Uydu Hücreleri, MuSCs) ve rejeneratif süreçte yer alan diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimin bir sonucudur. Kasların homeostazı ve işlevselliği, kas nişinden ve sistemik ipuçlarından 1 , 2 oluşan kombine sinyaller tarafından sağlanır. Yaşam boyu MuSC işlevselliği, kas nişindeki değişiklikler ve sistemik ipuçları bildirildi ve yaşlılarda fonksiyonel kapasitelerin azalmasına neden oldu3. MuSC&#39;ler bazal tabakanın altında bir niş halinde bulunur ve kas hasarına bağlı olarak hasar görmüş kasları onarmak için harekete geçirilir 4 , 5 . Üretken bir rejeneratif tepki sağlamak için, MuSC&#39;lerin sessizliğe, kendi kendini yenilemeye ve proliferatif genişleme aşaması için gerekli olan farklı süreçleri koordine etmeleri çok önemlidirMiyojenik farklılaşma ile 6 . Yaşlılarda ve kas kronik hastalıklarında, bu işlevlerin tümüyle tehlikeye girer ve kas işlevlerinde değişikliklere yol açar 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Macroautophagy (bundan böyle otofaji olarak anılacaktır), doku homeostazını korumak için hayati bir biyolojik süreç olarak ortaya çıkmaktadır14. Otofajik süreç, sitoplazmanın, organellerin ve proteinlerin kısımlarının sonunda lizozom yolu ile bozunduğu toksik moleküllerin çıkarılmasını ve makromolefin geri dönüşümünü teşvik eden kaçakçılık mekanizmalarını kapsarcules. Bu, stres veya diğer olumsuz koşullar altında hücre ve doku adaptasyonunu desteklemek için enerji açısından zengin bileşikler sağlar 15 , 16 . Otofajy, hücre sağkalımı aktivitesi ile birlikte, hücre dokusu bağlamına ( örn. Kanser dokusuna karşı normal) ve stres uyarımının tipine ( 17 , 18 ) bağlı olarak bir hücre ölüm indüksiyonu olarak da çalışabilir. Yeni kanıtlar, kas kütlesi ve miyofiber bütünlüğünü korumak için otofajinin gerekli olduğunu göstermektedir 19,20 ve Duchenne Musküler Distrofi (DMD) dahil olmak üzere farklı kas distrofileri 21 , 22 , 23&#39;de bozulmuş olduğu bildirilmiştir 24 , 25 , 26 , 27 </suBenzer şekilde, kas kütlesi kaybına (sarkopenik olarak) 32 , 33 , 34 , 35 yaşlarında yaşlılarda otofajik progresifin ilerleyici bir azalması gözlemlenmiştir ( 32 , 33 , 34 , 35 ) , 35 , 36 , 37 ve myofiber sağkalımda 38 . Otofaji ile iskelet kasının rejeneratif potansiyeli arasındaki yakın ilişki Wagers laboratuarında yapılan bir çalışmada öngörüldü ve kalori kısıtlamasının MuSC&#39;nin kullanılabilirliğini ve aktivitesini arttırdığını gösterdi 39 . Bu hayırFoxo3-Notch ekseni, kendi kendine yenileme 40 sırasında otofajik işlemi aktive etti ve MuSC geçişi durdurma durumundan prolifere hale getirme durumuna geçtiğine dair son gözlem tarafından desteklendi 41 . Bu veriler, genç yaşlı ve geriatrik MuSC&#39;lere bazal otofajinin kademeli olarak azaltılması ve 42 yaşındaki MUHS&#39;lerin sayısal ve fonksiyonel düşüşüyle ​​birlikte kabul edilmektedir. Yeni bir makalede, otofaji ile DMD progresyonunun erken safhalarını ayıran telafi edici kas rejenerasyonu arasında yakın bir ilişki olduğunu gösterdik. Buna göre, kas yenilenmesinden ödün verildiğinde ve fibrotik doku birikimi oluştuğunda, hastalığın ilerlemesinin ilerleyen aşamalarında azaltılmış otofajik akı bulduk. İlginçtir ki, yenilenen koşullarda otofajinin MuSC&#39;lerde aktive edildiğini ve otofajik süreci modüle etmenin MuSC aktivasyonunu ve fu&#39;yu etkilediğini gösterdikNasyonellik 30 . Tamamı, bu veriler normal ve patolojik koşullarda ve ömrü boyunca kas yenilenmesi sırasında MuSC&#39;lerde otofajik süreci araştırmanın aciliyetini vurguluyor. Burada, kas yenileme koşullarında MuSC&#39;lerde otofajik işlemi izleyen bir protokol, otofajinin 43&#39;ü olan mikrotübüle bağlı protein 1A / 1B-hafif zincir 3 (LC3) ve MyoD&#39;nin bir markörü olan in situ immün boyama işlemi gerçekleştirerek Miyogenik soy, kontrol ve yaralı farelerin kas dokusu bölümlerinde. Bildirilen metodoloji, kas rejenerasyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan MuSC adlı belirli bir hücre bölmesindeki otofajik sürecin izlenmesine izin verir.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>WT mice</td></tr><tr><td>Cardiotoxin 1</td><td>Latoxan</td><td>L8102</td><td></td></tr><tr><td>Millex-VV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td>Syringe Filter Unit, 0.1 &amp;micro;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628</td><td>Caution:&lt;br/&gt; Harmful if swallowed</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine + 0.5 mL</td><td>BD</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Intermediate</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS32</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution, alcoholic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>o-Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1040</td><td>Caution:&lt;br/&gt; Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Caution:&lt;br/&gt; Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer</td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt - Quick-hardening mounting medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>LC3B Antibody</td><td>Cell signaling Technology</td><td>2775</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal mouse anti-MyoD&lt;br/&gt; (concentrated) clone 5.8A</td><td>DAKO - Agilent Pathology Solutions</td><td>M3512</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-2 (&amp;alpha;-2-chain) monoclonal antibody</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>4H8-2</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21248</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ immunofluorescent staining of autophagy in muscle stem cells

Artan kanıtlar, doku homeostazını korumak için önemli bir düzenleyici süreç olarak otofajiye işaret ediyor. Otofajinin iskelet kası gelişiminde ve yenilenmesinde rol aldığı bilinmektedir ve otofajik süreç birkaç kas patolojisinde ve yaşla ilgili kas bozukluklarında tanımlanmıştır. Otofajik işlemin kısa bir süre önce açıklanan, kas onarımında uydu hücrelerinin işlevsel tükenişiyle ilişkili olan bloğu, aktif otofajinin üretken kas rejenerasyonu ile birleştiğini desteklemektedir. Bu veriler, kas distrofileri gibi hem normal hem de patolojik koşullarda kas rejenerasyonu sırasında uydu hücresinin aktivasyonunda otofajinin önemli rolünü ortaya çıkarmaktadır. Burada, kas rejeneratif koşulları sırasında yetişkin Kas Hücresi (MuSC) bölmesindeki otofajik süreci izlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol LC3&#39;ün in situ immünofloresans görüntülemesini gerçekleştirmek için kurulum metodolojisini açıklamaktadır.Utofagy markeri ve MyoD, miyojenik soy işaretleyicisini, kontrol ve hasar gören farelerdeki kas dokusu kesitleri içinde göstermektedir. Bildirilen metodoloji, kas rejenerasyonunun düzenlenmesinde merkezi bir rol oynayan bir özel hücre bölmesindeki MuSC bölmesindeki otofajik prosedürün izlenmesine izin verir.

Bu protokol, kas rejenerasyonu sırasında MuSC&#39;lerde otofajiyi saptamak için etkin bir in situ metodu tarif eder. CTX In Vivo Tedaviler: TA kaslarındaki kas hasarını uyandırmak ve kontrolsüz kasları kontrol olarak kullanmak için CTX kullanın. Otofaji oldukça dinamik olduğu için, CLP&#39;nin IP enjeksiyonları gerçekleştirerek otofajik akıyı bloke edin ( Şekil 1 ). Otofajik akının aktif olup olmadığının veya bazal seviyelerde tutulmasının değerlendirilmesi için CLQ tedavisi gereklidir. Tibialis Ön İzolasyon: TA kasını Şekil 2&#39;de açıklandığı gibi izole edin ve daha sonra çapraz kas dokusu bölümleri elde etmek için NS yönünde bir kalıp bölmesine yerleştirin. Bu adımBölümlere erişmek ve miyofiber bazal tabakanın altında uygun yerlerde MuSC&#39;leri belirlemek için çok önemlidir. CTX kaynaklı kas hasarının histolojik incelenmesi Kas yaralanmasının histolojik boyama yaparak oluştuğunu doğrulayın. H &amp; E boyama yapın ve 10X büyütme altında kontrol edin: rahatsız edici olmayan kaslar genellikle değişmez miyofiber boyutları sergilerken, yaralı kasların tipik özellikleri, boyutları farklı olan ve inflamatuar infiltratı farklı olan miyofiberlerin bozulmasını içerir. Rejeneratif işlemin gerçekleştiğini doğrulamak için bir başka parametre, morfofarmanın merkezsiz çekirdeklenmesidir ve bu da pertürbasyonsuz kaslarda yoktur ve aktif rejenerasyon geçiren farelerde yeni liflerin oluşumunun bir işaretidir ( Şekil 3 ). Otofaji MyoD-po ile birleştirilirKas Gelişiminde Sitive Hücreler: Bir LC3 sinyali gösteren MyoD pozitif olarak tanımlanan MuSC&#39;leri tespit etmek için immünofloresan boyama uygulayın. Lamininin boyanması, Mucevherleri bazal laminanın altındaki nişte uygun konumda konumlandırmak için yararlıdır ( Şekil 4 ). Otofajik bazal düzeyler, sarsılmamış iskelet kaslarını ayırt eder ve kas rejenerasyonu ile rastlantısal olarak artar 30 . Buna göre, yaralanmamış fareler, MyoD-pozitif hücrelerin olmaması ve hiçbir LC3 sinyali bulunmayan herhangi bir MuSC aktivasyonu göstermez. Aksine kas hasarına bağlı olarak, MyoD pozitif MuSC&#39;ler LC3 için pozitif hale gelir ve aktifleştirilmiş uydu hücrelerinde kas rejenerasyonu sırasında otofajik sürecin aktive olduğunu gösterir. Rejeneratif cevabın başlangıç ​​aşamalarında, farklı hücresel tipler tInflamatuvar hücreler ve fibro-adipojenik prekürsörler de dahil olmak üzere lezyon, yaralı alanı yoğun bir şekilde kalabalık hale getirir. Miyofiber tabakanın altındaki MuSC konumuna odaklanarak ve MyoD pozitifliğine dayanarak, tüm farklı hücresel tipleri ayırt etmek önemlidir. Bazal koşullarda, LC3 her yerde bulunur ve immünofloresan ile zar zor tespit edilir. Yüksek otofajinin bir sonucu olarak, bu boyama paterni değişir ve esas olarak sitoplazmada saptanabilir hale gelir. MyoD / LC3 boyamasını değerlendirirken, MuSC&#39;lerin küçük hücreler olduğunu ve sitoplazmik bölgenin sınırlı olduğunu; Bu nedenle LC3 perinükleer görünebilir. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55908/55908fig1.jpg" /> Şekil 1: In vivo Tedavilerde CTX. ( A ) Kas hasarını indüklemek için, 10 uM CTX direc2 aylık WT fare- lerinin sol TA kaslarında görüldü. Karşı tarafı bir kontrol olarak kullanın. ( B ) Kardiyotoksin kaynaklı kas hasarının şematik gösterimi. Yaralanmadan 24 saat sonra fareleri 4 günde bir 24 saat boyunca 50 mg / kg CLQ enjeksiyonu ile tedavi edin ve sonra hayvanları feda edin. Tedavi edilmemiş yaralanmamış ve yaralı fareler kontrol olarak kullanın. Bu protokol, kas rejenerasyonu sırasında otofajik sürecin tutulumunun incelenmesine izin verir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55908/55908fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55908/55908fig2.jpg" /> Şekil 2: TA İzolasyonu. ( A ) TA&#39;nın izole edilmeden önce göründüğü şeklindeki temsilci görüntüsü. ( B ) Distal tendonu kestikten sonra TA kasını tendonla tutun ve dikkatli olunKası proksimal uca doğru (diz yakınında) çekin. ( C ) EDL&#39;yi, EDL&#39;den daha büyük ve yüzeysel olan TA kasından ayırt edin. İki distal tendonu ters yönde çekerek TA&#39;yı EDL kasından ayırın. ( D ) TA izole edildikten sonra, tarif edildiği gibi NS yönünde kalıp odasına yerleştirin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55908/55908fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55908/55908fig3.jpg" /> Şekil 3: CTX, Kas Hasarını İndükler. Kontrolten, hasar görmemiş ( A ) ve 5 d pi ( B ) WT farelerinden TA transversal doku kesitleri üzerindeki H &amp; E boyamasının temsili görüntüleri. H &amp; E boyama, kontrol farelerinde ( A ) ve massivde normal lif morfolojisini açığa çıkarırKas hasarı ve yaralı kaslara sızma ( B ), CTX enjeksiyonu üzerine bozulmuş morfolojiyi gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55908/55908fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55908/55908fig4.jpg" /> Şekil 4: Otofaji, Kas Yenilenmesi Sırasında MyoD Pozitif Hücrelerle Birleştirilir. LC3 (yeşil) ve MyoD (kırmızı) ile immünosente edilen kontrol ( A ) ve yaralı ( B ) WT farelerinden alınan TA bölümlerinin temsili görüntüleri. Laminin (camgöbeği) boyama, kas liflerine işaret eder ve çekirdekler, DAPI (beyaz) ile zıt renk alır. Sağ paneller birleştirme sinyalinin temsili görüntülerini gösterir. Beyaz oklar, laminin boyaması ile işaretlenmiş lifin bazal laminasında bulunan uydu hücrelerini belirtmektedir. TakipNg protokolü MyoD ile işaretlenmiş miyojenik soyları olan kas kök hücrelerinde LC3 boyaması yoluyla otofajiyi ölçmeye izin verir. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55908/55908fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells at JoVE.com

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Aktif otofaji, Kas Kök Hücresi (MuSC) aktivasyonu için gerekli olan üretken kas rejenerasyonu ile ilişkilidir. Burada, LC3&#39;ün in situ tespiti için bir protokol sunuyoruz, kontrol ve yaralı farelerdeki kas dokusu bölümlerinin MyoD pozitif MuSC&#39;lerinde bir otofaji markörü.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

in-situ-immunofluorescent-staining-of-autophagy-in-muscle-stem-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

10.1K Görüntüleme.  Italian National Research Council.  Aktif otofaji, Kas Kök Hücresi (MuSC) aktivasyonu için gerekli olan üretken kas rejenerasyonu ile ilişkilidir. Burada, LC3'ün in situ tespiti için bir protokol sunuyoruz, kontrol ve yaralı farelerdeki kas dokusu bölümlerinin MyoD pozitif MuSC'lerinde bir otofaji markörü. 

Video: In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via the lysosome and are recycled. During autophagy, cytoplasmic LC3 protein is lipidated and recruited to the autophagosomal membranes. The autophagosome then fuses with the lysosome to form the autolysosome, where the breakdown of the autophagosome vesicle and its contents occurs. The ubiquitin-associated protein p62, which binds to LC3, is also used to monitor autophagic flux. Cells undergoing autophagy should demonstrate the co-localization of p62, LC3, and lysosomal markers. Immunofluorescence microscopy has been used to visually identify LC3 puncta, p62, and/or lysosomes on a per-cell basis. However, an objective and statistically rigorous assessment can be difficult to obtain. To overcome these problems, multispectral imaging flow cytometry was used along with an analytical feature that compares the bright detail images from three autophagy markers (LC3, p62 and lysosomal LAMP1) and quantifies their co-localization, in combination with LC3 spot counting to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Here, multispectral imaging flow cytometry with an analytical feature that compares bright detail images of 3 autophagy markers and quantifies their co-localization, along with LC3 spot counting, was used to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. Therapeutic options addressing the causes of muscular dystrophy pathogenesis are expected to alleviate muscle degeneration. Therefore, a method to assay and quantify the extent of cell death in muscle biopsies is needed. Conventional methods to observe myofiber degeneration in situ are either poorly quantitative or rely on the injection of vital dyes. In this article, an immunofluorescence protocol is described that stains necrotic myofibers by targeting immunoglobulin G (IgG) uptake by myofibers. The IgG uptake method is based on cell features characterizing the necrotic demise, including 1) the loss of plasma membrane integrity with the release of damage-associated molecular patterns and 2) the uptake of plasmatic proteins. In murine cross-sections, the co-immunolabelling of myofibers, extracellular matrix proteins, and mouse IgG allows clean and straightforward identification of myofibers with necrotic fate. This simple method is suitable for quantitative analysis and applicable to all species, including human samples, and does not require the injection of vital dye. The staining of necrotic myofibers by IgG uptake can also be paired with other co-immunolabelling.

Described here is a protocol for direct immunolabelling of necrotic myofibers in muscle cryosections. Necrotic cells are permeable to serum proteins, including immunoglobulin G (IgG). Revealing the uptake of IgG by myofibers allows the identification and quantification of myofibers that undergo necrosis regardless of muscle condition.

Kas Biyopsilerinde İmmünlabelling Miyofiber Dejenerasyon

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

Kök hücreleri ve nişlerini kültürlemek için fare iskelet kasının toplanması

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

Yazar Spotlight: Niş Bileşenlerle Hareketsiz Kas Kök Hücrelerini Kültürlemek için Ex Vivo Protokolü 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...