HIV enfeksiyonu saptanabilir virüs ile antiretroviral tedavi gören bireylerde bile bağışıklık disfonksiyonu na neden olur. Bu yöntem bağışıklık yanıtının temel düzenleyicileri olan monosit fonksiyonunun incelenmesine olanak sağlar. Bu tekniği insan birincil monositlerinin izolasyonu, kültürü ve transfeksiyonu için optimize ettik.
Biz HIV enfekte bireylerde bağışıklık disfonksiyonu moleküler mekanizmaları anlamak için bu yöntemi kullanmak, ancak monositler içeren diğer bağışıklık çalışmaları uygulanabilir. Bu insan kanı ile çalışan ilk kez ise, uygun biyogüvenlik protokolleri takip etmek ve muhtemelen bulaşıcı malzeme olarak tüm örnekleri tedavi etmek için unutmayın. Dört 10 mililitre EDTA vakum tüpleri taze insan tam kan 40 mililitre topladıktan sonra, bir biyogüvenlik kabine tek bir 50 mililitre konik propilen tüp içine tüm kan aktarmak için steril tekniği kullanın.
Seçilen bir insan monosit izolasyon kiti üreticinin talimatları na göre, kitten kan tüpüne monosit izolasyon kokteyli iki mililitre ekleyin ve 30 saniye boyunca kiti manyetik boncuk girdap. Kana iki mililitre boncuk ekleyin ve boncukları kanla dikkatlice karıştırmak için 25 mililitrelik serolojik pipet kullanın. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, dört 50 mililitre tüpler arasında eşit kan bölünmüş ve her tüp eki bir milimolar EDTA ile takviye steril PBS 30 mililitre ekleyin.
Plastik 25 mililitre serolojik pipet ile tekrar karıştırın ve tüpleri manyetik tutuculara yerleştirin. 10 dakika sonra, her tüpün merkezinden kırmızı kan hücrelerinin bir mililitreden fazla aspire ve dört yeni 50 mililitre tüpler içine tüp içeriğini dağıtmak için dikkat alarak içeriğini çizmek için bir pipet kullanın. Her tüp girdaplı manyetik boncuk500 ek mikrolitre ekleyin ve yavaşça hücre çözeltisi karıştırın.
Tüpleri, her tüpün merkezinden dört yeni 50 mililitrelik tüpten birine dikkatlice aktarmadan önce beş dakika boyunca manyetik tutuculara geri yerleştirin. Tüm hücre süspansiyonları aktarıldığında, her yeni 50 mililitrelik tüpü mıknatıs tutuculara beş dakika boyunca yerleştirin ve tüp içeriğini üç yeni 50 mililitrelik tüplerden oluşan üçüncü bir sete dikkatlice aktarın. Sonra santrifüj ile hücreleri toplamak ve sayım için steril PBS toplam 10 mililitre dört hücre pelet resuspend.
Sayma sonra, bir kez 10 mililitre başına altıncı hücrelere 10 antibiyotik ve plaka bir mililitre resuspended hücrelerin bir mililitre ile desteklenen bir kez 10 bir biyogüvenlik kabine 35 milimetre plakalar içine askıya aldı. Daha sonra hücreleri kuyu diplerine yapışmasını sağlamak için 30 ila 60 dakika hücre kültürü kuluçka plakaları yerleştirin. M1 benzeri fenotipli makrofajlar için, her plakaya mililitre başına 25 nanogram içeren 100 mikrolitre fetal sığır serumu ekleyin.
M2 benzeri fenotipli makrofajlar için, her plakaya mililitre başına 50 nanogram içeren 100 mikrolitre fetal sığır ekleyin. MikroRNA mimikleri, inhibitörleri veya küçük bir müdahaleci RNA ile monosit transfeksiyon için, transfeksiyon kiti için üreticinin protokolünü izleyerek, tamponda seçilen RNA'ları 10 mikrolitre seyreltilmiş mimik veya inhibitör transfeksiyon başına 10 mikrolitrede son konsantrasyona seyreltin. Transfeksiyon reaktifini hazırlamak için, sağlanan polimerin bir mikrolitresini 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve transfeksiyon başına toplam 91 mikrolitre reaktif elde etmek için kit tarafından sağlanan tamponun 90 mikrolitresini hemen ekleyin.
Girdap naip 3-5 saniye ve pipet 90 mikrolitre transfeksiyon çözeltisi içeren tüp içine seyreltilmiş RNA 10 mikrolitre içeren. Hafif çeşnilen sonra, bir hücre kuyusuna 100 mikrolitre transfeksiyon kompleksi eklemeden önce çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. 37 santigrat derece dört saat sonra, uygun büyüme faktörü içeren tam orta üç mililitre ile orta değiştirin.
Kültürün altıncı gününde, M1 kültürlerinden gelen kültür süpernatanlarını fetal sığır serumu, antibiyotikler, lipopolisakkarit ve interferon gama ile takviye edilmiş üç mililitre orta ile değiştirin ve M2 kültürlerinden süpernatantları fetal sığır serumu, antibiyotikler, M-CSF ve interlökin-4 ile takviye li olarak değiştirin. 24 saatlik kültürden sonra, her bir aktif makrofaj plakasını her yıkama başına taze PBS ile iki kez yıkayın. RNA ve protein analizleri için, serbest bırakılan hücre içeriğinin analizleri için toplanması için doğrudan plakalara iliştirin.
Akış sitometrik analizi için, PBS'de iki milimolar EDTA ile hücreleri 37 santigrat derecede 10 dakika ayırın ve hücreleri plaka diplerinden hafifçe kazıyarak 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine ayırın. Burada CD80 ve CD83 düzeylerinde artmış M1-aktive kontrol ve hasta kaynaklı hücrelerin histogramları ile CD163 ve CD209 düzeylerinde artmış CD163 ve CD209 ile aktive edilmeyen T0 hücrelerine göre gösterilmiştir. İlginçtir, CD80 ve CD83 daha yüksek hiv kaynaklı hücrelere göre kontrol kaynaklı hücrelerde ifade gibi görünüyordu.
Yeni toplanan monositlerin yakın kızılötesi etiketli mikroRNA ile transfeksiyonu, akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi ile belirlenen transfeksiyonun %90'ından daha fazla verim elde etmesini sağlar. Buna ek olarak, transfeksiyon önemli ölçüde hücre olgunlaşma veya transfeksiyon koşulları aşamasından bağımsız olarak hasta kaynaklı veya kontrol hücrelerinin canlılığını azaltmaz. Transfeksiyon, transfeksiyon üzerine hedef genin etkili bir şekilde aşağılanmasına neden olur ve izolasyon sonrası dördüncü gün ve dördüncü gün spesifik küçük müdahale eden RNA ile.
Ayrıca, mikroRNA mimik ile transfected hücreler transfeksiyon olmayan hücreler üzerinde mikroRNA ekspresyonunda 48-72 kat artış gösterirken, transfeksiyon kontrollerinin tümü kayda değer bir değişiklik göstermez. Kaplanmış hücrelerin sayısı hayatta kalmak için çok önemlidir. Biz 35 milimetrelik çanak başına bir milyon hücre öneririz.
Serumsuz ortamda kaplama da büyük ölçüde hücre eki artıracaktır. Bu yöntemle elde edilen hücreler, ilgi çeken ve sağlıklı kontroledilen hastalarda diferansiyel yanıtları incelemek için sitokinler veya büyüme faktörleri ile tedavi edilebilir.
