Bu prosedürün temel amacı, farklı implant yüzeylerindeki mikrofajların kültürü ve karakterizasyonu ve mikrofajların alt tiplerinin karakterizasyonu için kapsamlı bir protokol uygulamaktır. Bu karakterizasyonun bir parçası olarak, gen ekspresyon profillerini, salgı proteinlerini ve hücre yüzeyi belirteçlerini belirlemek için qRT-PCR, EISA ve CLSM dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılır. Sonuçlar, uygulanan protokolün mikrofajları ve implant yüzeylerini polarize etmede ve bunları gen ekspresyonu, salgılanan proteinler ve hücre yüzeyi belirteçlerine dayalı olarak doğru bir şekilde tanımlamada faydasını ve etkinliğini göstermektedir.
Ayrıca, belirteçler, MDM'lerin farklı alt tiplerini ayırt etmek için kullanılabilecek isyan tutarlı ve spesifik ifade kalıplarını tanımlar. Genel olarak, çalışma, başarılı doku rejenerasyon süreçlerini iyileştirmek ve teşvik etmek, implantla ilişkili kronik inflamasyonu önlemek ve başarılı implant entegrasyonunu geliştirmek için immünomodülatör materyallerin geliştirilmesine ve tasarımına katkıda bulunacaktır. Başlamak için, izole edilmiş insan periferik kan mononükleer hücrelerini 15 mililitre önceden ısıtılmış monosit bağlanma ortamında yeniden süspanse edin ve bunları bir T-75 hücre kültürü şişesine aktarın.
Yapışma için hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 90 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, süpernatanı atın ve hücreleri, yapışmayan veya gevşek yapışmış hücreleri çıkarmak için şişeyi hafifçe eğerek% 10 FBS ve% 1 penisilin ve% 1 streptomisin ile desteklenmiş önceden ısıtılmış bir RPMI 1640 Ortamı ile yıkayın. Yapışık hücrelere mililitre makrofaj koloni uyarıcı faktör başına 10 nanogram içeren 15 mililitre tam ortam ekleyin.
Ve farklılaşmayı teşvik etmek için altı gün kuluçkaya yatırın. Farklılaşmadan sonra, kültür ortamını şişeden çıkarın ve hücreleri beş dakika boyunca 10 mililitre PBS ile yıkayın. Yapışma hücrelerini ayırmak için 10 mililitre önceden ısıtılmış hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve 30 dakika inkübe edin.
Ardından, hücreleri serbest bırakmak ve bunları 50 mililitrelik bir tüpe aktarmak için şişeye hafifçe vurun. Kalan hücreleri ayırmak için, şişeye 10 mililitre PBS ekleyin ve hücreleri kazıyın. Ayrılan hücreleri 50 mililitrelik tüpe aktarın.
Ayrılmış hücre süspansiyonunu 300 g'da 10 dakika santrifüjleyin ve hücreleri beş mililitre önceden ısıtılmış tam ortamda yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı atın. Tripan mavisi boyamayı kullanarak, hücre sayısını ve canlılığını belirlemek için bir hemositometredeki hücreleri sayın. Hücre sayısını bir mililitre tam ortam başına 160.000 hücreye ayarlayarak hücre süspansiyonunu hazırlayın.
Daha sonra, biyomateryal diskleri ultrasonik olarak% 70 etanol içinde beş dakika boyunca temizleyin, ardından 30 dakika boyunca% 70 etanol içinde sterilizasyon yapın. Titanyum diskleri kuruttuktan sonra, işlem görmemiş 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve her oyuğa bir mililitre hazırlanmış hücre süspansiyonu ekleyin. M0 makrofajları elde etmek için hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte 48 saat inkübe edin.
M1 polarize makrofajları elde etmek için, 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına interferon gama ve lipopolisakkarit ekleyin. M2 polarizasyonu için interlökin-4 ve interlökin-13 ekleyin. Polarizasyonu indüklemek için hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte 48 saat inkübe edin.
İnsan periferik kan mononükleer hücrelerinden polarize monosit türevi makrofajlar elde ettikten sonra, hücre süpernatanını 1.5 mililitrelik bir tüpte toplayın. Titanyum diski 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın. Hücre süpernatanını 300 g'da beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
Sitokinleri ve kemokinleri, üretici tarafından sağlanan özel talimatlara göre 450 nanometrede ölçün. Standart eğriyi kullanarak salgılanan sitokinlerin veya kemokinlerin konsantrasyonunu hesaplayın. Bikinkoninik asit protein tahlil kitini kullanarak toplam protein miktarını ölçün.
Salgılanan proteinlerin konsantrasyonunu miligram toplam proteine normalleştirin. Polarize makrofajları 800 mikrolitre PBS'de iki kez yıkayın. Diskleri 400 mikrolitre sabitleme tamponunda oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Sabitleme tamponunu çıkardıktan sonra, diskleri 400 mikrolitre PBS'de üç kez yıkayın. Şimdi, spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için diskleri 400 mikrolitre bloke edici tampon ile 30 dakika inkübe edin. Bloke edici tamponu atın ve diskleri 400 mikrolitre boyama tamponunda seyreltilmiş primer antikorlarla bir saat inkübe edin.
Bir saat sonra, birincil antikorları çıkarın ve diskleri 400 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Boyama tamponunda seyreltilmiş etiketli ikincil antikorlar için flor ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneleri yıkama tamponunda her biri üç dakika boyunca üç kez yıkayın.
PBS'ye 10 milimolar DRAQ5 ekleyin ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Ardından, süpernatanı çıkarın ve diskleri PBS ile bir kez yıkayın. Bir damla montaj ortamı ekleyin ve beş dakika sonra kapak camlarını uygulayın ve numunelerin bir saat kurumasını bekleyin.
Kuruduktan sonra kenarları şeffaf oje ile kapatın. Hücrelere genel bir bakış elde etmek için, numuneleri 25X büyütme altında konfokal lazer tarama mikroskobunda görüntüleyin. Yüzey işaretleyicilerinin yapısını ve lokalizasyonunu belirlemek için büyütmeyi 63X olarak değiştirin.
Primer monosit türevli makrofajlar, titanyum yüzeylerde M1 ve M2 makrofajlarına başarılı bir şekilde polarize edildi, CCR7 M1 makrofajlarında ve CD209 M2 makrofajlarında daha güçlü bir şekilde eksprese edildi. qRT-PCR analizi, M1 için yüksek CCR7 ve TNF-alfa ekspresyonu ve M2 için CD209 ve CCL13 ekspresyonu ile hem titanyum hem de örtü kayma yüzeylerinde primer monosit türevi makrofajların başarılı polarizasyonunu gösterdi. Yüksek inflamatuar TNF-alfa sitokin ve CCL13 kemokin seviyeleri, protein seviyesinde M1 ve M2 polarizasyonunu doğruladı.
