Yazarlar Çalışma katılımcıları ve velilerine teşekkür ederiz. Biz de onun ELISpot okuyucu, istatistiksel analiz için Dr Lubo Alexandrov&#39;da erişim için Dr Rejean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) teşekkür etmek istiyorum, ve Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois ve teknik uzman için Martine Caty olur yardım. Le Fonds d&#39;operasyon la Fondation Merkezi de cancérologie Charles-Bruneau tarafından, HS ve PO les projets de recherche clinique et d&#39;Evalution des teknolojileri (CHU Sainte-Justine) dökün, ve Lösemi ve Lenfoma Derneği tarafından hibe tarafından desteklenmektedir Kanada. ISF la Fondation CHU Sainte-Justine ve le Fonds de la recherche du Québec-Sante (FRQS) burs tarafından desteklenmiştir. AJG Mikrobiyoloji, Infectiology ve İmmünoloji, Université de Montréal (Cebrail-Marquis Burslu), FRQS Bölümü burs alıcı oldu, ve Sağlık Kanada Enstitüler RPiyasaları Araştırması (CIHR). NM la Fondation CHU Sainte-Justine, Cole Vakfı ve FRQS tarafından desteklenmiştir.

Bu araştırma protokolü çalışmanın yapıldığı CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Kanada, Kurumsal Etik Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Aydınlatılmış onam aranan ve tüm katılımcıların, ebeveynleri ya da yasal velileriyle elde edilmiştir. Bütün prosedürler gün 1 ve 2 üzerinde gerçekleştirilir (bir laminar akış başlığı altında Kalkış) steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Insan kanı işleme için standart güvenlik prosedürleri kesinlikle uyulmalıdır. 1.. Tabaklar Kaplama <ol><li> Her bir kuyu için, 1 dakika boyunca% 35 etanol içinde 20 ul eklenmesi ile 96 oyuklu MultiScreen IP beyaz ELISpot plakaların altındaki (PVDF) membran geçirgenliği. Zarlar hafifçe saydam olmalıdır. </li><li> Bir mul kullanan; hemen 1 x fosfat tamponlu tuzlu su içinde 200 ul (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4 PBS) ile 3 kere yıkayın gözenekleripipet veya benzeri bir cihaz tichannel. Bu adım, etanol tortuları, hücre yaşayabilirliğini etkilemedi ve yakalama antikoru bağlanmasını olabilir verilen önemlidir. ELISpot plakalar kırılgan ve dikkatle ele alınmalıdır: Bir otomatik plaka yıkayıcı kullanılması tavsiye edilmez. </li><li> Coat 10 ug / ml &#39;lik bir son konsantrasyona PBS içinde 1x seyreltilmiş saflaştırılmış fare anti-insan IFN-γ yakalama antikoru 10 ul ile gözler. Düzenli plastik wrap ile tabak örtün ve 4 ° C&#39;de bir gece inkübe </li></ol> 2.. Plates Engelleme <ol><li> Onları kuru dokunarak, kuyular boşaltın ve 1x PBS 200 ul plakaları 5 kez yıkayın. </li><li> Tam RPMI 1640 ortamı içinde 200 ul ile doldurun ve kuyu (adım engelleme) 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Plakalar 1x PBS 200 ul 5x&#39;e ve hücreler kaplama için hazır olana kadar tam 1x PBS kuyuları tutmak yıkayın. </li></ol> 3.. Hücre Kaplama ve Uyarım <ol><li> P hazırlayınstandart prosedürler kullanılarak Ficoll-Paque üzerinde gradyan santrifüj ile insan venöz kan örneklerinden eripheral kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC). Alternatif olarak, standart yöntemler kullanılarak, sıvı azot altında dondurulmuş PBMC&#39;nin alikotları eritin. Son santrifüjleme, tekrar süspansiyon ml 2 x 10 6 hücre / bir son konsantrasyonda hücre ve bir su ceketi, bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe sonra. </li><li> Inkübatörden PBMC çıkarın ve tam RPMI 1640 ortamı içinde, 5 ml lik bir nihai hacim içinde bunları tekrar süspansiyon. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Serratia marcescens&#39;in gelen genetik olarak endonükleaz 10 ul varlığında PBMC&#39;nin inkübe edin. </li><li> PBMC, 50 ul bir kısım çıkarın ve tripan mavi boya, 50 ul ile karıştırın. Hücrelerin sayısı ve bir hemositometre ve mikroskopik inceleme (boya dışlama yöntemi) kullanılarak% canlılığı tahmin. Hücre sayımı ve hücre viyabilite kutu al değerlendirilmesi için çeşitli otomatik yöntemlerböylece kullanılabilir. PBMC&gt;% 95 uygun olmalıdır. Canlılığı% 95 daha düşük olduğu zaman örnek atın. </li><li> 5 dakika ıskarta yüzer ve 2 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda% 2 (v / v) ile etkisiz hale getirilmiş insan serumu (HIS) ile desteklenmiş AIM-V ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri için 700 x g&#39;de santrifüjleyin PBMC. Uyarım karışımları plakaya ilave kadar 37 ° C&#39;de tutun. </li><li> , Oyuklara her seferinde bir damla, uygun uyarım karışımından 100 ul ekleyin. Aşağıda tarif edildiği gibi üç uyarım karışımları da kullanılabilir olmalıdır: <ol><li> Kullanım AIM-V ortamı,% 2 (v / v) inaktive edilmiş insan serumu (IHS), negatif kontrol ile takviye edilmiştir. </li><li> 0.5 ug / ml, pozitif kontrol olarak) bir son konsantrasyon elde etmek üzere% 2 (v / v) ile takviye edilmiş IHS AIM-V ortamı içinde seyreltilmiş anti-CD3 monoklonal antikoru (klon OKT3) kullanın. </li><li> Γ-ışınlanmış ya biçiminde, VZV antijenleri için (10,000 Gy, 30 dakika maruz kalma süresi) zayıflatılmış aşı, VZV (1350 plak oluşturan birim [PFU] / ml) canlı dilüsyonuAIM-V ortamı içinde 1:200 ted% 2 (v / v) IHS) ya da hemen erken VZV&#39;nin dizisi (IE63) fosfoprotein göre sentezlenen 67 peptidler (15 amino asit kalıntıları) eşmolar bir karışımı ile takviye edilmiş 1 ug . PBMC kültürlerinde 4 gün sonra sitopatik etkilerin gözle görülür yokluğunu izleyerek ışınlama etkinliğini kontrol edin. </li><li> Iki kopya halinde her kuyu hazırlayın. </li></ol></li><li> , Oyuklara her seferinde bir damla, uygun oyuklara aşama 5.4 &#39;de hazırlanan hücre 100 ul ekleyin. Iki kuyu hücre (negatif kontrol) olmadan bırakılmalıdır. Bir su ceketi, bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C&#39;de 20 saat boyunca inkübe edin. , Sallamak, taşımak veya inkübasyon sırasında birbiri üstüne tabak koymayın. </li></ol> 4. Nokta Gelişim ve Algılama <ol><li> Atın hücreleri ve 1 x PBS ile yıkayın plakaları 10x% 0.05 (v / v) Tween 20 (PBST) ile takviye edilmiştir. Tween 20 PVDF bana yapışmış hücreleri ayırmak olurgece boyunca inkübasyonu takiben mbrane. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, 0.5 mg, 100 ul ekle / ml biyotin konjuge edilmiş anti-IFN-γ monoklonal antikor (w / v) inek serum albümini (BSA) ihtiva eden% 0.5 1x PBS içerisinde seyreltilmiş (4S.B3 klon). Oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. </li><li> Oyuklar PBST ile 6x yıkayın ve her bir (ağırlık / hacim),% 0.5 BSA ihtiva eden PBS içinde 1 x 1:1,000 seyreltilmiş alkalin fosfataz ile streptavidin conjugatd 100 ul ilave edin. Kapak plakaları ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Plakalar, PBST ile 3 kez yıkanır ve 1 x PBS ile 3 kez. Bir 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP) / nitro blue tetrazolyum klorid (NBT) alt-tabaka çözeltisi 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> Distile akan su altında plakaları yıkayın. ELISpot levhasının alt bölümü çıkarın ve damıtılmış su ile, zarın her iki tarafında yıkayın. Hava plakaları kurutunuz. </li><li> Kuyuları incelemek ve bir stereoskopik d kullanarak noktalar numaralandırmakissection mikroskop veya otomatik bir nokta sayacını kullanarak plakaları tarayın. Aynı gün incelenebilir edemez ışıktan uzakta plakaları tutun. <ol><li> Karşılık gelen bir çift kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı ortalama ve test kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı, negatif kontrol kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı (hücre yok), çıkarın. </li><li> 10 6 PBMC başına nokta oluşturucu birimlerinin sayısı (SFU) halinde IFN-γ üretimini ifade eder. </li><li> SFU sayısı, negatif kontrol üzerinde&gt; 50, 10 başına 6 PBMC ve 2 standart sapma (SD) ise, bu test numune pozitif düşünün (hücreler + AIM-V ortamı,% 2 (v / v), HIS ile takviye edilmiştir). </li><li> Noktalar sayılacak kadar çoktur olduğunda kuyunun başına 400 SFU bir değer kullanın. </li></ol></li><li> Test ELISpot veriler normal Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak dağıtılan olsun veya olmasın. Veriler normal dağıldığı zaman, Student t tes kullanılarak istatistiksel karşılaştırmalar yapmakt (2 grup) ya da ANOVA ve Bonferroni post-testi (çoklu karşılaştırmalar). Veriler normal dağılım değilseniz, Mann-Whitney U testi (2 grup) ya da Kruskal-Wallis testi ve Dunn post-test (çoklu karşılaştırmalar) kullanın. </li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Değişiklikler ve sorun giderme: IFN-γ ELISpot deneyleri, insan bağışıklık eksikliği virüsü tip 1 (HIV-1), 24,25, hepatit C virüsü (HCV), 26 dahil olmak üzere, mikrobiyal patojenler, çeşitli karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini incelemek için kullanılmıştır, 27, ve Mycobacterium tuberculosis 28,29, sadece birkaç isim. Burada çocuk UCBT alıcıları kurtarma VZV spesifik immün rekonstitüsyon etkenleri tanımlayan ümidiyle, karş...

İlk olarak 1989 yılında gerçekleştirilen UCBT giderek çocuklarda 1, çeşitli neoplastik ve neoplastik olmayan kan hastalıklarının tedavinin bir parçası olarak kullanılmaktadır. VZV iki farklı hastalıklar, suçiçeği (primer enfeksiyon sonrası) ve herpes zoster (reaktivasyonu) neden sitopatik insan alfaherpesvirüs olduğunu. Birincil enfeksiyonu takiben, VZV dorsal kök gangliyon duyu sinirlerinin içinde korunaklı konağın ömrü boyunca devam. UCBT izleyen en çok tehdit eden bulaşıcı komplikasyonlarından biridir VZV 2-4 ile ilişkilidir. Klinik merkezinde, VZV profilaksi yokluğunda, 3 yılda VZV hastalık VZV hastalığının kümülatif insidans postUCBT 46% 2 idi. Bu hastalarda, de novo enfeksiyonu ya VZV reaktivasyonu çoğu, merkezi sinir sistemi, akciğer ve karaciğer 5-7 için iç organ yayılması ile ilişkilidir. Bir sonuç, asiklovir, valasiklovir veya famsiklovire profilaksi yaygın UB ile yönetilmektedir gibiBT alıcıları 8,9. Bununla birlikte, bu tedavi stratejisi dikkate VZV spesifik T lenfositleri ya da VZV spesifik T hücre yanıtlarının sulandırma kinetikleri koruyucu potansiyelini almaz. Uzun vadeli antiherpetic profilaksi genişleyen kullanımı ile ilgili potansiyel sorunları a) hastanın tedavi alması içerir; b) antiviral ilaç direnci 10,11 geliştirilmesi; c) VZV spesifik bağışıklık sulandırma 12,13 bozukluğu. Fonksiyonel VZV spesifik T lenfositlerinin tespiti nakil sonrası dönemde VZV karşı hücre aracılı bağışıklık karşılıklarının izlenmesi, VZV enfeksiyondan uzun süreli koruma varlığı ve geliştirilmiş bir klinik sonuç ile ilişkilidir 4,14,15 için antiviral, daha rasyonel kullanımı neden olabilir VZV&#39;nin yararlanacak hastaların ayırt hekimlerini sağlayarak tedavi bağışıklık sistemi VZV replikasyonu 4,13 kontrol edebilen olanlardan profilaksi. IFN-γ ELISpot deney sistemleri yaygın olarak deneysel ve klinik koşulların çeşitli izleme hücre aracılı bağışıklık tepkileri için kullanılır. Noktalar reaksiyonun yerinde görünür ve istikrarlı bir çökelti oluşacak şekilde, bir kromojenik substratın yarılması aşağıdaki oluşturulur. Her bir nokta ve böylece tek bir sitokin üreten hücrenin ayak izini temsil eder. IFN-γ ELISpot ortak kökenli bir antijen ile in vitro uyarılmaya yanıt olarak IFN-γ üretilmesi için, tek tek hücrelerin ex vivo yeteneğini ölçer değil, ama aynı zamanda, belirli bir hücre popülasyonu 16,17 hücreleri yanıt frekansının bir tahmin sağlar. Yüksek hassasiyet ek olarak, IFN-γ ELISpot antiviral tedavinin başlatılması veya bırakma rehberlik hedefleyen kişiye klinik protokollerin bağlamında muhtemel kullanımı hale gerçekleştirmek için basittir. Bu işlem aşağıda ayrıntılı olarak describes özellikle VZV antijenleri ile elde edilen in vitro uyarımı takiben periferal kan mononükleer hücreleri tarafından IFN-γ üretimini tespit etmek ve ölçmek için tasarlanmış bir ELISPOT deneyi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

Varisella zoster virüsü (VZV) göbek kordon kanı nakli (UCBT) aşağıdaki morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Bu nedenle, antiherpetic profilaksi VZV enfeksiyonu ile ilişkili komplikasyonların önlenmesi için pediatrik UCBT alıcıya sistematik idare, ancak optimal süresini tanımlar hiçbir güçlü, kanıta dayalı görüş birliği yoktur. T hücrelerinin aracılık ettiği bağışıklık UCBT profilaksi muhafaza edilmelidir veya kesilmelidir olup olmadığını olarak endikasyonlar sağlayabilir aşağıdaki VZV spesifik T hücresi tepkilerinin değerlendirilmesi sulandırma, VZV enfeksiyonu kontrolünden sorumlu olduğu için. Bu amaçla, bir VZV belirli bir interferon gamma (IFN-γ) enzim-bağlı immünospot (ELISpot) deneyi ışınlanmış Canlı zayıflatılmış VZV aşısı ile in vitro uyarılmasına karşılık olarak T lenfositler tarafından IFN-γ üretimi karakterize etmek için geliştirilmiştir. Bu tahlil VZV özel c hızlı, tekrarlanabilir ve hassas ölçüm sağlarell klinik ortamda VZV spesifik bağışıklığın sulandırma izlenmesi ve VZV antijenlerine karşı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için uygun bir bağışıklık aracılı.

Yukarıda ayrıntıları verilen IFN-γ ELISpot protokol büyüklüğünü ve VZV 4 karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerinin kalitesini ölçmek için geliştirilen ve laboratuarımızda optimize edilmiştir. VZV antijenin çeşitli kaynaklardan stimülasyon aşaması için kullanılabilir. Bunlar aşağıdakileri içerir: a) VZV den ticari olarak temin edilebilen inaktive edilmiş deterjan özleri Vero hücreleri 18, enfekte olmuş; IE63 15 ve 19 dahil olmak üze...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an IFN-Î³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation at Jo

Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Bu tür tek hücre düzeyinde sitokin üretimi tespit etmek ve T hücre yanıtlarının hem nicel hem de nitel karakterizasyonu sağlanmıştır interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, gibi fonksiyonel deneylerde sahip yeni kuşak varicella zoster karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini ölçmek için kullanılabilir virüsü (VZV).

Göbek Kordon Kanı Transplantasyonu takiben, IFN-γ değerlendirin ELISpot Tahlili Varisella-Zoster Virüs spesifik hücre-aracılı bağışıklık geliştirilmesi

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

development-an-ifn-elispot-assay-to-assess-varicella-zoster-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

15.5K Görüntüleme.  Université de Montréal.  Bu tür tek hücre düzeyinde sitokin üretimi tespit etmek ve T hücre yanıtlarının hem nicel hem de nitel karakterizasyonu sağlanmıştır interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, gibi fonksiyonel deneylerde sahip yeni kuşak varicella zoster karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini ölçmek için kullanılabilir virüsü (VZV). 

Video: Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation