Os autores gostariam de agradecer os participantes do estudo e seus pais. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canadá) para o acesso ao seu leitor ELISpot, Dr. Lubo Alexandrov para análise estatística, e Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois e Martine Caty para especialista técnico assistência. Apoiada por doações de le Fonds d&#39;opération pour les Projets de Recherche et d&#39;Clinique des evalution tecnologias (CHU Sainte-Justine) para HS e PO, por la Fondation Centre de Cancerologie Charles-Bruneau, e pelo Leukemia &amp; Lymphoma Society of Canadá. ISF foi apoiado por bolsas de estudo de la Fondation CHU Sainte-Justine e le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG foi o destinatário de bolsas de estudo do Departamento de Microbiologia, Imunologia &amp; Infecciologia, Université de Montréal (Gabriel-Marquês de Bolsas de Estudo), FRQS, e do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). NM foi apoiado por la Fondation CHU Sainte-Justine, a Fundação Cole, e FRQS.

Este protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética Ética em Pesquisa do CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, no Canadá, onde o estudo foi realizado. O consentimento informado foi procurado e obtido de todos os participantes do estudo, seus pais ou responsáveis ​​legais. Todos os procedimentos realizados nos dias 1 e 2 deve ser realizado sob condições estéreis (isto é, sob uma câmara de fluxo laminar). Procedimentos de segurança padrão para o manuseio de sangue humano devem ser estritamente observados. 1. O revestimento das placas <ol><li> Permeabilizar o difluoreto de polivinilideno (PVDF) de membranas na parte inferior de 96 poços placas ELISpot branco MultiScreen IP, adicionando a cada poço 20 ul de etanol a 35% durante 1 min. Membranas deve tornar-se um pouco translúcido. </li><li> Imediatamente lavar os poços 3 vezes com 200 ul de 1x tampão fosfato salino (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) utilizando uma multichannel pipeta ou dispositivo semelhante. Esta etapa é fundamental, uma vez que os resíduos de álcool pode afetar a viabilidade celular e ligação do anticorpo de captura. Placas ELISpot são frágeis e devem ser manuseados com cuidado: não é recomendado o uso de uma placa de lavadora automática. </li><li> O revestimento das cavidades com 10 pi de rato purificada anticorpo anti-humano de captura de IFN-γ diluída em 1x PBS para uma concentração final de 10 ug / ml. Cubra as placas com filme plástico regular e incubar durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 2. Bloqueio placas <ol><li> Esvaziar os poços, batendo-os secar e lavar placas 5 vezes com 200 mL de PBS 1x. </li><li> Encha as cavidades com 200 ul de meio completo RPMI 1640 e incubar as placas durante 2 horas a 37 ° C (passo de bloqueio). </li><li> Lavar as placas 5 vezes com 200 ul de PBS 1x e manter os poços cheios de PBS 1x até que as células estão prontas a ser revestida. </li></ol> 3. Celular chapeamento e Estimulação <ol><li> Prepare pAs células mononucleares do sangue eripheral (PBMC) a partir de amostras de sangue venoso humano por centrifugação em gradientes de Ficoll-Paque, utilizando procedimentos padrão. Alternativamente, usando métodos padrão, descongelar alíquotas de PBMC congelados em azoto líquido. Após centrifugação os últimos, ressuspender as células em uma concentração final de 2 x 10 6 células / ml e incubar durante a noite a 37 ° C sob uma atmosfera de CO2 a 5% numa incubadora com camisa de água. </li><li> Retirar CMSP da incubadora e ressuspender-los em um volume final de 5 ml de meio completo de RPMI 1640. </li><li> Incubar de PBMC na presença de 10 ul de endonuclease de engenharia genética a partir de Serratia marcescens, durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Retirar uma aliquota de 50 ul de PBMC e misturar-se com 50 ul de corante azul de tripano. Contar as células e avaliar a viabilidade% utilizando um hemocitómetro e exame microscópico (método de exclusão de corante). Vários métodos automatizados para contagem de células e avaliação da viabilidade celular pode alentão ser utilizado. PBMC deve ser&gt; 95% viáveis. Descartar amostra quando a viabilidade for inferior a 95%. </li><li> Centrífuga PBMC a 700 xg durante 5 min, o sobrenadante de descarte, e ressuspender as células em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) de soro humano inactivado (HIS) a uma concentração final de 2 x 10 6 células / ml. Manter a 37 ° C até que as misturas de estimulação são adicionados à placa. </li><li> Adicione às cavidades, uma gota de cada vez, 100 uL da mistura de estimulação adequado. Três misturas de estimulação devem ser utilizados como descrito abaixo: <ol><li> Utilização meio de AIM-V suplementado com 2% (v / v) de soro humano inactivado (IHS) como controlo negativo. </li><li> Use anticorpo monoclonal anti-CD3 (clone OKT3), diluída em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS para uma concentração final de 0,5 ug / ml como controlo positivo). </li><li> Use antigénio VZV, sob a forma de um ou outro irradiadas-γ (10.000 Gy, 30 min de tempo de exposição) vivo atenuado da vacina de VZV (unidades formadoras de placa 1350 UFP [] / ml) diluiçãoted a 1:200 em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS) ou 1 ug de uma mistura equimolar de 67 péptidos (15 resíduos de aminoácidos) sintetizados com base na sequência do VZV imediatamente precoce (IE63) fosfoproteína . Controlar a eficácia da irradiação por monitorização da ausência de sinais visíveis de efeitos citopáticos após 4 dias em culturas de CMSP. </li><li> Prepare todos os poços em duplicado. </li></ol></li><li> Adicione às cavidades, uma gota de cada vez, a 100 ul de células preparado no passo 5.4 aos poços apropriados. Dois poços devem ser deixados sem células (controle negativo). Incubar durante 20 horas a 37 ° C sob uma atmosfera de CO2 a 5% numa incubadora com camisa de água. Não agite, mover ou empilhar as placas em cima uns dos outros durante a incubação. </li></ol> 4. Ponto de Desenvolvimento e Detecção <ol><li> Descartar as células e lava-se as placas 10 vezes com 1x de PBS suplementado com 0,05% (v / v) de Tween 20 (PBST). Tween 20 ajuda a separar as células que aderiram ao PVDF membrane após incubação durante a noite. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 100 ul de 0,5 mg / ml biotina conjugado anticorpo monoclonal anti-IFN-γ (clone 4S.B3) diluído em 1x PBS contendo 0,5% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA). Incubar as placas durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar os poços 6x com PBST e adiciona cada poço 100 ul de estreptavidina conjugatd com fosfatase alcalina diluído 1:1000 em 1x PBS contendo 0,5% (w / v) de BSA. Cobrir as placas e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as placas 3x com PBST e 3x com PBS 1x. Adicionar 100 ul de um fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) nitro solução de substrato / azul de cloreto de tetrazólio (NBT) e incuba-se 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as placas com água corrente destilada. Retirar a parte inferior da placa de ELISpot e lavar ambos os lados da membrana, com água destilada. Air secar os pratos. </li><li> Examinar os poços e enumerar os pontos usando um d estereoscópicomicroscópio issection ou digitalizar as placas utilizando um contador local automatizado. Mantenha as placas ao abrigo da luz, se não podem ser examinados no mesmo dia. <ol><li> Calcule a média dos números de pontos contados em poços em duplicado correspondentes e subtrai o número de manchas contadas nos poços de controlo negativo (ausência de células) a partir do número de pontos contados em poços de teste. </li><li> Expressar a produção de IFN-γ como o número de unidades formadoras de mancha (SFU) por 10 6 PBMC. </li><li> Considere-se que as amostras de teste é positivo se o número de SFU é&gt; 50 por 10 6 PBMC e dois desvios padrão (DP) acima do controlo negativo (meio de células + AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS). </li><li> Use um valor de 400 SFU por bem quando os pontos são numerosas demais para serem contados. </li></ol></li><li> Teste se os dados ELISpot são normalmente distribuídos ou não pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Quando os dados são normalmente distribuídos, realizar comparações estatísticas utilizando tes t de Studentt (2 grupos) ou ANOVA e pós-teste de Bonferroni (comparações múltiplas). Se os dados não são normalmente distribuídos, use o teste de Mann-Whitney (2 grupos) ou Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn (comparações múltiplas). </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Modificações e resolução de problemas: ensaios de IFN-γ ELISpot têm sido usados ​​para avaliar as respostas imunes mediadas por células dirigidas contra uma variedade de agentes patogénicos microbianos, incluindo o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) 24,25, vírus da hepatite C (HCV), 26, 27, e Mycobacterium tuberculosis 28,29, só para citar alguns. Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um ensaio ELISPOT IFN-γ para medir a imunidade celular contr...

Primeiro realizada em 1989, UCBT é cada vez mais utilizado como parte do tratamento de várias doenças do sangue neoplásicas e não-neoplásicas em crianças 1. VZV é um alphaherpesvirus humano citopático que causa duas doenças diferentes, varicela (após a infecção primária) e herpes zoster (após reativação). Após a infecção primária, VZV persiste durante toda a vida do hospedeiro abrigada dentro de nervos sensoriais dos gânglios da raiz dorsal. Uma das complicações infecciosas mais ameaçadores seguintes UCBT está associada com VZV 2-4. No nosso centro clínico, na ausência de VZV profilaxia, a incidência cumulativa de doença VZV VZV doença em 3 anos foi de 46% postUCBT 2. Nesses pacientes, a infecção de novo com ou reativação do VZV é freqüentemente associada com a disseminação visceral para o sistema nervoso central, pulmões e fígado 5-7. Como resultado, o aciclovir, o valaciclovir ou famciclovir profilaxia é vulgarmente administrada em UBDestinatários CT 8,9. No entanto, esta estratégia de tratamento não ter em conta o potencial protector dos linfócitos T específicos de VZV ou a cinética de reconstituição de VZV respostas de células T específicas. Os problemas potenciais associados com o uso crescente de profilaxia anti-herpéticas longo prazo incluem a) overtreatment paciente; b) o desenvolvimento de resistência ao medicamento antiviral 10,11; e c) diminuição da VZV reconstituição imune específica 12,13. Como a detecção de VZV linfócitos T específicos funcionais correlaciona-se com a presença de proteção a longo prazo contra a infecção VZV e melhor evolução clínica 4,14,15, monitoramento mediadas por células respostas imunes dirigidas contra VZV durante o período pós-transplante pode resultar em um uso mais racional de antiviral tratamento, permitindo que os médicos a distinguir os pacientes que se beneficiariam de VZV profilaxia daqueles cujo sistema imunológico é capaz de controlar a replicação VZV 4,13. O ensaio ELISPOT de IFN-γ é amplamente utilizado para a monitorização de células de respostas imunes mediadas por uma variedade de sistemas experimentais e condições clínicas. Pontos são gerados após a clivagem de um substrato cromogénico, gerando um precipitado visível e estável no local da reacção. Cada foco individual representa, assim, a presença de uma célula produtora de citoquina indivíduo. IFN-γ ELISpot não só mede a capacidade das células individuais ex vivo para a produção de IFN-γ em resposta à estimulação in vitro com antigénio relacionado, mas também fornece uma estimativa da frequência de resposta de células numa determinada população celular 16,17. Para além da sua elevada sensibilidade, o IFN-γ ELISpot é simples de realizar, tornando possível a sua utilização no âmbito dos protocolos clínicos personalizados destinados a orientar a iniciação ou paragem do tratamento anti-viral. O procedimento detalhado abaixo descrevendoes um ensaio ELISPOT que é projetado especificamente para detectar e medir a produção de IFN-γ pelas células mononucleares do sangue periférico após estimulação in vitro com antígenos VZV derivados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

A varicela zoster (VZV) é uma importante causa de morbidade e mortalidade após um transplante de sangue do cordão umbilical (UCBT). Por esta razão, a profilaxia anti-herpética é administrado sistematicamente aos destinatários UCBT pediátricas para prevenir as complicações associadas à infecção por VZV, mas não há evidência com base consenso forte, que define a sua duração óptima. Porque a imunidade mediada por células T é responsável pelo controlo de infecção VZV, avaliando a reconstituição de VZV respostas de células T específicas a seguir UCBT poderia fornecer indicações quanto ao facto de a profilaxia deve ser mantido ou pode ser descontinuado. Para este fim, um interferão gama específica de VZV (IFN-γ) enzyme-linked immunospot (ELISPOT) foi desenvolvido para caracterizar a produção de IFN-γ por linfócitos T em resposta à estimulação in vitro com uma vacina de VZV vivo atenuado irradiado. Este ensaio proporciona uma medição rápida, reprodutível e sensível de VZV c específicaell imunidade mediada adequado para o monitoramento da reconstituição da imunidade específica VZV em um ambiente clínico e avaliar a capacidade de resposta imunitária a antigénios VZV.

O protocolo de ELISpot de IFN-γ detalhado acima, foi desenvolvido e optimizado no nosso laboratório para medir a magnitude e a qualidade das respostas celulares imunes mediadas dirigidos contra VZV 4. Várias fontes de antigénio VZV pode ser utilizado para o passo de estimulação. Estes incluem: a) detergentes comercialmente disponíveis extratos inativadas de VZV infectadas células Vero 18; b) piscinas de sobreposição de peptídeos sintéticos a partir de proteínas codificadas VZV específ...

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Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV).

Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

development-an-ifn-elispot-assay-to-assess-varicella-zoster-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

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Vídeo: Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation