著者らは、研究参加者とその保護者に感謝したいと思います。また、統計分析のために、彼のELISPOTリーダー、博士Luboアレクサンドロフへのアクセスのために博士Réjeanラポイント（CHUMノートルダム、モントリオール、カナダ）を感謝したい、とデニス割い、サンドラ·キャロン、シルビーヴァロワや専門家の技術のためのマーティンキャティう援助。ルフォンドール操作LA財団センターデcancérologieチャールズ·ブリュノにより、HSとPOにレprojetsデRECHERCHEクリニークらD&#39;評価に関する研究DES技術（CHUサントジュスティーヌ）を注ぐ、との白血病リンパ腫協会によるからの補助金によってサポートされているカナダ。 ISFは、ラ·財団​​CHUサントジュスティーヌ、ル·フォン·デ·ラ·RECHERCHEデュケベックサンテ（FRQS）からの奨学金によってサポートされていました。 AJGは微生物学、Infectiology＆免疫学教室、モントリオール大学（ガブリエル·マーキス奨学金）、FRQS、健康研究のカナダの協会からの奨学金を受賞したeSearchは（CIHR）。 NMは、ラ·財団​​CHUサントジュスティーヌ、コール財団、FRQSによってサポートされていました。

この研究計画は、研究を行ったCHUサントジュスティーヌ、モントリオール、ケベック、カナダの機関倫理審査委員会によって承認された。インフォームドコンセントを求め、すべての研究参加者、両親または法的保護者から得られた。すべての手順は、1日目に行い、2（層流フードの下で、すなわち ）、無菌条件下で行わなければならない。ヒトの血液を処理するための標準的な安全手順を厳守しなければならない。 1。プレートコーティング<ol><li>各ウェルに1分間、35％エタノールを20μl添加することにより、96ウェルマルチスクリーンIP白色のELISpotプレートの底部にポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜を透過。膜はやや半透明になる必要があります。 </li><li> MULを用いて、直ちに1×リン酸緩衝生理食塩水（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4、pH7.4のPBS）200μlでウェルを3回洗浄するピペットまたは同様のデバイスをtichannel。このステップは、エタノール残基は細胞生存率および捕捉抗体​​の結合に影響を与えることができることが指定されて重要である。 ELISPOTプレートは壊れやすく、取り扱いに注意する必要があります。自動プレート洗浄機の使用はお勧めしません。 </li><li>コー​​ト10μg/ mlの終濃度になるように1×PBSで希釈した精製マウス抗ヒトIFN-γ捕捉抗体​​を10μlでウェル。定期的なプラスチック製のラップでプレートをカバーし、4℃で一晩インキュベート</li></ol> 2。プレートをブロッキング<ol><li>井戸を空に、乾いたそれらをタップし、1X PBS200μlでプレートを5回洗浄する。 </li><li>完全RPMI 1640培地200μlでウェルを満たし、（閉塞工程）、37℃で2時間、プレートをインキュベート。 </li><li>プレートを1X PBS200μlで5回洗浄し、細胞がメッキされる準備が整うまで、フル1X PBSでのウェルを保つ。 </li></ol> 3。細胞播種と刺激<ol><li> Pを準備する標準的な手順を用いて、フィコール·パック勾配での遠心分離によりヒト静脈血サンプルからeripheral血単核細胞（PBMC）。あるいは、標準的な方法を用いて、液体窒素下で凍結PBMCのアリコートを解凍。最後の遠心分離、再懸濁mlの2×10 6細胞/の最終濃度で細胞およびウォータジャケットインキュベーター中5％CO 2雰囲気下37℃で一晩インキュベートした後。 </li><li>インキュベーターからのPBMCを削除し、完全RPMI 1640培地5mlの最終容量で再懸濁します。 </li><li>室温で5分間セラチアから遺伝子工学的にエンドヌクレアーゼを10μlの存在下でPBMCをインキュベートする。 </li><li> PBMCの50μlアリコートを取り出して、トリパンブルー色素を50μlと混合。細胞を計数し、血球計数器および顕微鏡検査（色素排除法）を用いて％生存率を推定する。細胞計数および細胞生存缶らの評価のための様々な自動化された方法そのように使用すること。 PBMCを&gt; 95％生存である必要があります。生存率が95％未満であるときにサンプリング捨てる。 </li><li> 5分間700×gで遠心分離PBMC、上清を捨て、2％を補充したAIM-V培地中で再懸濁細胞（v / v）の2×10 6細胞/ mlの最終濃度で（HIS）ヒト血清を不活性化。刺激の混合物をプレートに添加されるまで、37℃で保管してください。 </li><li> 、ウェルに一度に1滴、適切な刺激混合物100μlを加える。後述するように3つの刺激の混合物が使用されるべきである。 <ol><li>使用AIM-V培地は、2％（v / v）の不活性化ヒト血清（IHS）のような陰性対照を補充した。 </li><li> 0.5μg/ mlの陽性対照として）の最終濃度2％（v / v）のIHSを補充したAIM-V培地中に希釈した抗CD3モノクローナル抗体（クローンOKT3）を使用する。 </li><li> γ線照射のいずれかの形態で、VZV抗原を使用（10,000 Gyを、30分間の曝露時間）は弱毒化VZVワクチン（1,350プラーク形成単位[PFU] / ml）を生きDILUAIM-Vの2％（v / v）のIHSを添加した培地）またはVZV直ちに初期（IE63）リンタンパク質の配列に基づいて合成された67ペプチド（15アミノ酸残基）の等モル混合物を1μgでテッド1:200 。 PBMC培養中の4日後に細胞変性効果の明らかな兆候がないことを監視することで、照射の有効性を制御します。 </li><li>重複してすべてのウェルを準備します。 </li></ol></li><li> 、ウェルに一度に1滴、適切なウェルにステップ5.4で調製した細胞を100μlを加える。 2つの井戸は、細​​胞（ネガティブコントロール）を使用せずにしておきます。ウォータージャケットインキュベーター中で5％CO 2雰囲気下、37℃で20時間インキュベートする。 、振って移動、またはインキュベーション中互いの上にプレートを積み重ねないでください。 </li></ol> 4。スポットの開発と検出<ol><li>セルを廃棄し、1×PBSでプレートを10倍を洗い、0.05％（V / V）のTween 20（PBST）を加えたもの。トゥイーン20をPVDF私に付着した細胞を剥離役立ちます一晩インキュベーション後のmbrane。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、0.5％（w / v）ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する1×PBSで希釈した0.5 mg / mlのビオチンコンジュゲート抗IFN-γモノクローナル抗体（4S.B3クローン）100μlを添加する。室温で2時間、プレートをインキュベート。 </li><li>ウェルをPBSTで6倍および0.5％（w / v）のBSAを含む1×PBS中で1:1,000に希釈したアルカリホスファターゼで各ウェルにストレプトアビジンconjugatd100μlのを追加洗う。プレートを覆い、室温で1時間インキュベートする。 </li><li>プレートをPBSTで3回洗浄し、1×PBSで3回。 5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリルリン酸（BCIP）/ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（NBT）基質溶液100μlを添加し、室温で5分間インキュベートする。 </li><li>蒸留流水でプレートを洗ってください。 ELISPOTプレートの下部を外し、蒸留水で膜の両側を洗う。空気はプレートを乾燥させます。 </li><li>井戸を調べ、立体Dを使用してスポットを列挙issection顕微鏡や自動化されたスポットカウンターを使用して、プレートをスキャンします。彼らは同じ日に検査することができない場合、離れて光からプレートを保管してください。 <ol><li>二連のウェルに対応する計数スポットの数を平均化し、試験ウェルで計数したスポット数から負のコントロールとなるウェル（細胞なし）で計数したスポットの数を差し引く。 </li><li> 10 6 PBMCあたりのスポット形成単位数（SFU）として、IFN-γ産生を発現する。 </li><li> SFUの数は、陰性対照以上&gt; 50〜10あたり6 PBMCおよび2標準偏差（SD）である場合、そのテストサンプルが陽性で考慮する（細胞+ AIM-V培地は、2％（v / v）のIHSを補充した）。 </li><li>スポットがカウントされるには余りにも多数であるとき、ウェルあたり400 SFUの値を使用します。 </li></ol></li><li>エリスポットデータが正常にコルモゴロフ - スミルノフ検定を使用して分散されているか否かをテストする。データが正規分布している場合、スチューデントのt TESを用いて統計的比較を行うT（2グループ）またはANOVAとボンフェローニポストテスト（多重比較）。データが正規分布していない場合には、マン-ホイットニーU検定 （2群）またはクラスカル·ワリス検定およびダンの事後検定（多重比較）を使用する。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

修正およびトラブルシューティング：IFN-γエリスポットアッセイは、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）24,25、C型肝炎ウイルス（HCV）26を含む微生物病原体の種々に対して向けられた細胞性免疫応答を調べるために使用されてきた、 27、および結核菌 28,29は 、ほんの数名に。ここでは、小児UCBT受信者の回復にVZV特異的免疫再構築の相関を定義する希望を?...

1989年に初めて行われ、UCBTは、ますます子供1における種々の新生物および非腫瘍性血液疾患の治療の一部として使用される。 VZVは（再活性化後）2異なる疾患、（一次感染後）水痘や帯状疱疹を引き起こす細胞変性人間アルファヘルペスウイルスである。一次感染後、VZVは後根神経節の感覚神経内守らホストの寿命を通じて持続します。 UCBT次の最も脅かす感染性合併症の一つは、VZV 2-4に関連している。当社の臨床センターでは、VZV予防がない場合には、VZV病のVZV疾患の累積発生率は3年でpostUCBTは46％であった。これらの患者において、 デノボでの感染又はVZVの再活性化は、多くの場合、中枢神経系、肺及び肝臓5-7に内臓の普及に関連している。その結果、アシクロビル、バラシクロビル、またはファムシクロビル予防は、一般的にUBに投与されているCTの受信者8,9。しかしながら、この治療戦略が考慮VZV特異的Tリンパ球またはVZV特異的T細胞応答の再構成の速度論の保護電位をとらない。長期的な抗ヘルペス予防の拡大使用に伴う潜在的な問題）は、患者過剰治療が含まれ; b）は、抗ウイルス薬剤耐性10,11の開発、およびC）VZV特異的免疫再構築12,13の減損。機能のVZV特異的なTリンパ球の検出は、VZV感染と臨床転帰の改善4,14,15からの長期的な保護の存在と相関するので、移植後の期間の間に、VZVに対して向け細胞性免疫応答を監視するウイルスのより合理的な使用をもたらすかもしれませんVZVの恩恵を受ける患者を区別するために医師を可能にすることによる治療は、免疫システムのVZV複製4,13を制御することができるものと予防。 IFN-γELISpotアッセイが広く、実験系および種々の臨床症状のモニタリング細胞媒介性免疫応答のために使用される。スポットは、反応部位に表示され、安定した沈殿物を生成し、発色基質の切断後に生成される。個々のスポットは、それによって個々のサイトカイン産生細胞のフットプリントを表しています。 IFN-γELISpotは、同族抗原とin vitroでの刺激に応答してIFN-γを産生する個々の細胞をex vivoでの能力を測定するだけでなく、所与の細胞集団16,17における細胞応答の頻度の推定値を提供する。その高い感度に加えて、IFN-γELISPOTは、抗ウイルス治療の開始や停止を誘導することを目的とし、個人の臨床プロトコルの文脈で可能なのを利用して、実行するのは簡単である。 describ下に詳述した手順エス具体VZV由来抗原によるインビトロ刺激後の末梢血単核細胞によるIFN-γの産生を検出し、測定するように設計されELISpotアッセイ。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）は、臍帯血移植（UCBT）以下の罹患率および死亡率の重要な原因である。このため、抗ヘルペス予防は、VZV感染に伴う合併症を防ぐために、小児UCBT受信者に体系的に投与されたが、その最適な期間を定義強い、エビデンスに基づくコンセンサスが存在していません。 T細胞媒介性免疫は、UCBTの予防を維持すべきかまたは中止することができるかどうかの指示を提供することができ、以下のVZV特異的T細胞応答の再構成を評価し、VZV感染の制御に関与するからである。そのためには、VZV特定γインターフェロン（IFN-γ）酵素結合免疫（エリスポット）アッセイは、照射された弱毒生VZVワクチンを用いたin vitro刺激に応答してTリンパ球によるIFN-γ産生を特徴づけるために開発されました。このアッセイは、VZV固有のCの、迅速な再現性かつ高感度な測定を提供エル臨床現場でのVZV特異的免疫の再構成を監視し、VZV抗原に対する免疫応答性を評価するのに適した免疫を媒介した。

上記に詳述IFN-γエリスポットプロトコルは大きさおよびVZV 4に対して向け細胞媒介性免疫応答の質を測定するために開発され、我々の研究室で最適化した。 VZV抗原の多様なソースは、刺激工程のために使用することができる。これらは、a）VZVから市販されている洗剤の不活化抽出物は、Vero細胞を18感染 ; IE63 15とORF4 19を含む特定のVZVコードされたタンパク質?...

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Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

単一細胞レベルでのサイトカイン産生を検出し、T細胞応答の両方の定量的および定性的特徴づけを提供するようなγインターフェロン（IFN-γ）のELISpotのような機能アッセイの新規世代水痘帯状疱疹に対して向けられた細胞性免疫応答を評価するために使用することができるウイルス（VZV）。

臍帯血移植後の水痘帯状疱疹ウイルス特異的細胞性免疫を評価するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

development-an-ifn-elispot-assay-to-assess-varicella-zoster-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

15.6K ビュー.  Université de Montréal. 単一細胞レベルでのサイトカイン産生を検出し、T細胞応答の両方の定量的および定性的特徴づけを提供するようなγインターフェロン（IFN-γ）のELISpotのような機能アッセイの新規世代水痘帯状疱疹に対して向けられた細胞性免疫応答を評価するために使用することができるウイルス（VZV）。 

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Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞​​性免疫応答の定量化

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

免疫・感染学

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

臍帯血から細胞傷害性Tリンパ球の拡大をそのターゲットサイトメガロウイルス、エプスタイン - バーウイルス、およびアデノウイルス

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のT細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

ジカ特定診断エピトープの探索

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...