Yazarlar Çalışma katılımcıları ve velilerine teşekkür ederiz. Biz de onun ELISpot okuyucu, istatistiksel analiz için Dr Lubo Alexandrov&#39;da erişim için Dr Rejean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) teşekkür etmek istiyorum, ve Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois ve teknik uzman için Martine Caty olur yardım. Le Fonds d&#39;operasyon la Fondation Merkezi de cancérologie Charles-Bruneau tarafından, HS ve PO les projets de recherche clinique et d&#39;Evalution des teknolojileri (CHU Sainte-Justine) dökün, ve Lösemi ve Lenfoma Derneği tarafından hibe tarafından desteklenmektedir Kanada. ISF la Fondation CHU Sainte-Justine ve le Fonds de la recherche du Québec-Sante (FRQS) burs tarafından desteklenmiştir. AJG Mikrobiyoloji, Infectiology ve İmmünoloji, Université de Montréal (Cebrail-Marquis Burslu), FRQS Bölümü burs alıcı oldu, ve Sağlık Kanada Enstitüler RPiyasaları Araştırması (CIHR). NM la Fondation CHU Sainte-Justine, Cole Vakfı ve FRQS tarafından desteklenmiştir.

Bu araştırma protokolü çalışmanın yapıldığı CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Kanada, Kurumsal Etik Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Aydınlatılmış onam aranan ve tüm katılımcıların, ebeveynleri ya da yasal velileriyle elde edilmiştir. Bütün prosedürler gün 1 ve 2 üzerinde gerçekleştirilir (bir laminar akış başlığı altında Kalkış) steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Insan kanı işleme için standart güvenlik prosedürleri kesinlikle uyulmalıdır. 1.. Tabaklar Kaplama <ol><li> Her bir kuyu için, 1 dakika boyunca% 35 etanol içinde 20 ul eklenmesi ile 96 oyuklu MultiScreen IP beyaz ELISpot plakaların altındaki (PVDF) membran geçirgenliği. Zarlar hafifçe saydam olmalıdır. </li><li> Bir mul kullanan; hemen 1 x fosfat tamponlu tuzlu su içinde 200 ul (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4 PBS) ile 3 kere yıkayın gözenekleripipet veya benzeri bir cihaz tichannel. Bu adım, etanol tortuları, hücre yaşayabilirliğini etkilemedi ve yakalama antikoru bağlanmasını olabilir verilen önemlidir. ELISpot plakalar kırılgan ve dikkatle ele alınmalıdır: Bir otomatik plaka yıkayıcı kullanılması tavsiye edilmez. </li><li> Coat 10 ug / ml &#39;lik bir son konsantrasyona PBS içinde 1x seyreltilmiş saflaştırılmış fare anti-insan IFN-γ yakalama antikoru 10 ul ile gözler. Düzenli plastik wrap ile tabak örtün ve 4 ° C&#39;de bir gece inkübe </li></ol> 2.. Plates Engelleme <ol><li> Onları kuru dokunarak, kuyular boşaltın ve 1x PBS 200 ul plakaları 5 kez yıkayın. </li><li> Tam RPMI 1640 ortamı içinde 200 ul ile doldurun ve kuyu (adım engelleme) 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Plakalar 1x PBS 200 ul 5x&#39;e ve hücreler kaplama için hazır olana kadar tam 1x PBS kuyuları tutmak yıkayın. </li></ol> 3.. Hücre Kaplama ve Uyarım <ol><li> P hazırlayınstandart prosedürler kullanılarak Ficoll-Paque üzerinde gradyan santrifüj ile insan venöz kan örneklerinden eripheral kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC). Alternatif olarak, standart yöntemler kullanılarak, sıvı azot altında dondurulmuş PBMC&#39;nin alikotları eritin. Son santrifüjleme, tekrar süspansiyon ml 2 x 10 6 hücre / bir son konsantrasyonda hücre ve bir su ceketi, bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe sonra. </li><li> Inkübatörden PBMC çıkarın ve tam RPMI 1640 ortamı içinde, 5 ml lik bir nihai hacim içinde bunları tekrar süspansiyon. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Serratia marcescens&#39;in gelen genetik olarak endonükleaz 10 ul varlığında PBMC&#39;nin inkübe edin. </li><li> PBMC, 50 ul bir kısım çıkarın ve tripan mavi boya, 50 ul ile karıştırın. Hücrelerin sayısı ve bir hemositometre ve mikroskopik inceleme (boya dışlama yöntemi) kullanılarak% canlılığı tahmin. Hücre sayımı ve hücre viyabilite kutu al değerlendirilmesi için çeşitli otomatik yöntemlerböylece kullanılabilir. PBMC&gt;% 95 uygun olmalıdır. Canlılığı% 95 daha düşük olduğu zaman örnek atın. </li><li> 5 dakika ıskarta yüzer ve 2 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda% 2 (v / v) ile etkisiz hale getirilmiş insan serumu (HIS) ile desteklenmiş AIM-V ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri için 700 x g&#39;de santrifüjleyin PBMC. Uyarım karışımları plakaya ilave kadar 37 ° C&#39;de tutun. </li><li> , Oyuklara her seferinde bir damla, uygun uyarım karışımından 100 ul ekleyin. Aşağıda tarif edildiği gibi üç uyarım karışımları da kullanılabilir olmalıdır: <ol><li> Kullanım AIM-V ortamı,% 2 (v / v) inaktive edilmiş insan serumu (IHS), negatif kontrol ile takviye edilmiştir. </li><li> 0.5 ug / ml, pozitif kontrol olarak) bir son konsantrasyon elde etmek üzere% 2 (v / v) ile takviye edilmiş IHS AIM-V ortamı içinde seyreltilmiş anti-CD3 monoklonal antikoru (klon OKT3) kullanın. </li><li> Γ-ışınlanmış ya biçiminde, VZV antijenleri için (10,000 Gy, 30 dakika maruz kalma süresi) zayıflatılmış aşı, VZV (1350 plak oluşturan birim [PFU] / ml) canlı dilüsyonuAIM-V ortamı içinde 1:200 ted% 2 (v / v) IHS) ya da hemen erken VZV&#39;nin dizisi (IE63) fosfoprotein göre sentezlenen 67 peptidler (15 amino asit kalıntıları) eşmolar bir karışımı ile takviye edilmiş 1 ug . PBMC kültürlerinde 4 gün sonra sitopatik etkilerin gözle görülür yokluğunu izleyerek ışınlama etkinliğini kontrol edin. </li><li> Iki kopya halinde her kuyu hazırlayın. </li></ol></li><li> , Oyuklara her seferinde bir damla, uygun oyuklara aşama 5.4 &#39;de hazırlanan hücre 100 ul ekleyin. Iki kuyu hücre (negatif kontrol) olmadan bırakılmalıdır. Bir su ceketi, bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C&#39;de 20 saat boyunca inkübe edin. , Sallamak, taşımak veya inkübasyon sırasında birbiri üstüne tabak koymayın. </li></ol> 4. Nokta Gelişim ve Algılama <ol><li> Atın hücreleri ve 1 x PBS ile yıkayın plakaları 10x% 0.05 (v / v) Tween 20 (PBST) ile takviye edilmiştir. Tween 20 PVDF bana yapışmış hücreleri ayırmak olurgece boyunca inkübasyonu takiben mbrane. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, 0.5 mg, 100 ul ekle / ml biyotin konjuge edilmiş anti-IFN-γ monoklonal antikor (w / v) inek serum albümini (BSA) ihtiva eden% 0.5 1x PBS içerisinde seyreltilmiş (4S.B3 klon). Oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. </li><li> Oyuklar PBST ile 6x yıkayın ve her bir (ağırlık / hacim),% 0.5 BSA ihtiva eden PBS içinde 1 x 1:1,000 seyreltilmiş alkalin fosfataz ile streptavidin conjugatd 100 ul ilave edin. Kapak plakaları ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Plakalar, PBST ile 3 kez yıkanır ve 1 x PBS ile 3 kez. Bir 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP) / nitro blue tetrazolyum klorid (NBT) alt-tabaka çözeltisi 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> Distile akan su altında plakaları yıkayın. ELISpot levhasının alt bölümü çıkarın ve damıtılmış su ile, zarın her iki tarafında yıkayın. Hava plakaları kurutunuz. </li><li> Kuyuları incelemek ve bir stereoskopik d kullanarak noktalar numaralandırmakissection mikroskop veya otomatik bir nokta sayacını kullanarak plakaları tarayın. Aynı gün incelenebilir edemez ışıktan uzakta plakaları tutun. <ol><li> Karşılık gelen bir çift kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı ortalama ve test kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı, negatif kontrol kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı (hücre yok), çıkarın. </li><li> 10 6 PBMC başına nokta oluşturucu birimlerinin sayısı (SFU) halinde IFN-γ üretimini ifade eder. </li><li> SFU sayısı, negatif kontrol üzerinde&gt; 50, 10 başına 6 PBMC ve 2 standart sapma (SD) ise, bu test numune pozitif düşünün (hücreler + AIM-V ortamı,% 2 (v / v), HIS ile takviye edilmiştir). </li><li> Noktalar sayılacak kadar çoktur olduğunda kuyunun başına 400 SFU bir değer kullanın. </li></ol></li><li> Test ELISpot veriler normal Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak dağıtılan olsun veya olmasın. Veriler normal dağıldığı zaman, Student t tes kullanılarak istatistiksel karşılaştırmalar yapmakt (2 grup) ya da ANOVA ve Bonferroni post-testi (çoklu karşılaştırmalar). Veriler normal dağılım değilseniz, Mann-Whitney U testi (2 grup) ya da Kruskal-Wallis testi ve Dunn post-test (çoklu karşılaştırmalar) kullanın. </li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Değişiklikler ve sorun giderme: IFN-γ ELISpot deneyleri, insan bağışıklık eksikliği virüsü tip 1 (HIV-1), 24,25, hepatit C virüsü (HCV), 26 dahil olmak üzere, mikrobiyal patojenler, çeşitli karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini incelemek için kullanılmıştır, 27, ve Mycobacterium tuberculosis 28,29, sadece birkaç isim. Burada çocuk UCBT alıcıları kurtarma VZV spesifik immün rekonstitüsyon etkenleri tanımlayan ümidiyle, karş...

İlk olarak 1989 yılında gerçekleştirilen UCBT giderek çocuklarda 1, çeşitli neoplastik ve neoplastik olmayan kan hastalıklarının tedavinin bir parçası olarak kullanılmaktadır. VZV iki farklı hastalıklar, suçiçeği (primer enfeksiyon sonrası) ve herpes zoster (reaktivasyonu) neden sitopatik insan alfaherpesvirüs olduğunu. Birincil enfeksiyonu takiben, VZV dorsal kök gangliyon duyu sinirlerinin içinde korunaklı konağın ömrü boyunca devam. UCBT izleyen en çok tehdit eden bulaşıcı komplikasyonlarından biridir VZV 2-4 ile ilişkilidir. Klinik merkezinde, VZV profilaksi yokluğunda, 3 yılda VZV hastalık VZV hastalığının kümülatif insidans postUCBT 46% 2 idi. Bu hastalarda, de novo enfeksiyonu ya VZV reaktivasyonu çoğu, merkezi sinir sistemi, akciğer ve karaciğer 5-7 için iç organ yayılması ile ilişkilidir. Bir sonuç, asiklovir, valasiklovir veya famsiklovire profilaksi yaygın UB ile yönetilmektedir gibiBT alıcıları 8,9. Bununla birlikte, bu tedavi stratejisi dikkate VZV spesifik T lenfositleri ya da VZV spesifik T hücre yanıtlarının sulandırma kinetikleri koruyucu potansiyelini almaz. Uzun vadeli antiherpetic profilaksi genişleyen kullanımı ile ilgili potansiyel sorunları a) hastanın tedavi alması içerir; b) antiviral ilaç direnci 10,11 geliştirilmesi; c) VZV spesifik bağışıklık sulandırma 12,13 bozukluğu. Fonksiyonel VZV spesifik T lenfositlerinin tespiti nakil sonrası dönemde VZV karşı hücre aracılı bağışıklık karşılıklarının izlenmesi, VZV enfeksiyondan uzun süreli koruma varlığı ve geliştirilmiş bir klinik sonuç ile ilişkilidir 4,14,15 için antiviral, daha rasyonel kullanımı neden olabilir VZV&#39;nin yararlanacak hastaların ayırt hekimlerini sağlayarak tedavi bağışıklık sistemi VZV replikasyonu 4,13 kontrol edebilen olanlardan profilaksi. IFN-γ ELISpot deney sistemleri yaygın olarak deneysel ve klinik koşulların çeşitli izleme hücre aracılı bağışıklık tepkileri için kullanılır. Noktalar reaksiyonun yerinde görünür ve istikrarlı bir çökelti oluşacak şekilde, bir kromojenik substratın yarılması aşağıdaki oluşturulur. Her bir nokta ve böylece tek bir sitokin üreten hücrenin ayak izini temsil eder. IFN-γ ELISpot ortak kökenli bir antijen ile in vitro uyarılmaya yanıt olarak IFN-γ üretilmesi için, tek tek hücrelerin ex vivo yeteneğini ölçer değil, ama aynı zamanda, belirli bir hücre popülasyonu 16,17 hücreleri yanıt frekansının bir tahmin sağlar. Yüksek hassasiyet ek olarak, IFN-γ ELISpot antiviral tedavinin başlatılması veya bırakma rehberlik hedefleyen kişiye klinik protokollerin bağlamında muhtemel kullanımı hale gerçekleştirmek için basittir. Bu işlem aşağıda ayrıntılı olarak describes özellikle VZV antijenleri ile elde edilen in vitro uyarımı takiben periferal kan mononükleer hücreleri tarafından IFN-γ üretimini tespit etmek ve ölçmek için tasarlanmış bir ELISPOT deneyi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

Varisella zoster virüsü (VZV) göbek kordon kanı nakli (UCBT) aşağıdaki morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Bu nedenle, antiherpetic profilaksi VZV enfeksiyonu ile ilişkili komplikasyonların önlenmesi için pediatrik UCBT alıcıya sistematik idare, ancak optimal süresini tanımlar hiçbir güçlü, kanıta dayalı görüş birliği yoktur. T hücrelerinin aracılık ettiği bağışıklık UCBT profilaksi muhafaza edilmelidir veya kesilmelidir olup olmadığını olarak endikasyonlar sağlayabilir aşağıdaki VZV spesifik T hücresi tepkilerinin değerlendirilmesi sulandırma, VZV enfeksiyonu kontrolünden sorumlu olduğu için. Bu amaçla, bir VZV belirli bir interferon gamma (IFN-γ) enzim-bağlı immünospot (ELISpot) deneyi ışınlanmış Canlı zayıflatılmış VZV aşısı ile in vitro uyarılmasına karşılık olarak T lenfositler tarafından IFN-γ üretimi karakterize etmek için geliştirilmiştir. Bu tahlil VZV özel c hızlı, tekrarlanabilir ve hassas ölçüm sağlarell klinik ortamda VZV spesifik bağışıklığın sulandırma izlenmesi ve VZV antijenlerine karşı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için uygun bir bağışıklık aracılı.

Yukarıda ayrıntıları verilen IFN-γ ELISpot protokol büyüklüğünü ve VZV 4 karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerinin kalitesini ölçmek için geliştirilen ve laboratuarımızda optimize edilmiştir. VZV antijenin çeşitli kaynaklardan stimülasyon aşaması için kullanılabilir. Bunlar aşağıdakileri içerir: a) VZV den ticari olarak temin edilebilen inaktive edilmiş deterjan özleri Vero hücreleri 18, enfekte olmuş; IE63 15 ve 19 dahil olmak üze...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an IFN-Î³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation at Jo

Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Bu tür tek hücre düzeyinde sitokin üretimi tespit etmek ve T hücre yanıtlarının hem nicel hem de nitel karakterizasyonu sağlanmıştır interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, gibi fonksiyonel deneylerde sahip yeni kuşak varicella zoster karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini ölçmek için kullanılabilir virüsü (VZV).

Göbek Kordon Kanı Transplantasyonu takiben, IFN-γ değerlendirin ELISpot Tahlili Varisella-Zoster Virüs spesifik hücre-aracılı bağışıklık geliştirilmesi

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

development-an-ifn-elispot-assay-to-assess-varicella-zoster-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

15.5K Görüntüleme.  Université de Montréal.  Bu tür tek hücre düzeyinde sitokin üretimi tespit etmek ve T hücre yanıtlarının hem nicel hem de nitel karakterizasyonu sağlanmıştır interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, gibi fonksiyonel deneylerde sahip yeni kuşak varicella zoster karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini ölçmek için kullanılabilir virüsü (VZV). 

Video: Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi&#39;nin olarak

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...