Bu çalışma CASS Vakfı Bilim ve Tıp Grant tarafından desteklenmiştir; (MB); Avustralya Projesi Hibe Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (KLS, 338516); ve Victoria Hükümeti&#39;nin Operasyonel Altyapı Destek Programı (Avustralya) tarafından.

1.. Hazırlanması Hücreler, Medya ve Reaktifler <ol><li> Metilselüloz-içeren ortam hazırlanması <ol><li> 250 ml&#39;lik bir şişe içerisinde steril Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (hiçbir katkı maddesi), 100 ml metilselüloz 1.5 g çözülür. </li><li> 5 dakika boyunca bir mikrodalga düşük üzerinde çözüm ısıtın; Üzerine kaynar önlemek için dikkat çekmek. </li><li> Metilselüloz toz yarı çözünmüş sonra, 125 ml hacim almak için temiz bir manyetik karıştırıcı ve medya ekleyebilirsiniz. </li><li> , Ters karıştırılır ve bir gece boyunca 4 ° C&#39;de karıştırıldı ve ardından 1.5 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırın. </li><li> Dört adet 50 ml tüpler ve 2300 x g &#39;de 1.5 saat boyunca santrifüje eşit solüsyonu bölün. </li><li> 3 aya kadar 4 ° C&#39;de berrak, yüksek ölçüde zor akışlı, steril bir 50 ml tüpler içine süpernatant (stokunun yaklaşık% 90-95), kısım ve mağaza toplayın. </li></ol></li><li> Kültür ve Hücrelerinin Etiketleme <ol><li> Bir ti içinde tekkat yumurtalık kanseri hücre hatları korumak% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L ile desteklenmiş: 37 ° C, (OVCA429 ve OVCA433 hücre çizgileri için 18 M199 KGN hücreleri 17 ve MCBD110 için DMEM) uygun bir büyüme ortamı içinde,% 5 CO2 de ssue kültürü kuluçka -glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin. </li><li> M199 olarak LP9 insan mezotel hücreleri korumak: Hams F12 ortamı 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ile bir kuluçka makinesi içinde% 15 FBS, 10 ng / ml Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) ve 400 ng / ml hidrokortizon, ihtiva etmektedir. </li><li> Tohum istenen şişe büyüklüğü hücreleri yaklaşık% 75 konfluansa kadar büyür. % 0.05 tripsin / EDTA, 5 dakika boyunca 186 x g sıkma ve iki kez PBS ile yıkayın hücre pelletini kullanılarak hücreler tripsinizasyon ile harmanlayın. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı Floresan Hücre Etiketleme Yöntemi <ol><li> Önceden ısıtılmış PBS/0.1% BSA, 1 ml 1 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda yeniden süspanse kanser hücreleri. </li><li> 5 mM stok Cep Tr 2 ul ekleyinace CSFE çözeltisi (veya uzun süreli muhafaza edilir, diğer tercih edilen hücre etiket) 10 uM bir nihai konsantrasyonda hücrelere ve bir su banyosu içinde 10-15 dakika 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Santrifüj ile,% 10 FBS ve yeniden topak içeren buz gibi soğuk 1 ml ortam maddesi ile reaksiyonu söndürün. Uygun büyüme ortamı, önceden ısıtılmış 10 ml içinde süspanse (adım 1.2.1 bakınız). </li><li> 37 ° C&#39;de, 75 cm 2 filtre-kapaklı bir şişeye ve Tohum kültürü hücreleri,% 5 CO2. </li><li> Floresan etiketleme seviyesinin tespiti için yeterli olduğunu doğrulamak için bir floresan mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Hücreler yaklaşık% 75 konfluensisinin, hasat ulaşmak ve adımlar 1.2.3 ve üzeri 1.2.4 olarak saymak bir kez. </li></ol></li></ol> Metilselülozda küremsi 2.. Üretimi <ol><li> (300000 hücre toplam her biri tam 96 oyuklu bir plaka deney için gereklidir) küremsi oluşturulması için gerekli Bölüm 1 yumurtalık kanseri hücre hacmini hesaplar. Hayırte: Burada sunulan farklı hücre hatları kullanılarak eğer, üniforma sfero üretimi için hücre yoğunlukları her hat için optimize edilmesi gerekebilir. </li><li> Metilselüloz ortam içinde hücrelerin seyreltme hesaplanması için, ilk olarak 15 ml (adım 2.1) gerekli olan hücre hacmini çıkarın. </li><li> , Her bir hücre hattı için kültür ortamı, uygun bir hacme kadar 15 ml eksi hücre hacmine eşit (son% 20 metilselüloz olmak için) ve özenli bir şekilde ters ile iyice karıştırın metilselüloz stok çözeltisinden 3 ml ilave edilir. </li><li> Metilselüloz içeren ortama 300,000 hücreleri ekleyin ve özenli bir şekilde ters ile iyice karıştırılmıştır. </li><li> 37 ° C&#39;de 96 oyuklu bir içbükey alt kültür plakasının ve kültür her oyuğuna (3,000 hücre / kuyu olmak üzere toplam), hücre / metilselüloz / media karışımı pipetle 150 ul,% 5 CO2 1-4 gün boyunca veya üniforma spheroids (1 sfero / iyi tipik olarak izlenmektedir) oluşturmak kadar. </li></ol> 3.. Rtca Hücre Invasion Tahliller HAYIRTE: Empedans okuma hücre içeriği (CI), hücre durumunu temsil eden ölçülmüş hücre empedans göreceli değişimdir boyutsuz bir parametre olarak ifade edilmiştir. Microsoft Excel gibi bir elektronik tablo içine bir analiz için, ithalat verileri,. <ol><li> Tabaka preparasyonu <ol><li> Her seferinde 4 kuyu gruplar halinde, toplam yüzey alanı kapalı olduğundan emin olmak için bir 16-çukurlu RTCA CIM plakanın üst bölmesinin her oyuğuna (serum içermeyen kültür ortamı içinde 1:10 seyreltilmiş) 50 ul matris ekleme . Herhangi bir aşırı sıvı kurtulmak için, yavaş yavaş hemen matris 30 ul çıkarın ama. </li><li> Bir doku kültürü inkübatörü içinde, kullanılmadan önce, 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her bir kanser hücresi, üst bölmeye hattı ve alt bölmeye (deneme tasarım göre) veya serumsuz ortam için uygun 160 ul serum içermeyen ortam (SFM) 30 ul ekle. </li><li> Üst bölme ve equilibr içine alt bölmeyi tıklayarak CIM plaka montebir doku kültürü inkübatörü içinde, 1 saat için bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde yedi. </li></ol></li><li> Rtca Enstrüman Programlama <ol><li> Rtca programını açın ve &#39;Düzen&#39; sekmesini seçin. Tüm deneysel kuyu vurgulayın. </li><li> Sağ kuyular tıklayın ve &#39;kuyu üzerinde açın&#39; seçeneğini; istediğiniz gibi sonra deneysel koşullar ve hücre adlarında doldurun. </li><li> , Programa adımları veya alt basamakları eklemek &#39;bir adım Ekle&#39; &#39;Zamanlama&#39; sekmesini ve sağ tıklayın seçin. İlk adım seçilir &#39;bir adım eklemek&#39; bir kez otomatik olarak programa dahil olan önceden programlanmış bir arka plan süpürme vardır. </li><li> LP9 tek tabaka kurulması sırasında okumaları kaydeder Rtca programı, Adım 2 için istenen program ayrıntılarını girin. &#39;&#39; Interval&#39;ın &#39;sekmesini seçip &#39;15 dk girerek empedans okumaları arasındaki zaman aralıklarını ekleyin. &#39;Süre&#39; sekmesine gelin seçerek deneysel süre ekled 12-24 saat arasında bir zaman giriyor. </li><li> Sonraki adımları eklemek için, &#39;bir adım Ekle&#39; &#39;Zamanlama&#39; sekmesini ve sağ tıklayın seçin ve yukarıdaki gibi, ilave adımların ayrıntılarını girin. Rtca programın Adım 3 sfero işgali sırasında okuma almak için aracı yönlendirecektir; &#39;Süre&#39; sekmesi altında Interval&#39;ın &#39;sekmesi ve &#39;48 saat&#39; altında &#39;&#39;5 dakika girin. </li><li> Menü çubuğundaki &#39;Plaka&#39; seçeneğini seçin ve kaydedin. </li></ol></li><li> Sferoid Invasion LP9 Monolayer ve Ölçüm Üretimi <ol><li> Yukarıdaki Adım 3.2 &#39;den Rtca enstrüman ve açık olan programda CIM plaka koyun. Önce hücreler ekleyerek seçin menü çubuğunda &#39;Yürütme&#39; ve ardından &#39;Start&#39;. Bir arka plan süpürme otomatik (Rtca yazılım talimatları Adım 1) yapılacaktır. </li><li> Bir doku kültürü kaputu arka süpürme ve yerine aşağıdaki cihazdan CIM plakasını sökün. </li><li> Plaka 50,000 LP9 hücreler her CIM plakanın üst bölmesine 160 ul SFM içinde süspansiyon haline getirildi. </li><li> Rtca enstrüman plaka koyun ve LP9 tek tabaka (Rtca programın Adım 2) bir gecede kurulması ise bilgi okunması her 15 dakika sürer. </li><li> Hasat kanser sferoidler, yukarıda, Aşama 2 &#39;Generation metilselülozda küremsi&#39; altında elde. <ol><li> Aseptik, 1 ml pipet üst kapalı 1 mm kesilmiş ve hafifçe de her içeriğini almak için kullanın. Steril bir tüpe aktarın. </li><li> Santrifüj 8 dakika boyunca 120 x g küremsi ve hafif aspirasyonla metilselüloz içeren ortam çıkarın. </li><li> Her yıkamadan sonra sferoidler peletleştirmek için 8 dakika boyunca 120 x g&#39;de santrifüje tabi tutarak, PBS ile iki kez daha küremsilerin yıkayın. </li><li> Her deney için, kuyu, FBS&#39;siz ortamda 160 ul içinde 10 sferoitlerin bir toplam tekrar süspansiyon. </li><li> Menü çubuğundan &#39;Yürütme&#39; seçme ve kontrol tarafından Rtca deneyi Pause# 8216; &#39;Pause. Aletten CIM plakasını çıkarın ve bir doku kültürü kaputu yerleştirin. Her bir kaynağı havalandır gelen ortam dışı ve LP9-sadece kontrol yuvaları için küremsi içeren bir ortama (160 ul içinde 10 küreler gibi) ya da taze ortam ile değiştirin. </li></ol></li><li> Rtca cihaza plaka dönüş. Menü çubuğundan &#39;Yürütme&#39; ve &#39;adım durdurun&#39; işaretleyin. Program otomatik olarak bir sonraki adıma hareket edecek. Denemeyi sürdürmek için, menü çubuğundan &#39;Yürütme&#39; ve &#39;Start / Devam&#39; işaretleyin. Rtca programda Adım 3. başlatacaktır. </li></ol></li><li> Veri Analizi <ol><li> Küremsi hücre invaziv seviyesini belirlemek için, her bir zaman noktasında sadece yumurtalık kanseri hücre çizgileri için tek tek elde edilen okumalardan LP9 tek tabaka için elde edilen değerleri çıkarılır. </li><li> &#39;Işgaline küremsi&#39; çizmek için, S, sferoidler plakaya ilave edildi hangi bir zaman noktasında tüm değerleri normalize&#39;0 &#39;o zaman noktasını etting. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+worldwide+burden+of+cancer+in+2008:+GLOBOCAN.">Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN.</a> Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).</li><li>Ahmed, N., Stenvers, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+ovarian+cancer+ascites:+opportunities+for+targeted+therapy-+based+translational+research.">Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+pathogenesis:+a+model+in+evolution.">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, (2010).</li><li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).</li><li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases:+Biology+and+pathology.">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li><li>Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+plasticity+of+neoplastic+ovarian+epithelium:+unique+cadherin+profiles+in+tumor+progression.">Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).</li><li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disaggregation+and+invasion+of+ovarian+carcinoma+ascites+spheroids.">Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids.</a> J Transl Med. 4, 6 (2006).</li><li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).</li><li>Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+spheroids+disaggregate+on+type+I+collagen+and+invade+live+human+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers.</a> Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).</li><li>Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+ovarian+cancer+cell+metastasis+are+mediated+by+MMP-2+cleavage+of+vitronectin+and+fibronectin.">The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin.</a> J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).</li><li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Line+of+Abdominal+Metastatic+Attack:+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer.">The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).</li><li>Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+confrontation+assay:+a+simple+method+to+monitor+the+three-dimensional+migration+of+different+cell+types+in+vitro.">Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro.</a> Ann Anat. 193, 181-184 (2011).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).</li><li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients:+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors.">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+mesothelial+clearance+assay+that+models+the+early+steps+of+ovarian+cancer+metastasis.">In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).</li><li>Nishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+steroidogenic+human+granulosa-like+tumor+cell+line,+KGN,+that+expresses+functional+follicle-stimulating+hormone+receptor.">Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor.</a> Endocrinology. 142, 437-445 (2001).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+heregulin-induced+activation+of+ovarian+cancer+cells+depends+on+the+relative+levels+of+HER-2+and+HER-3+expression.">The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression.</a> Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).</li></ol>

Open access fee paid for by ACEA Biosciences, Inc. and MIMR-PHI Institute of Medical Research.

Istila yumurtalık kanseri hücreleri, fibroblastlar, adipositler ve mezotel hücreleri de dahil olmak üzere, periton yüzeyindeki hücre tiplerinin çeşitli etkileşim ve kanser hücreleri ve peritoneal hücrelerinin arasında iki yönlü iletişim metastatik süreci 2 sürüş kilit rol oynadığı düşünülür. Bir kez hakim, burada tarif edilen protokol mikro-peritoneal olan bu etkileşimlerin çalışmaya kolayca adapte edilebilir, örneğin, eksojen sitokinler, büyüme faktörleri ya da CIM plaka ya da genetik manipülasyon üst veya alt hazneye özgü inhibitörlerin eklenmesi ile kanser ya da peritoneal hücre çizgilerinin. Ayrıca, bu yöntem, düzenleyici sinyaller ve periton boşluğu içinde bir metastatik lezyonun yöneten kuruluş hücresel etkileşimler direkt bilgiler edinmek için malign asit ve / veya birincil peritoneal hücrelerden taze hasat edilmiş primer yumurtalık tümör hücreleri ile birlikte kullanılabilir <skadar&gt; 2. Tek hücre ya da küresel cisimler invaziv kapasitesini ölçmek için RTCA aletin kullanımı, geleneksel tek bir uç nokta tahlilleri ve zaman atlamalı resim analizleri fazla birkaç avantaj sunar. Rtca enstrüman saat veya gün olabilir, bir deneyinde boyunca sürekli belirli aralıklarla hücresel işgali ölçer. Bu tek nokta deneylerinin kısıtlamaların üstesinden zamanla invazyon oranı, değişikliklerin tespitine olanak sağlar. Örneğin, bir tek son nokta (Şekil 2), örneğin, 3 saat sonra farklı kanser hücre hatları işgali verileri inceleyerek, KGN ve OVCA433 hücreler çok daha invaziv OVCA429 hücrelerden daha vardı hatalı sonuca neden olabilir. Bu teknolojinin bir diğer avantajı da RTCA alet elektrik empedans değişiklikleri ölçen olmasıdır. Bu işlemler hücre phen üzerinde istenmeyen etkileri olabilir ki, dışsal bir ajan ile hücrelerin etiketlenmesi olmadan çalıştırılabilir anlamına gelirotype veya fonksiyon. Bu in vivo doğaya 2 yansıtıcı olmayan moleküler ve fenotipik değişiklikler meydana getirilmesini önlemek amacıyla en az manipülasyon tutmak için zorunludur hangi habis asit, türetilen birincil yumurtalık kanser hücrelerinin okuyan bu özellikle önemli hale gelir. Ayrıca, Rtca alet kullanımı zaman zaman atlamalı mikroskopi ile ilgili analizler tüketen önler ama aynı zamanda tahlil optimizasyonu için anahtar deneysel pencere hızla belirlenmesini sağlar sadece gerçek zamanlı, nicel verilerin toplanmasını sağlar. Küremsi istilası üzerinde bir dizi faktöre etkilerini karşılaştırarak, bu özellikle yararlıdır, gibi çeşitli faktörler, farklı zaman noktalarında ya da zaman içinde büyük ölçüde farklı profillere sahip maksimal etkiler de sarf edebilirler. Bu protokol değişiklikler (örneğin, için uygun olmasına rağmen, farklı bir ECM matris, değişik kanser hücresi çizgileri veya farklı hedef cel kullanımıBunu yaparken eğer ls), çeşitli deneysel koşullar ilk optimize edilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Örneğin, önceki küremsi invazyon çalışmaları başlamadan, kanser hücre / CIM plakanın uygun sayısı de ilk olarak tek tabakalı kültürü hücre sayısı titrasyon deneyi ile tespit edilmelidir. Oyuk başına kullanımı küremsiler uygun sayısı bu analizlere dayanmaktadır. Ilk oluşturulan Örneğin, mevcut yöntemde, sferoidler, her biri yaklaşık 3000 hücreleri içermektedir. İlk hücre sayısı titrasyon tek tabaka içinde 30,000 hücre analizleri istilasında tespiti için en uygun olan olduğunu göstermektedir, daha sonra 10 sferoidler de CIM tabak başına eklenir. Ko-kültür deneylerini yaparken Dahası, ayrı ayrı bu hücrelerin sonuçları yıkmak olabilir gibi, doğal olarak invaziv olup olmadığını belirlemek için &#39;hedef&#39; hücre tek tabaka davranışlarını incelemek için önemlidir. Gösterilen örnekte, kanser sferoidler bir LP9 hücre Monola üzerine plakalanırFBS ve olmayan Yer, kemo-çekici olarak da altına ilave edildi. Buna paralel olarak, LP9 hücreler her bir ıslah koşulları altında, tek başına kültürlenir. Hücre ve küremsi istilacı kapasitesini incelemek Benzer şekilde, bu iki davranışları (geçiş yok iken, yani istila bir ECM bariyerin proteolitik sindirimi gerektirir) ayırmak için de kendi kapasitelerini göç incelemek için de önemlidir. Bunu yapmak için, ECM bariyer ihmal (3.1.1 adımlar - 3.1.3) ve yerine ECM bariyer paralel olarak, deneyi yürütmek. Istenirse ikincisi &#39;işgali&#39; ölçüsü, eski &#39;göç&#39; tedbire düzeltilebilir. Hücrelerin alt odaya işgal kez, bunların bağlanma, yayma ve zarın alt çoğalmasında bir değişiklik değişikliklere katkıda bulunabilir: Son olarak, bu elektrik empedans ölçümleri elde edilen bilgi kapsamı sınırlıdır dikkat etmek önemlidir empedans readings. Kapsamlı küremsi hücre davranışlarını değerlendirmek amacıyla küremsi hücre canlılığı, yapışması, göç ve morfolojisinin diğer deneyleri ile birlikte kullanıldığında, bu nedenle, bu yöntem en çok bilgilendirici. Küremsi morfolojisi ve sağlık niteliksel değerlendirmeleri istila kantitatif RTCA deneyleri paralel olarak yapılabilir, böylece örneğin, ideal olarak, tam olarak küremsi-mezotel etkileşimleri anlamak amacıyla, ayrı eş-kültür, aynı zamanda standart faz mikroskobu altında periyodik görüntülü olmalıdır. İsteğe bağlı etiketleme aşaması gerçekleştirilir, bunlar sfero gelen, parçalamak ve işaretlenmemiş mezotel hücreleri ile etkileşime, daha sonra bir kanser hücrelerinin davranışları floresan mikroskobu altında belirlenebilir. Ikinci bir hücre tipi ile birlikte kültür sırasında flüoresan kanser hücrelerinin etiketlenmesi bir yararı, sadece kanser hücreleri, hücre ve ECM engelleri işgal onaylamak için zaman mümkün olmasıdır. <p class="jove_content"&gt; Özet olarak, bu yöntem ve mezotel ECM engellerin yumurtalık kanseri küremsi işgalinin bir yüksek verimli nicel analizini temsil etmektedir. Ekzojen sitokinler, büyüme faktörleri, ya da iyi CIM plakanın üst ya da alt bölmelerine özel inhibitörlerinin eklenmesi yoluyla, bu yöntem üzerinde mezoteliyalı ve matris bariyerleri istila yumurtalık kanseri küremsi hücreler arasındaki etkileşimleri düzenleyen faktörler, hızlı, belirlenmesini sağlar zamanı.

Yumurtalık kanseri tüm jinekolojik kanserlerin 1 en yüksek ölüm oranına sahiptir. Dünya çapında, ~ 230.000 olgu nedeniyle her yıl 1 hastalığa 100.000 ölüm vardır. Hastaların çoğu (&gt;% 75) kanser zaten metastaz sonra tedavi daha kemoterapi artan direnci ile komplike olduğunda, tanı ve prognoz 2 kötüdür. Evre III-IV metastatik hastalığı olan hastalar sadece% 30-40 3 5 yıllık sağkalım oranları var. Bu nedenle, etkin bir şekilde ileri hastalığı tedavi etmek amacıyla, yumurtalık kanseri metastazı altında yatan hücresel davranışların daha iyi anlaşılması için acil bir ihtiyaç vardır. Yumurtalık kanseri metastazı mevcut model, tümör davranışı üzerindeki etkileri farklı bir mikro oluşur, her biri metastaz, çeşitli adımlar önermektedir. Metastaz yumurtalık kanseri hücreleri, başlangıçta primer tümör sitesinden döken ve nonadher hayatta edilirtek hücre ya da üç boyutlu bir çok-hücreli yapılar da peritoneal sıvı içinde ent durum, agregatları ya da çok-hücreli küremsilerin 2,4,5 adlandırılır. Süspansiyon içinde küremsilerin oluşturmazlar hücreler anoikis 2,4,5 karşı daha hassastır. Ayrıca, küremsi kalıntı hastalığı ve kanser 2,4,5 daha sonra yeniden oluşumuna katkıda kemoterapi direnci artış görülmez. Yumurtalık kanseri metastazı ikinci bir kritik adım periton duvarı ve omentum 5,6 bünyesinde kurulan ikincil tümörlerde serbest-yüzen kümelerden agrega geçiştir. Hücre-hücre ve hücre-substrat etkileşimleri agrega oluşumu, hayatta kalma ve periton 4-11 mezotel astar tarafından üretilen hücre dışı matrisin (ECM) uyulması implike edilmiştir. Henüz olarak, bu süreçlerin tam olarak anlaşılamamıştır. Yumurtalık kanserlerinin yayılmasında rol mekanizmaları tanımlamak için, küremsiler homo olabilirated kültür ortamı 12,13 için metilselüloz ekleyerek ya da düşük tespit kalıpları 2,14 üzerinde hücrelerin kültürlenmesi ile, ya süspansiyon içinde hücrelerin bakımı, yapışmayan kültürü yöntemleri kullanılarak kurulmuştur kanseri hücre hatları. Bu şekilde kültürlendi olduğunda, yumurtalık kanser hücrelerinin in vivo 2,14 bulunan tümör agrega benzer hücresel, moleküler ve biyokimyasal özellikleri gösteren çok-agregatlar ya da küresel cisimler içine monte edin. Oluşmasından sonra, sferoidler, daha sonra yapışmayan ortamından hasat edilebilir ve daha fazla fonksiyonel çalışmalar için katı çeşitli yüzeyler üzerine kaplandı. Bu doğru örneğin intraperitoneal sıvısı olarak bir yapışkan olmayan bir ortam içinde metastaz yumurtalık kanseri hücrelerinin davranışları modeli olmayan tek tabakalı kültürü deneyleri üzerinde bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Kanser küremsi girici kapasitesi Boyden odalarına 2, geleneksel nokta deneylerinde değerlendirilebilir </suyumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreç olarak p&gt;, ancak bu yaklaşım, yanıltıcı olabilir. Yeni bir gerçek-zamanlı yöntem yumurtalık kanseri küremsilerden 15,16 işgal ederek mezotel hücre açıklık time-lapse video mikroskopi kullanılarak icat edilmiştir; Ancak, zaman atlamalı verilerin analizi zaman alıcı ve öznel olabilir. Burada, gerçek zamanlı olarak yumurtalık kanseri küremsiler istilacı davranışlarını değerlendirmek için hızlı bir nicel bir yöntem tarif edilmektedir. İlk olarak, bir küremsi-mezotel hücre modeli çok-hücreli küreler, takmak ve sekonder tümörler oluşturmak için peritoneal astar işgal zaman yumurtalık kanseri metastazı aşamasını temsil eden kurulmuştur. Daha sonra gerçek zamanlı hücre Analyzer (RTCA, şirket ayrıntılar için malzemeler tabloya bakınız) için yöntem sferoitlerin olarak büyüdü ve bu modelde test edilen farklı yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin invaziv kapasitesinin nicel gerçek zaman ölçümlerini yapmak için uyarlanmıştır. RTCA Instrument, hücresel tepkileri elektrik empedans değişiklikleri ölçerek eksojen etiketler için gerek kalmadan, bir tahlilin boyunca sürekli olarak izlenir. Özel olarak tasarlanmış kültür levhaları, 2 de odalı (&#39;CIM&#39; plakalar) üst ve alt odalar arasındaki arayüzde bir mikro-gözenekli zarın altında bulunan altın kaplama Mikroelektronlar sahiptir. Hücreler, bir ECM ya da ECM / hücresel bariyeri ile işgal olarak alt bölme içinde elektrotların yer elektrik empedans değişimlerin ölçümü sağlar. Her bir CIM levha kuyunun 2 odaları arasında Zar arayüz ilk çıkar ECM bileşeni ile kaplanır. Küremsi-mezotel hücre modeli sisteminde, arayüz insan mezoteliyalı bir konfluent tek tabaka ardından periton mezotel astar yatan karmaşık ECM taklit etmek Matrigel tabakası (şirket ayrıntılar için malzemeler tabloya bakınız), &#39;ile kaplanır Hedef &#39;hücreler. Son olarak, önceden şekillendirilmiş, yumurtalık kanseri olan bir reklam sferoidlerded. Yumurtalık kanseri küremsi hücrelerinin aktif alt bölmeyi ulaşmak ve elektrik empedansı okumaları değiştirmek için hedef hücreler katmanı ve matris işgal gerekir. Kendi Hedef hücreler aynı zamanda matris tabaka boyunca işgal ve bu tahlilde kullanım için uygun olan emin olmak için değerlendirilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">xCELLigence RTCA DP Analyser</td>
			<td style="width:291px;">ACEA biosciences</td>
			<td style="width:87px;">RTCA DP</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">xCELLigence CIM plates&#160;</td>
			<td>ACEA biosciences</td>
			<td>5665817001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell TraceTM CFSE&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylcellulose (4000 centipose)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:293px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11966-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Medium 199&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11150067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ham&#39;s F-12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11765062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:291px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well concave culture plate&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>650185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LP9 Human mesothelial cell line</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research&#160;</td>
			<td>AG07086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Growth Factor-reduced Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time

Yumurtalık kanserleri periton sıvısı içine dökülme ve periton içinde uzak sitelere dağıtılmasıyla metastaz. Kanser hücreleri, doğal olarak takmak ve sekonder tümörler oluşturmak için peritoneal astar istila metastatik sürecine katkıda çok hücreli yapılar halinde toplamak gibi tek tabakalı kültürler doğru, yapışkan olmayan bir ortam içinde, kanser hücrelerinin davranışları modeli yoktur. Yumurtalık kanseri metastazı, çok hücreli agrega, ya da küresel cisimler bu önemli aşama modellemek için, yapışkan olmayan koşullar altında tutulur kurulmuş yumurtalık kanseri hücre hatları oluşturulabilir. In vivo olarak tümör hücreleri tarafından karşılaşılan periton mikro taklit etmek için, küremsi-mezotel ko-kültür modeli küreler, hücre dışı bir matris bariyer üzerinde oluşturulan bir insan mezotel hücre mono tabakasının üzerine plakalanır önceden edildiği kurulmuştur. Yöntem daha sonra kantitatif gerçek yapmak için gerçek zamanlı bir hücre analiz cihazı kullanılarak geliştirilmiştirküremsi olarak yetiştirilen farklı yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin invaziv kapasitesinin zaman ölçümleri. Bu yaklaşım, geleneksel uç nokta tahlilleri ve daha zahmetli gerçek zamanlı mikroskobu resim analizleri üzerinde birçok avantajı vardır zaman, uzun süreler boyunca işgalinin sürekli ölçülmesi için izin verir. Kısaca, bu yöntem, zaman içinde mezotel ve matris bariyerleri istila yumurtalık kanseri küremsi hücreler arasındaki etkileşimleri düzenleyen faktörlerin bir hızlı ve tespitine olanak sağlar.

Yumurtalık kanseri sferoidler süspansiyon içinde kültürlenmesi ile veya habis ascites 2,14 birincil tümör hücrelerinin hasat hücre hatlarının çok türde üretilebilir. Burada iki epitelyal yumurtalık kanseri hücre kuşakları, OVCA433 ve OVCA429 ve bir yumurtalık tümörü granüloza hücre hattı, KGN, sferoidler (Şekil 1A) oluşturmak için kullanılmıştır. Metilselüloz ilavesiyle viskoz yapılmıştır ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş ise, bu yöntemde, hücre U-tabanlı bir kuyu kültürlenmiştir. Bu koşullar altında, bir çok yumurtalık kanser hücreleri sferoidler 13 oluşturmak üzere bir araya getirmek için bir doğal yeteneğini sergilerler. Metilselülöz / ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş, gece boyunca kültürün ardından, üç hücre çizgileri çap olarak yaklaşık 400-500 mikron (Şekil 1A) küçültülerek küremsi yapılar oluşturulur. Bu arada, RTCA CIM plakası ilk olarak matris ve insan mes sonra konfluent tek tabaka ile geçirgen membran arabirimi kaplanmasıyla hazırlanır,othelial hücreleri (Şekil 1B). Bir kez oluştuktan sonra, sferoidler sonra hazırlanan CIM plakasına aktarılır. Hasat kanser sferoidler LP9 tek tabaka üstüne kaplama ve aşağıda açıklandığı gibi değerlendirilir. Paralel kültürlerin (isteğe bağlı hücre etiketleme adım takip edildi ise veya floresan mikroskobu altında) standart faz mikroskobunda Görüntüler Rtca verilerin yorumlanması (Şekil 1C) yardım etmek için periyodik olarak alınır. Bu, bir kanser hücre hattının işgal bazal seviyesi, hem de kimyasal çekici kaynaklı işgali hem de değerlendirmek için bilgilendirici. Tipik olarak, invaziv bazal hem üst hem de alt bölmelere SFM eklenmesi ile ölçülür. Birçok potansiyel kemo-çekiciler içeren komple ortam (% 10 FBS), &#39;kemoatraktan kaynaklı&#39; işgaline (Şekil 2) incelemek için, mevcut örnekte kullanılmıştır. Tek başına LP9 mezotel hücreleri paralel çalışmalar, bu hücrelerin minimal olduğunu doğruladıvasive böylece bazal ya da &#39;kemoatraktan&#39; neden olduğu koşullar altında ve ya da 2 gün boyunca yumurtalık kanseri hücreleri ile ortak kültür analizleri içinde kullanmak için iyi bir hücre tipi olan (Şekil 2A ve 2B). Bunun aksine, üç hücre çizgilerinin herhangi biri kullanılarak elde yumurtalık kanseri sferoidler kemoatraktan (FBS) (Şekil 2A-2C) doğru işgal kapasitesi sergilemiştir. Geleneksel uç nokta deneyleri üzerinde Rtca gerçek zamanlı araçları kullanmanın büyük avantajı hücre / sfero davranış değişiklikleri zamanla ölçülebilir olmasıdır. 2 gün deneyi boyunca, KGN, OVCA429 ve OVCA433 hücre çizgileri her bir (hücre endeksleri artırarak gösterilir) kemoatraktan ancak istilasının düşük bazal seviyeleri (Şekil 2C) doğru işgal kapasitesi sergilemiştir. Eğrileri (Şekil 2C) paralel pistleri ile gösterildiği gibi hücre çizgileri, invazyon benzer oranları sergiledi; Bununla birlikte, daha yüksek bir OVCA429 eğri üst asimptotuna sergiledibu da diğer hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir istila maksimal düzeyini göstermektedir. Bundan başka, hücre çizgilerinin KGN hücreleri hızlı bir şekilde (Şekil 2B) sırasıyla daha uzun işgal 3-5x alma hücre ve matris bariyerleri ve OVCA433 ve OVCA429 hücreleri istila ile, invazyon başlangıcı için kendi zamanlarda farklılık sergiledi. Önemlisi, işgali başlangıcında onların davranışları işgali için kendi genel kapasite (Şekil 2C ve 2D) prediktif değildi. Bu, kanser hücre çizgilerinin Farklı doğal özelliklerini göstermektedir değil, aynı zamanda farklı faktörler küremsi erken ve geç invazif davranışları düzenleyebilir olduğunu gösteriyor olabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1 experimental Sferoid nesil ve model A yukarı ayarlayın:.. I. Oda metilselüloz / media (üst) oluşturan küremsi faz kontrast mikroskopisi altında bir tek tabaka (alt) olarak yetiştirilen uygun hücre çizgisinin büyücü: şematik RTCA 2 CIM plaka de, yumurtalık kanseri, önceden oluşturulmuş olan kurmak odacıklı gösteriyor sferoidler bir kimyasal çekici olarak da FBS ± üst bölmesi ve ortam içinde LP9 mezotel tabaka / matris bariyerin bir tek tabaka üzerine plakalanmıştır alt bölmeye eklenir. . Faz kontrast mikroskobu (sol) veya floresan mikroskobu (sağ) altında LP9 tek tabaka üstüne KGN küremsiler Görüntüleri: daha fazla hücre alt kamara C engelleri işgal olarak elektrik empedansı artırarak 2 odacıklı önlemin arayüzü altında Elektrotlar. Ölçek bar = 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> .. Şekil 2. Gerçek zamanlı yumurtalık kanseri küremsi istila veri A - B: iyi bir CIM levhanın alt odasına FBS ile ve olmadan yapılan bir RTCA istila tahlilinden Örnek oluşur. KGN hücre istilası LP9 mezotel hücreleri ile karşılaştırılır. Sonuçlar 24 saatlik zaman (A) ve bütün bir iki günlük test süresinde (B) üzerinde üçlü kuyulardan ortalama ± SD Cep Endeksi olarak gösterilen C - D:. KGN OVCA429 invaziv kapasitesinin karşılaştırılması ve OVCA433 hücre 24 saatlik bir periyodun (C) üzerinde ve 2.5 saatlik bir süre (D) üzerinde daha ayrıntılı bir şekilde tasvir hatları.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time at JoVE.com

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Periton mezotel zarının içine yumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreçtir. Gerçek zamanlı analiz kullanarak, bir küremsi-mezotel hücresi eş-kültür modelinde, yumurtalık kanseri hücrelerinin invaziv kapasitesi metastatik işlemini düzenleyen faktörleri bakış açıları sağlayan, uzun süreler boyunca ölçülebilir.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

assessment-ovarian-cancer-spheroid-attachment-invasion-mesothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

17.3K Görüntüleme.  MIMR-PHI Institute of Medical Research.  Periton mezotel zarının içine yumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreçtir. Gerçek zamanlı analiz kullanarak, bir küremsi-mezotel hücresi eş-kültür modelinde, yumurtalık kanseri hücrelerinin invaziv kapasitesi metastatik işlemini düzenleyen faktörleri bakış açıları sağlayan, uzun süreler boyunca ölçülebilir. 

Video: Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

Kanser Hücreleri Endotel Hücre Tek tabakalı Invasion Tedbir Gerçek zamanlı Elektrik Empedans Tabanlı Tekniği

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Tıp

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In vitro Mezotelyal Gümrükleme Assay o Yumurtalık Kanseri Metastaz Erken Adımlar modeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Katı Örneklerinin From İlköğretim Yumurtalık Kanseri Hücreleri alma için yöntem

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

İnsan Hücre Lines Kemorezistans Yumurtalık Kanser Kök Hücreleri Zenginleştirme

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Yumurtalık Kanseri Tümör başlatan Hücrelerinin in vitro Zenginleşmeden içinde

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...