Name: assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time
Uploaded: 2014-05-20T19:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time at JoVE.com

Bu çalışma CASS Vakfı Bilim ve Tıp Grant tarafından desteklenmiştir; (MB); Avustralya Projesi Hibe Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (KLS, 338516); ve Victoria Hükümeti&#39;nin Operasyonel Altyapı Destek Programı (Avustralya) tarafından.

1.. Hazırlanması Hücreler, Medya ve Reaktifler <ol><li> Metilselüloz-içeren ortam hazırlanması <ol><li> 250 ml&#39;lik bir şişe içerisinde steril Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (hiçbir katkı maddesi), 100 ml metilselüloz 1.5 g çözülür. </li><li> 5 dakika boyunca bir mikrodalga düşük üzerinde çözüm ısıtın; Üzerine kaynar önlemek için dikkat çekmek. </li><li> Metilselüloz toz yarı çözünmüş sonra, 125 ml hacim almak için temiz bir manyetik karıştırıcı ve medya ekleyebilirsiniz. </li><li> , Ters karıştırılır ve bir gece boyunca 4 ° C&#39;de karıştırıldı ve ardından 1.5 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırın. </li><li> Dört adet 50 ml tüpler ve 2300 x g &#39;de 1.5 saat boyunca santrifüje eşit solüsyonu bölün. </li><li> 3 aya kadar 4 ° C&#39;de berrak, yüksek ölçüde zor akışlı, steril bir 50 ml tüpler içine süpernatant (stokunun yaklaşık% 90-95), kısım ve mağaza toplayın. </li></ol></li><li> Kültür ve Hücrelerinin Etiketleme <ol><li> Bir ti içinde tekkat yumurtalık kanseri hücre hatları korumak% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L ile desteklenmiş: 37 ° C, (OVCA429 ve OVCA433 hücre çizgileri için 18 M199 KGN hücreleri 17 ve MCBD110 için DMEM) uygun bir büyüme ortamı içinde,% 5 CO2 de ssue kültürü kuluçka -glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin. </li><li> M199 olarak LP9 insan mezotel hücreleri korumak: Hams F12 ortamı 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ile bir kuluçka makinesi içinde% 15 FBS, 10 ng / ml Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) ve 400 ng / ml hidrokortizon, ihtiva etmektedir. </li><li> Tohum istenen şişe büyüklüğü hücreleri yaklaşık% 75 konfluansa kadar büyür. % 0.05 tripsin / EDTA, 5 dakika boyunca 186 x g sıkma ve iki kez PBS ile yıkayın hücre pelletini kullanılarak hücreler tripsinizasyon ile harmanlayın. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı Floresan Hücre Etiketleme Yöntemi <ol><li> Önceden ısıtılmış PBS/0.1% BSA, 1 ml 1 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda yeniden süspanse kanser hücreleri. </li><li> 5 mM stok Cep Tr 2 ul ekleyinace CSFE çözeltisi (veya uzun süreli muhafaza edilir, diğer tercih edilen hücre etiket) 10 uM bir nihai konsantrasyonda hücrelere ve bir su banyosu içinde 10-15 dakika 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Santrifüj ile,% 10 FBS ve yeniden topak içeren buz gibi soğuk 1 ml ortam maddesi ile reaksiyonu söndürün. Uygun büyüme ortamı, önceden ısıtılmış 10 ml içinde süspanse (adım 1.2.1 bakınız). </li><li> 37 ° C&#39;de, 75 cm 2 filtre-kapaklı bir şişeye ve Tohum kültürü hücreleri,% 5 CO2. </li><li> Floresan etiketleme seviyesinin tespiti için yeterli olduğunu doğrulamak için bir floresan mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Hücreler yaklaşık% 75 konfluensisinin, hasat ulaşmak ve adımlar 1.2.3 ve üzeri 1.2.4 olarak saymak bir kez. </li></ol></li></ol> Metilselülozda küremsi 2.. Üretimi <ol><li> (300000 hücre toplam her biri tam 96 oyuklu bir plaka deney için gereklidir) küremsi oluşturulması için gerekli Bölüm 1 yumurtalık kanseri hücre hacmini hesaplar. Hayırte: Burada sunulan farklı hücre hatları kullanılarak eğer, üniforma sfero üretimi için hücre yoğunlukları her hat için optimize edilmesi gerekebilir. </li><li> Metilselüloz ortam içinde hücrelerin seyreltme hesaplanması için, ilk olarak 15 ml (adım 2.1) gerekli olan hücre hacmini çıkarın. </li><li> , Her bir hücre hattı için kültür ortamı, uygun bir hacme kadar 15 ml eksi hücre hacmine eşit (son% 20 metilselüloz olmak için) ve özenli bir şekilde ters ile iyice karıştırın metilselüloz stok çözeltisinden 3 ml ilave edilir. </li><li> Metilselüloz içeren ortama 300,000 hücreleri ekleyin ve özenli bir şekilde ters ile iyice karıştırılmıştır. </li><li> 37 ° C&#39;de 96 oyuklu bir içbükey alt kültür plakasının ve kültür her oyuğuna (3,000 hücre / kuyu olmak üzere toplam), hücre / metilselüloz / media karışımı pipetle 150 ul,% 5 CO2 1-4 gün boyunca veya üniforma spheroids (1 sfero / iyi tipik olarak izlenmektedir) oluşturmak kadar. </li></ol> 3.. Rtca Hücre Invasion Tahliller HAYIRTE: Empedans okuma hücre içeriği (CI), hücre durumunu temsil eden ölçülmüş hücre empedans göreceli değişimdir boyutsuz bir parametre olarak ifade edilmiştir. Microsoft Excel gibi bir elektronik tablo içine bir analiz için, ithalat verileri,. <ol><li> Tabaka preparasyonu <ol><li> Her seferinde 4 kuyu gruplar halinde, toplam yüzey alanı kapalı olduğundan emin olmak için bir 16-çukurlu RTCA CIM plakanın üst bölmesinin her oyuğuna (serum içermeyen kültür ortamı içinde 1:10 seyreltilmiş) 50 ul matris ekleme . Herhangi bir aşırı sıvı kurtulmak için, yavaş yavaş hemen matris 30 ul çıkarın ama. </li><li> Bir doku kültürü inkübatörü içinde, kullanılmadan önce, 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her bir kanser hücresi, üst bölmeye hattı ve alt bölmeye (deneme tasarım göre) veya serumsuz ortam için uygun 160 ul serum içermeyen ortam (SFM) 30 ul ekle. </li><li> Üst bölme ve equilibr içine alt bölmeyi tıklayarak CIM plaka montebir doku kültürü inkübatörü içinde, 1 saat için bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde yedi. </li></ol></li><li> Rtca Enstrüman Programlama <ol><li> Rtca programını açın ve &#39;Düzen&#39; sekmesini seçin. Tüm deneysel kuyu vurgulayın. </li><li> Sağ kuyular tıklayın ve &#39;kuyu üzerinde açın&#39; seçeneğini; istediğiniz gibi sonra deneysel koşullar ve hücre adlarında doldurun. </li><li> , Programa adımları veya alt basamakları eklemek &#39;bir adım Ekle&#39; &#39;Zamanlama&#39; sekmesini ve sağ tıklayın seçin. İlk adım seçilir &#39;bir adım eklemek&#39; bir kez otomatik olarak programa dahil olan önceden programlanmış bir arka plan süpürme vardır. </li><li> LP9 tek tabaka kurulması sırasında okumaları kaydeder Rtca programı, Adım 2 için istenen program ayrıntılarını girin. &#39;&#39; Interval&#39;ın &#39;sekmesini seçip &#39;15 dk girerek empedans okumaları arasındaki zaman aralıklarını ekleyin. &#39;Süre&#39; sekmesine gelin seçerek deneysel süre ekled 12-24 saat arasında bir zaman giriyor. </li><li> Sonraki adımları eklemek için, &#39;bir adım Ekle&#39; &#39;Zamanlama&#39; sekmesini ve sağ tıklayın seçin ve yukarıdaki gibi, ilave adımların ayrıntılarını girin. Rtca programın Adım 3 sfero işgali sırasında okuma almak için aracı yönlendirecektir; &#39;Süre&#39; sekmesi altında Interval&#39;ın &#39;sekmesi ve &#39;48 saat&#39; altında &#39;&#39;5 dakika girin. </li><li> Menü çubuğundaki &#39;Plaka&#39; seçeneğini seçin ve kaydedin. </li></ol></li><li> Sferoid Invasion LP9 Monolayer ve Ölçüm Üretimi <ol><li> Yukarıdaki Adım 3.2 &#39;den Rtca enstrüman ve açık olan programda CIM plaka koyun. Önce hücreler ekleyerek seçin menü çubuğunda &#39;Yürütme&#39; ve ardından &#39;Start&#39;. Bir arka plan süpürme otomatik (Rtca yazılım talimatları Adım 1) yapılacaktır. </li><li> Bir doku kültürü kaputu arka süpürme ve yerine aşağıdaki cihazdan CIM plakasını sökün. </li><li> Plaka 50,000 LP9 hücreler her CIM plakanın üst bölmesine 160 ul SFM içinde süspansiyon haline getirildi. </li><li> Rtca enstrüman plaka koyun ve LP9 tek tabaka (Rtca programın Adım 2) bir gecede kurulması ise bilgi okunması her 15 dakika sürer. </li><li> Hasat kanser sferoidler, yukarıda, Aşama 2 &#39;Generation metilselülozda küremsi&#39; altında elde. <ol><li> Aseptik, 1 ml pipet üst kapalı 1 mm kesilmiş ve hafifçe de her içeriğini almak için kullanın. Steril bir tüpe aktarın. </li><li> Santrifüj 8 dakika boyunca 120 x g küremsi ve hafif aspirasyonla metilselüloz içeren ortam çıkarın. </li><li> Her yıkamadan sonra sferoidler peletleştirmek için 8 dakika boyunca 120 x g&#39;de santrifüje tabi tutarak, PBS ile iki kez daha küremsilerin yıkayın. </li><li> Her deney için, kuyu, FBS&#39;siz ortamda 160 ul içinde 10 sferoitlerin bir toplam tekrar süspansiyon. </li><li> Menü çubuğundan &#39;Yürütme&#39; seçme ve kontrol tarafından Rtca deneyi Pause# 8216; &#39;Pause. Aletten CIM plakasını çıkarın ve bir doku kültürü kaputu yerleştirin. Her bir kaynağı havalandır gelen ortam dışı ve LP9-sadece kontrol yuvaları için küremsi içeren bir ortama (160 ul içinde 10 küreler gibi) ya da taze ortam ile değiştirin. </li></ol></li><li> Rtca cihaza plaka dönüş. Menü çubuğundan &#39;Yürütme&#39; ve &#39;adım durdurun&#39; işaretleyin. Program otomatik olarak bir sonraki adıma hareket edecek. Denemeyi sürdürmek için, menü çubuğundan &#39;Yürütme&#39; ve &#39;Start / Devam&#39; işaretleyin. Rtca programda Adım 3. başlatacaktır. </li></ol></li><li> Veri Analizi <ol><li> Küremsi hücre invaziv seviyesini belirlemek için, her bir zaman noktasında sadece yumurtalık kanseri hücre çizgileri için tek tek elde edilen okumalardan LP9 tek tabaka için elde edilen değerleri çıkarılır. </li><li> &#39;Işgaline küremsi&#39; çizmek için, S, sferoidler plakaya ilave edildi hangi bir zaman noktasında tüm değerleri normalize&#39;0 &#39;o zaman noktasını etting. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+worldwide+burden+of+cancer+in+2008:+GLOBOCAN.">Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN.</a> Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).</li><li>Ahmed, N., Stenvers, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+ovarian+cancer+ascites:+opportunities+for+targeted+therapy-+based+translational+research.">Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+pathogenesis:+a+model+in+evolution.">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, (2010).</li><li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).</li><li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases:+Biology+and+pathology.">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li><li>Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+plasticity+of+neoplastic+ovarian+epithelium:+unique+cadherin+profiles+in+tumor+progression.">Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).</li><li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disaggregation+and+invasion+of+ovarian+carcinoma+ascites+spheroids.">Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids.</a> J Transl Med. 4, 6 (2006).</li><li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).</li><li>Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+spheroids+disaggregate+on+type+I+collagen+and+invade+live+human+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers.</a> Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).</li><li>Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+ovarian+cancer+cell+metastasis+are+mediated+by+MMP-2+cleavage+of+vitronectin+and+fibronectin.">The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin.</a> J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).</li><li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Line+of+Abdominal+Metastatic+Attack:+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer.">The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).</li><li>Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+confrontation+assay:+a+simple+method+to+monitor+the+three-dimensional+migration+of+different+cell+types+in+vitro.">Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro.</a> Ann Anat. 193, 181-184 (2011).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).</li><li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients:+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors.">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+mesothelial+clearance+assay+that+models+the+early+steps+of+ovarian+cancer+metastasis.">In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).</li><li>Nishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+steroidogenic+human+granulosa-like+tumor+cell+line,+KGN,+that+expresses+functional+follicle-stimulating+hormone+receptor.">Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor.</a> Endocrinology. 142, 437-445 (2001).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+heregulin-induced+activation+of+ovarian+cancer+cells+depends+on+the+relative+levels+of+HER-2+and+HER-3+expression.">The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression.</a> Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).</li></ol>

Open access fee paid for by ACEA Biosciences, Inc. and MIMR-PHI Institute of Medical Research.

Istila yumurtalık kanseri hücreleri, fibroblastlar, adipositler ve mezotel hücreleri de dahil olmak üzere, periton yüzeyindeki hücre tiplerinin çeşitli etkileşim ve kanser hücreleri ve peritoneal hücrelerinin arasında iki yönlü iletişim metastatik süreci 2 sürüş kilit rol oynadığı düşünülür. Bir kez hakim, burada tarif edilen protokol mikro-peritoneal olan bu etkileşimlerin çalışmaya kolayca adapte edilebilir, örneğin, eksojen sitokinler, büyüme faktörleri ya da CIM plaka ya da genetik manipülasyon üst veya alt hazneye özgü inhibitörlerin eklenmesi ile kanser ya da peritoneal hücre çizgilerinin. Ayrıca, bu yöntem, düzenleyici sinyaller ve periton boşluğu içinde bir metastatik lezyonun yöneten kuruluş hücresel etkileşimler direkt bilgiler edinmek için malign asit ve / veya birincil peritoneal hücrelerden taze hasat edilmiş primer yumurtalık tümör hücreleri ile birlikte kullanılabilir <skadar&gt; 2. Tek hücre ya da küresel cisimler invaziv kapasitesini ölçmek için RTCA aletin kullanımı, geleneksel tek bir uç nokta tahlilleri ve zaman atlamalı resim analizleri fazla birkaç avantaj sunar. Rtca enstrüman saat veya gün olabilir, bir deneyinde boyunca sürekli belirli aralıklarla hücresel işgali ölçer. Bu tek nokta deneylerinin kısıtlamaların üstesinden zamanla invazyon oranı, değişikliklerin tespitine olanak sağlar. Örneğin, bir tek son nokta (Şekil 2), örneğin, 3 saat sonra farklı kanser hücre hatları işgali verileri inceleyerek, KGN ve OVCA433 hücreler çok daha invaziv OVCA429 hücrelerden daha vardı hatalı sonuca neden olabilir. Bu teknolojinin bir diğer avantajı da RTCA alet elektrik empedans değişiklikleri ölçen olmasıdır. Bu işlemler hücre phen üzerinde istenmeyen etkileri olabilir ki, dışsal bir ajan ile hücrelerin etiketlenmesi olmadan çalıştırılabilir anlamına gelirotype veya fonksiyon. Bu in vivo doğaya 2 yansıtıcı olmayan moleküler ve fenotipik değişiklikler meydana getirilmesini önlemek amacıyla en az manipülasyon tutmak için zorunludur hangi habis asit, türetilen birincil yumurtalık kanser hücrelerinin okuyan bu özellikle önemli hale gelir. Ayrıca, Rtca alet kullanımı zaman zaman atlamalı mikroskopi ile ilgili analizler tüketen önler ama aynı zamanda tahlil optimizasyonu için anahtar deneysel pencere hızla belirlenmesini sağlar sadece gerçek zamanlı, nicel verilerin toplanmasını sağlar. Küremsi istilası üzerinde bir dizi faktöre etkilerini karşılaştırarak, bu özellikle yararlıdır, gibi çeşitli faktörler, farklı zaman noktalarında ya da zaman içinde büyük ölçüde farklı profillere sahip maksimal etkiler de sarf edebilirler. Bu protokol değişiklikler (örneğin, için uygun olmasına rağmen, farklı bir ECM matris, değişik kanser hücresi çizgileri veya farklı hedef cel kullanımıBunu yaparken eğer ls), çeşitli deneysel koşullar ilk optimize edilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Örneğin, önceki küremsi invazyon çalışmaları başlamadan, kanser hücre / CIM plakanın uygun sayısı de ilk olarak tek tabakalı kültürü hücre sayısı titrasyon deneyi ile tespit edilmelidir. Oyuk başına kullanımı küremsiler uygun sayısı bu analizlere dayanmaktadır. Ilk oluşturulan Örneğin, mevcut yöntemde, sferoidler, her biri yaklaşık 3000 hücreleri içermektedir. İlk hücre sayısı titrasyon tek tabaka içinde 30,000 hücre analizleri istilasında tespiti için en uygun olan olduğunu göstermektedir, daha sonra 10 sferoidler de CIM tabak başına eklenir. Ko-kültür deneylerini yaparken Dahası, ayrı ayrı bu hücrelerin sonuçları yıkmak olabilir gibi, doğal olarak invaziv olup olmadığını belirlemek için &#39;hedef&#39; hücre tek tabaka davranışlarını incelemek için önemlidir. Gösterilen örnekte, kanser sferoidler bir LP9 hücre Monola üzerine plakalanırFBS ve olmayan Yer, kemo-çekici olarak da altına ilave edildi. Buna paralel olarak, LP9 hücreler her bir ıslah koşulları altında, tek başına kültürlenir. Hücre ve küremsi istilacı kapasitesini incelemek Benzer şekilde, bu iki davranışları (geçiş yok iken, yani istila bir ECM bariyerin proteolitik sindirimi gerektirir) ayırmak için de kendi kapasitelerini göç incelemek için de önemlidir. Bunu yapmak için, ECM bariyer ihmal (3.1.1 adımlar - 3.1.3) ve yerine ECM bariyer paralel olarak, deneyi yürütmek. Istenirse ikincisi &#39;işgali&#39; ölçüsü, eski &#39;göç&#39; tedbire düzeltilebilir. Hücrelerin alt odaya işgal kez, bunların bağlanma, yayma ve zarın alt çoğalmasında bir değişiklik değişikliklere katkıda bulunabilir: Son olarak, bu elektrik empedans ölçümleri elde edilen bilgi kapsamı sınırlıdır dikkat etmek önemlidir empedans readings. Kapsamlı küremsi hücre davranışlarını değerlendirmek amacıyla küremsi hücre canlılığı, yapışması, göç ve morfolojisinin diğer deneyleri ile birlikte kullanıldığında, bu nedenle, bu yöntem en çok bilgilendirici. Küremsi morfolojisi ve sağlık niteliksel değerlendirmeleri istila kantitatif RTCA deneyleri paralel olarak yapılabilir, böylece örneğin, ideal olarak, tam olarak küremsi-mezotel etkileşimleri anlamak amacıyla, ayrı eş-kültür, aynı zamanda standart faz mikroskobu altında periyodik görüntülü olmalıdır. İsteğe bağlı etiketleme aşaması gerçekleştirilir, bunlar sfero gelen, parçalamak ve işaretlenmemiş mezotel hücreleri ile etkileşime, daha sonra bir kanser hücrelerinin davranışları floresan mikroskobu altında belirlenebilir. Ikinci bir hücre tipi ile birlikte kültür sırasında flüoresan kanser hücrelerinin etiketlenmesi bir yararı, sadece kanser hücreleri, hücre ve ECM engelleri işgal onaylamak için zaman mümkün olmasıdır. <p class="jove_content"&gt; Özet olarak, bu yöntem ve mezotel ECM engellerin yumurtalık kanseri küremsi işgalinin bir yüksek verimli nicel analizini temsil etmektedir. Ekzojen sitokinler, büyüme faktörleri, ya da iyi CIM plakanın üst ya da alt bölmelerine özel inhibitörlerinin eklenmesi yoluyla, bu yöntem üzerinde mezoteliyalı ve matris bariyerleri istila yumurtalık kanseri küremsi hücreler arasındaki etkileşimleri düzenleyen faktörler, hızlı, belirlenmesini sağlar zamanı.

Yumurtalık kanseri tüm jinekolojik kanserlerin 1 en yüksek ölüm oranına sahiptir. Dünya çapında, ~ 230.000 olgu nedeniyle her yıl 1 hastalığa 100.000 ölüm vardır. Hastaların çoğu (&gt;% 75) kanser zaten metastaz sonra tedavi daha kemoterapi artan direnci ile komplike olduğunda, tanı ve prognoz 2 kötüdür. Evre III-IV metastatik hastalığı olan hastalar sadece% 30-40 3 5 yıllık sağkalım oranları var. Bu nedenle, etkin bir şekilde ileri hastalığı tedavi etmek amacıyla, yumurtalık kanseri metastazı altında yatan hücresel davranışların daha iyi anlaşılması için acil bir ihtiyaç vardır. Yumurtalık kanseri metastazı mevcut model, tümör davranışı üzerindeki etkileri farklı bir mikro oluşur, her biri metastaz, çeşitli adımlar önermektedir. Metastaz yumurtalık kanseri hücreleri, başlangıçta primer tümör sitesinden döken ve nonadher hayatta edilirtek hücre ya da üç boyutlu bir çok-hücreli yapılar da peritoneal sıvı içinde ent durum, agregatları ya da çok-hücreli küremsilerin 2,4,5 adlandırılır. Süspansiyon içinde küremsilerin oluşturmazlar hücreler anoikis 2,4,5 karşı daha hassastır. Ayrıca, küremsi kalıntı hastalığı ve kanser 2,4,5 daha sonra yeniden oluşumuna katkıda kemoterapi direnci artış görülmez. Yumurtalık kanseri metastazı ikinci bir kritik adım periton duvarı ve omentum 5,6 bünyesinde kurulan ikincil tümörlerde serbest-yüzen kümelerden agrega geçiştir. Hücre-hücre ve hücre-substrat etkileşimleri agrega oluşumu, hayatta kalma ve periton 4-11 mezotel astar tarafından üretilen hücre dışı matrisin (ECM) uyulması implike edilmiştir. Henüz olarak, bu süreçlerin tam olarak anlaşılamamıştır. Yumurtalık kanserlerinin yayılmasında rol mekanizmaları tanımlamak için, küremsiler homo olabilirated kültür ortamı 12,13 için metilselüloz ekleyerek ya da düşük tespit kalıpları 2,14 üzerinde hücrelerin kültürlenmesi ile, ya süspansiyon içinde hücrelerin bakımı, yapışmayan kültürü yöntemleri kullanılarak kurulmuştur kanseri hücre hatları. Bu şekilde kültürlendi olduğunda, yumurtalık kanser hücrelerinin in vivo 2,14 bulunan tümör agrega benzer hücresel, moleküler ve biyokimyasal özellikleri gösteren çok-agregatlar ya da küresel cisimler içine monte edin. Oluşmasından sonra, sferoidler, daha sonra yapışmayan ortamından hasat edilebilir ve daha fazla fonksiyonel çalışmalar için katı çeşitli yüzeyler üzerine kaplandı. Bu doğru örneğin intraperitoneal sıvısı olarak bir yapışkan olmayan bir ortam içinde metastaz yumurtalık kanseri hücrelerinin davranışları modeli olmayan tek tabakalı kültürü deneyleri üzerinde bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Kanser küremsi girici kapasitesi Boyden odalarına 2, geleneksel nokta deneylerinde değerlendirilebilir </suyumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreç olarak p&gt;, ancak bu yaklaşım, yanıltıcı olabilir. Yeni bir gerçek-zamanlı yöntem yumurtalık kanseri küremsilerden 15,16 işgal ederek mezotel hücre açıklık time-lapse video mikroskopi kullanılarak icat edilmiştir; Ancak, zaman atlamalı verilerin analizi zaman alıcı ve öznel olabilir. Burada, gerçek zamanlı olarak yumurtalık kanseri küremsiler istilacı davranışlarını değerlendirmek için hızlı bir nicel bir yöntem tarif edilmektedir. İlk olarak, bir küremsi-mezotel hücre modeli çok-hücreli küreler, takmak ve sekonder tümörler oluşturmak için peritoneal astar işgal zaman yumurtalık kanseri metastazı aşamasını temsil eden kurulmuştur. Daha sonra gerçek zamanlı hücre Analyzer (RTCA, şirket ayrıntılar için malzemeler tabloya bakınız) için yöntem sferoitlerin olarak büyüdü ve bu modelde test edilen farklı yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin invaziv kapasitesinin nicel gerçek zaman ölçümlerini yapmak için uyarlanmıştır. RTCA Instrument, hücresel tepkileri elektrik empedans değişiklikleri ölçerek eksojen etiketler için gerek kalmadan, bir tahlilin boyunca sürekli olarak izlenir. Özel olarak tasarlanmış kültür levhaları, 2 de odalı (&#39;CIM&#39; plakalar) üst ve alt odalar arasındaki arayüzde bir mikro-gözenekli zarın altında bulunan altın kaplama Mikroelektronlar sahiptir. Hücreler, bir ECM ya da ECM / hücresel bariyeri ile işgal olarak alt bölme içinde elektrotların yer elektrik empedans değişimlerin ölçümü sağlar. Her bir CIM levha kuyunun 2 odaları arasında Zar arayüz ilk çıkar ECM bileşeni ile kaplanır. Küremsi-mezotel hücre modeli sisteminde, arayüz insan mezoteliyalı bir konfluent tek tabaka ardından periton mezotel astar yatan karmaşık ECM taklit etmek Matrigel tabakası (şirket ayrıntılar için malzemeler tabloya bakınız), &#39;ile kaplanır Hedef &#39;hücreler. Son olarak, önceden şekillendirilmiş, yumurtalık kanseri olan bir reklam sferoidlerded. Yumurtalık kanseri küremsi hücrelerinin aktif alt bölmeyi ulaşmak ve elektrik empedansı okumaları değiştirmek için hedef hücreler katmanı ve matris işgal gerekir. Kendi Hedef hücreler aynı zamanda matris tabaka boyunca işgal ve bu tahlilde kullanım için uygun olan emin olmak için değerlendirilir.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP Analyser</td><td>ACEA biosciences</td><td>RTCA DP</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence CIM plates&amp;nbsp;</td><td>ACEA biosciences</td><td>5665817001</td><td></td></tr><tr><td>Cell TraceTM CFSE&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose (4,000 centipose)</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11150067</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F-12 Nutrient mix</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11765062</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech&amp;nbsp;</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>96-well concave culture plate&amp;nbsp;</td><td>Grenier Bio-One</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>LP9 Human mesothelial cell line</td><td>Coriell Institute for Medical Research&amp;nbsp;</td><td>AG07086</td><td></td></tr><tr><td>Growth Factor-reduced Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time

Yumurtalık kanserleri periton sıvısı içine dökülme ve periton içinde uzak sitelere dağıtılmasıyla metastaz. Kanser hücreleri, doğal olarak takmak ve sekonder tümörler oluşturmak için peritoneal astar istila metastatik sürecine katkıda çok hücreli yapılar halinde toplamak gibi tek tabakalı kültürler doğru, yapışkan olmayan bir ortam içinde, kanser hücrelerinin davranışları modeli yoktur. Yumurtalık kanseri metastazı, çok hücreli agrega, ya da küresel cisimler bu önemli aşama modellemek için, yapışkan olmayan koşullar altında tutulur kurulmuş yumurtalık kanseri hücre hatları oluşturulabilir. In vivo olarak tümör hücreleri tarafından karşılaşılan periton mikro taklit etmek için, küremsi-mezotel ko-kültür modeli küreler, hücre dışı bir matris bariyer üzerinde oluşturulan bir insan mezotel hücre mono tabakasının üzerine plakalanır önceden edildiği kurulmuştur. Yöntem daha sonra kantitatif gerçek yapmak için gerçek zamanlı bir hücre analiz cihazı kullanılarak geliştirilmiştirküremsi olarak yetiştirilen farklı yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin invaziv kapasitesinin zaman ölçümleri. Bu yaklaşım, geleneksel uç nokta tahlilleri ve daha zahmetli gerçek zamanlı mikroskobu resim analizleri üzerinde birçok avantajı vardır zaman, uzun süreler boyunca işgalinin sürekli ölçülmesi için izin verir. Kısaca, bu yöntem, zaman içinde mezotel ve matris bariyerleri istila yumurtalık kanseri küremsi hücreler arasındaki etkileşimleri düzenleyen faktörlerin bir hızlı ve tespitine olanak sağlar.

Yumurtalık kanseri sferoidler süspansiyon içinde kültürlenmesi ile veya habis ascites 2,14 birincil tümör hücrelerinin hasat hücre hatlarının çok türde üretilebilir. Burada iki epitelyal yumurtalık kanseri hücre kuşakları, OVCA433 ve OVCA429 ve bir yumurtalık tümörü granüloza hücre hattı, KGN, sferoidler (Şekil 1A) oluşturmak için kullanılmıştır. Metilselüloz ilavesiyle viskoz yapılmıştır ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş ise, bu yöntemde, hücre U-tabanlı bir kuyu kültürlenmiştir. Bu koşullar altında, bir çok yumurtalık kanser hücreleri sferoidler 13 oluşturmak üzere bir araya getirmek için bir doğal yeteneğini sergilerler. Metilselülöz / ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş, gece boyunca kültürün ardından, üç hücre çizgileri çap olarak yaklaşık 400-500 mikron (Şekil 1A) küçültülerek küremsi yapılar oluşturulur. Bu arada, RTCA CIM plakası ilk olarak matris ve insan mes sonra konfluent tek tabaka ile geçirgen membran arabirimi kaplanmasıyla hazırlanır,othelial hücreleri (Şekil 1B). Bir kez oluştuktan sonra, sferoidler sonra hazırlanan CIM plakasına aktarılır. Hasat kanser sferoidler LP9 tek tabaka üstüne kaplama ve aşağıda açıklandığı gibi değerlendirilir. Paralel kültürlerin (isteğe bağlı hücre etiketleme adım takip edildi ise veya floresan mikroskobu altında) standart faz mikroskobunda Görüntüler Rtca verilerin yorumlanması (Şekil 1C) yardım etmek için periyodik olarak alınır. Bu, bir kanser hücre hattının işgal bazal seviyesi, hem de kimyasal çekici kaynaklı işgali hem de değerlendirmek için bilgilendirici. Tipik olarak, invaziv bazal hem üst hem de alt bölmelere SFM eklenmesi ile ölçülür. Birçok potansiyel kemo-çekiciler içeren komple ortam (% 10 FBS), &#39;kemoatraktan kaynaklı&#39; işgaline (Şekil 2) incelemek için, mevcut örnekte kullanılmıştır. Tek başına LP9 mezotel hücreleri paralel çalışmalar, bu hücrelerin minimal olduğunu doğruladıvasive böylece bazal ya da &#39;kemoatraktan&#39; neden olduğu koşullar altında ve ya da 2 gün boyunca yumurtalık kanseri hücreleri ile ortak kültür analizleri içinde kullanmak için iyi bir hücre tipi olan (Şekil 2A ve 2B). Bunun aksine, üç hücre çizgilerinin herhangi biri kullanılarak elde yumurtalık kanseri sferoidler kemoatraktan (FBS) (Şekil 2A-2C) doğru işgal kapasitesi sergilemiştir. Geleneksel uç nokta deneyleri üzerinde Rtca gerçek zamanlı araçları kullanmanın büyük avantajı hücre / sfero davranış değişiklikleri zamanla ölçülebilir olmasıdır. 2 gün deneyi boyunca, KGN, OVCA429 ve OVCA433 hücre çizgileri her bir (hücre endeksleri artırarak gösterilir) kemoatraktan ancak istilasının düşük bazal seviyeleri (Şekil 2C) doğru işgal kapasitesi sergilemiştir. Eğrileri (Şekil 2C) paralel pistleri ile gösterildiği gibi hücre çizgileri, invazyon benzer oranları sergiledi; Bununla birlikte, daha yüksek bir OVCA429 eğri üst asimptotuna sergiledibu da diğer hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir istila maksimal düzeyini göstermektedir. Bundan başka, hücre çizgilerinin KGN hücreleri hızlı bir şekilde (Şekil 2B) sırasıyla daha uzun işgal 3-5x alma hücre ve matris bariyerleri ve OVCA433 ve OVCA429 hücreleri istila ile, invazyon başlangıcı için kendi zamanlarda farklılık sergiledi. Önemlisi, işgali başlangıcında onların davranışları işgali için kendi genel kapasite (Şekil 2C ve 2D) prediktif değildi. Bu, kanser hücre çizgilerinin Farklı doğal özelliklerini göstermektedir değil, aynı zamanda farklı faktörler küremsi erken ve geç invazif davranışları düzenleyebilir olduğunu gösteriyor olabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1 experimental Sferoid nesil ve model A yukarı ayarlayın:.. I. Oda metilselüloz / media (üst) oluşturan küremsi faz kontrast mikroskopisi altında bir tek tabaka (alt) olarak yetiştirilen uygun hücre çizgisinin büyücü: şematik RTCA 2 CIM plaka de, yumurtalık kanseri, önceden oluşturulmuş olan kurmak odacıklı gösteriyor sferoidler bir kimyasal çekici olarak da FBS ± üst bölmesi ve ortam içinde LP9 mezotel tabaka / matris bariyerin bir tek tabaka üzerine plakalanmıştır alt bölmeye eklenir. . Faz kontrast mikroskobu (sol) veya floresan mikroskobu (sağ) altında LP9 tek tabaka üstüne KGN küremsiler Görüntüleri: daha fazla hücre alt kamara C engelleri işgal olarak elektrik empedansı artırarak 2 odacıklı önlemin arayüzü altında Elektrotlar. Ölçek bar = 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> .. Şekil 2. Gerçek zamanlı yumurtalık kanseri küremsi istila veri A - B: iyi bir CIM levhanın alt odasına FBS ile ve olmadan yapılan bir RTCA istila tahlilinden Örnek oluşur. KGN hücre istilası LP9 mezotel hücreleri ile karşılaştırılır. Sonuçlar 24 saatlik zaman (A) ve bütün bir iki günlük test süresinde (B) üzerinde üçlü kuyulardan ortalama ± SD Cep Endeksi olarak gösterilen C - D:. KGN OVCA429 invaziv kapasitesinin karşılaştırılması ve OVCA433 hücre 24 saatlik bir periyodun (C) üzerinde ve 2.5 saatlik bir süre (D) üzerinde daha ayrıntılı bir şekilde tasvir hatları.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time at JoVE.com

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Periton mezotel zarının içine yumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreçtir. Gerçek zamanlı analiz kullanarak, bir küremsi-mezotel hücresi eş-kültür modelinde, yumurtalık kanseri hücrelerinin invaziv kapasitesi metastatik işlemini düzenleyen faktörleri bakış açıları sağlayan, uzun süreler boyunca ölçülebilir.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

assessment-ovarian-cancer-spheroid-attachment-invasion-mesothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

17.3K Görüntüleme.  MIMR-PHI Institute of Medical Research.  Periton mezotel zarının içine yumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreçtir. Gerçek zamanlı analiz kullanarak, bir küremsi-mezotel hücresi eş-kültür modelinde, yumurtalık kanseri hücrelerinin invaziv kapasitesi metastatik işlemini düzenleyen faktörleri bakış açıları sağlayan, uzun süreler boyunca ölçülebilir. 

Video: Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Tıp

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In vitro Mezotelyal Gümrükleme Assay o Yumurtalık Kanseri Metastaz Erken Adımlar modeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Üç boyutlu heterotipik<em&gt; In Vitro</emYumurtalık Kanseri Başlatma ve İlerleme sırasında Stromal-Epitel Etkileşimleri&gt; Modelleme

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant transgenic mouse models of ovarian cancer exist, these mice are expensive and take a long time to develop tumors. Intraperitoneal injection xenograft models lack human stroma and do not accurately model ovarian cancer metastasis. Even patient derived xenografts (PDX) do not fully recapitulate the human stromal microenvironment as serial PDX passages demonstrate significant loss of human stroma. The ability to easily model human ovarian cancer within a physiologically relevant stromal microenvironment is an unmet need. Here, the protocol presents an orthotopic ovarian cancer mouse model using human ovarian cancer cells combined with patient-derived carcinoma-associated mesenchymal stem cells (CA-MSCs). CA-MSCs are stromal progenitor cells, which drive the formation of the stromal microenvironment and support ovarian cancer growth and metastasis. This model develops early and diffuses metastasis mimicking clinical presentation. In this model, luciferase expressing ovarian cancer cells are mixed in a 1:1 ratio with CA-MSCs and injected into the ovarian bursa of NSG mice. Tumor growth and metastasis are followed serially over time using bioluminescence imaging. The resulting tumors grow aggressively and form abdominal metastases by 14 days post injection. Mice experienced significant decreases in body weight as a marker of systemic illness and increased disease burden. By day 30 post injection, mice met endpoint criteria of &gt;10% body weight loss and necropsy confirmed intra-abdominal metastasis in 100% of mice and 60%-80% lung and parenchymal liver metastasis. Collectively, orthotopic engraftment of ovarian cancer cells and stroma cells generates tumors that closely mimic the early and diffuse metastatic behavior of human ovarian cancer. Furthermore, this model provides a tool to study the role of ovarian cancer cell: stroma cell interactions in metastatic progression.

Orthotopic engraftment of ovarian cancer cells mixed with human stromal cells provides a mouse model that exhibits rapid, diffuse metastatic behavior that is characteristic of human ovarian cancer. This model also allows for the study of tumor cell and stromal cell interactions, as well as their role in tumor progression and metastasis.

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant ...

Kanser Araştırmaları

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with poor clinical outcomes and currently lacks effective treatment. Both the three-dimensional (3D) environment and the dynamic mechanical forces are very important factors in this metastatic cascade. However, traditional cell cultures fail to recapitulate this natural tumor microenvironment. Thus, in vivo-like models that can emulate the intraperitoneal environment are of obvious importance. In this study, a new microfluidic platform of the peritoneum was set up to mimic the situation of ovarian cancer spheroids in the peritoneal cavity during metastasis. Ovarian cancer spheroids generated under a non-adherent condition were cultured in microfluidic channels coated with peritoneal mesothelial cells subjected to physiologically relevant shear stress. In summary, this dynamic 3D ovarian cancer-mesothelium microfluidic platform can provide new knowledge on basic cancer biology and serve as a platform for potential drug screening and development.

To study ovarian tumor progression in a physiologically relevant model, multicellular spheroids were cultured in a microdevice under simulated fluid flow. This dynamic 3D model emulates the intraperitoneal environment with the cellular and mechanical components where ovarian cancer metastasis occurs.

Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Biyomühendislik

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

İçi periton Yumurtalık Kanseri Metastaz kantitasyonu

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

Modeling Ovarian Cancer Metastasis in Peritoneal Cavity Lining: A Method To Establish an In Vitro 3D Model of the Peritoneal Lining

Source: Peters, P. N. et al. <a href="https://www.jove.com/t/53541">Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the development of&#160; an in vitro &#160;three-dimensional model of the lining of the peritoneal cavity. This organotypic culture can help to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Periton Boşluğu Astarında Yumurtalık Kanseri Metastazının Modellenmesi: Periton Astarının İn Vitro 3D Modelini Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Source: Peters, P. N. et al. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. ...