NIH hibe P30 CA051008 ve T32 CA009686 (ATR) tarafından desteklenir.

Sferoidlerin 1. Üretim <ol><li> Bir PBS kullanarak 70% konfluansa ~ adherent kanseri hücre kültürleri ayırarak damla kültürleri asılı tek hücre süspansiyonu hazırlamak% 0.05 tripsin-EDTA solüsyonuna maruz bırakılarak, ardından yıkama. <ol><li> Hücre kültür ortamı ile tripsin solüsyonu nötralize ve hücre süspansiyonu, bir kısım kullanarak hücreleri sayın. Not: Hücre hattı bağlıdır belirli bir hücre kültür ortamı, test edilen. Hücre kültür ortamı genellikle DMEM +% 10 FBS olduğu, ATCC medya önerileri uygulayın. Daha fazla bilgi Malzemeleri Tablo bulunabilir. </li><li> Hücre kültür ortamı 20 ul damla başına 500-1000 hücre ekimi için izin vermek için bir seyreltme gerçekleştirin. </li></ol></li><li> 10 cm çanak Edinme ve alt steril PBS 5 ml ekleyin. Not: Bu adım asılı buharlaşma damla korur. Düşük maliyetli &quot;bakteriyolojik notu&quot; yemekleri, hücre kültürü sınıf yemekleri yerine kullanılabilecek kadar hücreler devamı olmazKültür yüzey hareket ederler. </li><li> Kapağın iç yüzeyine seyreltilmiş hücre süspansiyonu, 20 ul damlalar aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın. <ol><li> Pipet 40 10 cm çanak kapağı üzerine (8 damla 5 satır) düşer. </li></ol></li><li> Kültür çanak üzerinde kapağı ve yer ters çevirin. Sferoidler oluşturmak için 72 saat boyunca 37 ° C &#39;de asılı damla kültürleri inkübe edin. <ol><li> Kendine güvenen, henüz kontrollü bir şekilde kapağı çevirin. Not: Çok hızlı veya çok yavaş kapağı Inverting damlacıklar kaydırmaya neden olabilir. Diğerleri, kompakt agrega üretilmesi için fazla 72 saat gerekebilir Bazı hücre hatları, 48 saat ya da daha az parçacıklarının oluşturabilir. </li></ol></li></ol> 3D Matrix içine sferoitlerin 2. gömülmesi <ol><li> Gece boyunca sferoidler, gömme işlemi öncesinde 4 ° C&#39;de büyüme faktörü azaltılmış bazal membran malzeme bir kısım çözülme. <ol><li> İsteğe bağlı: Önceden ECM ile Katman kuyu doku kültürlerdeki potansiyel sfero etkileşimi önlemek içinyüzeye yeniden. <ol><li> 24 oyuklu bir plaka üzerinde oyuk başına ECM&#39;nin pipetleyin 200 ul. </li><li> ECM tüm kuyu yüzeyini kaplayan emin olmak için plakayı eğin. </li><li> Dikkatle bir pipet ile aşırı ECM çıkarın. </li><li> 3 saat oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de: kuyu kuruyana kadar plaka inkübe edin. </li></ol></li></ol></li><li> Doku kültürü çanak kapağı devirme ve medyayı bir araya getirerek parçacıklarının toplayın. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine sferoidlerle medya aktarın. </li><li> Sferoidler mikrosantrifüj tüp dibinde yerleşmek için 10 dakika bekleyin. Sferoidler gözle görünür olmalıdır. </li><li> . Soğuk (4 ° C) 100 ul bir ayrı ön-soğutulmuş bir tüp içinde kollajen tip ile bazal membran malzeme 100 ul karıştırın erken katılaşmasını önlemek için ya da bir jel, 4 ° C &#39;de karışımı tutun. <ol><li> Küçük hacimli transfer eğer önceden soğutulmuş pipet ipuçlarını kullanın. </li><li> Dikkatli verBen hava kabarcığı oluşumunu önlemek için bazal membran malzeme ve kollajen tip karıştırma. Not: jel gömülü hale eğer Hava kabarcıkları protokolde daha sonra görüntüleme engelleyebilir. </li></ol></li><li> Mikrosantrifüj tüp 40 ul alt kısmından parçacıklarının aspire ve ben karışımı kollajen bazal membran malzemeleri / tip ile birleştirir. Karıştırma sırasında hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkatli olun. Not: Çözelti 100 ul kollajen tip I ve sferoitlerin 40 ul 4 bağımsız 3D kültürler için yeterli malzeme yaratacak, 100 ul bazal membran malzemelerinin içeren. Bu büyütülüyor veya aşağı olabilir. </li><li> Pipet, 24 oyuklu bir plaka üzerinde kuyuların merkezlerine viskoz karışımın 40 ul düşer. Kuyunun tarafına çalışmasını karışımı önlemek için plaka düz tutun. Not: 24 oyuklu bir plaka üzerinde bir tek sütun - 4 kuyu - Her bir durumda test edilecek için tavsiye edilir. </li><li> Plaka int yerleştirinoa 37 ° C inkübatör ve 30 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. 3D kültür bu dönemde polimerize olur. </li><li> Yavaş yavaş hücre kültür ortamının 1 ml 3D kültürleri daldırın. <ol><li> Ayrıca jel polimerizasyonu teşvik etmek kuyular içine eklerken medya sıcak olduğundan emin olun. </li><li> KRİTİK ADIM: yavaşça 3D kültürlere medya ekleyebilirsiniz. Kuyulara çok hızlı bir şekilde ortam Pipetleme doku kültürü yüzeyinden 3D kültürlerin ayrılması yol açabilir. </li></ol></li></ol> 3. İzleme ve Sfero Invasion Analizi <ol><li> Araştırmacı tarafından karar zaman noktalarında çevredeki 3D matris içine sferoitlerin Image işgali. 20x objektif lens bir ters mikroskop kullanılarak fotoğraf elde edin. Not: İdeal zaman noktaları test edilen hücre hattı bağlı olarak farklılık gösterecektir. Daha invaziv hücre hatları kısa bir süre sonra kaplama sferoidler kendi dışarı çıkmasını başlar ve bu nedenle, ilk fotoğrafı alacakkaplama sonrası birkaç saat içinde s. Genel olarak, fotoğraf (kaplama) sonra 0 saat, 24 saat ve 48 saat sonra alınmıştır. Invasion genellikle kaplama sonrası 24 saat 48 varmıştır. </li><li> Görüntü J. gibi görüntü analiz yazılımı kullanarak invaziv yeteneklerini ölçmek <ol><li> Sfero kenarından hücre mesafe olarak işgali analiz edin. <ol><li> Yarıçapı ve / veya maksimal invaziv mesafeyi işaretlemek için Düz Beraberlik Aracı&#39;nı kullanın. </li><li> Uzunluk ölçümünü görüntülemek için &quot;Tedbir&quot; üst menüde &quot;Analiz&quot;, ve sonra tıklatın. </li></ol></li><li> Sfero dışında toplam invaziv alanı olarak işgal edilmesi. <ol><li> Sfero ve / veya toplam invaziv alanın sınırını izlemek için Freehand Beraberlik Aracı&#39;nı kullanın. </li><li> Alan ölçümünü görüntülemek için &quot;Tedbir&quot; üst menüde &quot;Analiz&quot;, ve sonra tıklatın. </li></ol></li><li> Görüntülerin bir yığın için ölçümler oluşturmak için ROI Yöneticisi Araçları gibi bir eklenti kullanın. </li></ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. 51, (2011).</li><li>Del Duca, ., Werbowetski, D., T, ., Del Maestro, R., F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J Vis Exp. 88, (2014).</li><li>Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+matrix+metalloproteinase-9+(MMP-9)+via+a+converging+plasmin/stromelysin-1+cascade+enhances+tumor+cell+invasion.">Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion.</a> J Bio Chem. 274 (19), .</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+integrin+&#945;6&#946;1+in+metastatic+breast+carcinoma+cells+assessed+by+expression+of+a+dominant-negative+receptor.">Function of the integrin &#945;6&#946;1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor.</a> Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), (2010).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cot&#233;, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), (2006).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Brenner, W., Gro&#223;, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Th&#252;roff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).</li><li>Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+promotes+motility+in+human+breast+cancer+cells+regardless+of+their+E-cadherin+expression.">N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression.</a> J Cell Biol. 147 (3), .</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), (2013).</li><li>Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+I+but+not+Matrigel+matrices+provide+an+MMP-dependent+barrier+to+ovarian+cancer+cell+penetration.">Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration.</a> BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+ductal+elongation+and+myoepithelial+migration+are+regulated+by+the+composition+of+the+extracellular+matrix.">Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix.</a> J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).</li><li>Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+circulating+metastatic+cells+produced+in+orthotopic+but+not+ectopic+prostate+cancer+models.">Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models.</a> Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu çalışma, bir küremsi yayılması deneyinin (Tablo 1) kanser hücre soylarının bir paneli performansını değerlendirildi. Genel olarak, sferoid oluşumu hücre-hücre birleşme varlığı küremsi benzeri mimari oluşumunu teşvik fazla epitelyal dönük hücre hatları, gelişmiş olduğunu fark. MDA-MB-231 hücreleri gibi, bir epitelyal mezenkimal geçiş geçirmiş bilinen hücre hatları, dolayı azaltılmış E-, N- ve P-kadherin ifadesi 16 büyük olasılıkla Asılı damla k?...

Kanser hücre hareketi gibi davranışlar dolaşım sistemi 1 içine bazal membran ve giriş yoluyla işgali kolaylaştırır göz önüne alındığında, metastatik potansiyelin belirleyici olduğu bilinmektedir. Motilite üzerinde en çok araştırma yaygın bir üç boyutlu (3D) matris içinde hücrelerin hareketi olacak aslında nasıl bu aynı hücrelerin daha fazla temsilcisi olduğunu olma yolunda hızla ilerliyor olsa hücreler, iki boyutlu (2D) ayarında nasıl davrandığını odaklanmıştır vivo 2 davranır. 3D kültür sistemleri giderek büyüme kinetikleri ve ilaç duyarlılık 3, hücre morfolojisi değişir hücresel davranışları incelemek için kullanılır. 3D ortamın kapsamında kanser hücre işgali izlemek için arzu 3D hücre dışı içine bu parçacıklarının gömerek ardından asılı damla kültür yöntemiyle 4 aracılığıyla 3D hücre agrega (sferoidler) üretimini kapsayan daha önce kurulmuş tekniklerin sentezine yol açmıştır Matris (ECM) kolajen ve bazal membran malzemelerinin 5 oluşur. Bu yöntem, kolaylıkla deneysel koşullar altında çeşitli işgali karşılaştırma için kullanılabilir akıcı bir yaklaşım sağlayarak bu, daha önce bilinen teknikler geliştirmek için çalışmaktadır. In vitro hücre motilitesini değerlendirmek için daha geleneksel yolları çizilmeye yara tahlil ve transwell tahlil 6 bulunmaktadır. Eski deney 2B ortamda hücre motilitesini tasvir ve in vivo işgali için kritik çeşitli özellikler, örneğin, bir proteaz aktivitesi 7 bağımsızdır. Transwell tahlil de ekler ters membran yüzeyinde hücre görünümü, yani ECM yüzeylerde ancak, yalnızca tek bir parametre ile daha iyi bir model hücre işgali kaplanır zaman ölçülen ve hücre işgali birçok nüanslar böylece kolaylıkla gözlemlenebilir değildirler. Bu teknikler, kanser hücresi sferoid yayılması deneyinin (Şekil 1 &lt;aksine/ strong&gt;) Sadece fizyolojik ilgili olmayan bir ortamda hücre işgali gerçek zamanlı izleme sağlar, fakat aynı zamanda kolektif vs bireysel hücre göçü 8 olarak görüntülenebilir önemli hücre çizgisi özgü özellikleri, izin verir. Bu yöntem aynı zamanda, standart 3D kültürü büyüme tahlilleri fazla avantaj elde edilir. Hücreler bu kısıtlama kaldırdı sonra işgal etmeye teşvik edilecektir böylece asılı damla yöntemi ile hücresel agrega üretimi başlangıçta hücre hareketi kısıtlar. Bu kısıtlama kaldırdı kez Dahası, hücre çıkış sonra uygun quantitated edilebilir bir üniforma yönde devam edecektir. Kanser hücresi sferoidler deneyleri için kullanılan en popüler ECM malzeme Matrigel ve bu bileşenlerin her biri metastatik davranışını etkileyen önemli ve farklı rolleri vardır burada tip I, hücre oranında yerleştirilmiştir. Matrigel Engelbreth-Holm Swarm fare sarkoma hücreleri tarafından üretilen proteinlerin salgılanan karışımıdır ve baseme içinde zenginleştirilmiş olanBöyle laminin, Entactin ve tip IV kollajen 9 olarak nt zar proteinleri. Bu nedenle, Matrigel bundan böyle adlandırılır &quot;bazal membran malzemeler&quot;. Bu bazal zar malzemeleri hücre davranışı 11 üzerindeki etkileri bir dizi gösterirler sayıdaki başka protein ek olarak, kanser hücresi yayılımını tamamen 10 boyunca yapışma integrin için gerekli temel ligandı sunar. Buna karşılık, genellikle tendon ve diğer yoğun kollajen yapılar 12 asit sindirimleri hazırlanabilir I kolajen türü, vücut bağ dokusu ve stromanın destekleyici dokuların ve organların büyük bir yapısal elemanı olarak hizmet eden daha basit bir dolgu maddesi. Bu kollajen fiziksel özellikleri, hücre motilitesinin bir dizi özellik düzenleyen ortaya konmuştur; örneğin tümör-stroma arayüzünde kolajen fibrilleri hizalama stroma 13 içine işgalci, sonradan bu fibriller boyunca geçirmek için kanser hücrelerinin izin verir. Burada yer alan deneyinde, hem tip I kolajen ve bazal zar malzemeleri 3D kanser hücresi-stroma etkileşimleri incelemek için bir araç olarak kullanılır. Hücreler 3 boyutlu bir matris içine gömülü edildikten sonra işgal izlenebilir kontrol yollarının engellenmesi veya stimülasyon etkisi. Hücreler, asılı damla ya da uzun bir işleme işgali modüle etmek için gerekli olacaktır bağlı olarak 3D kültür, transfer üzerine büyüme sırasında ön muameleye tabi tutulabilir. Kısa tedaviler için, ilacın alımından sonra küremsi süspansiyon, hem de hücrelere yeterli ilaç maruziyeti kolaylaştırmak için, 3D kültürleri saracak ortamı ile karıştırılabilir önerilir. Daha sonra, normal veya tümör bağlantılı stromal hücreleri, tümör hücresi istilasını modüle edilmesinde rolünü değerlendirmek için, ya da ne kadar parakrin ve otokrin sinyal etkiler, hücre davranışını tespit etmek matris malzemesi ile karıştırılabilmektedir. Bu fikir bir çalışmada gösterilmiştir nerede col Coculturekanser ve asılı damla endotelyal hücreler üzerinde sferoidler 14 içinde damar ağı yol açtı. Kanser hücre istilası farklı alt-tabaka 15 tarafından temas edilmesinin Son olarak, ECM bileşenleri, aynı zamanda, değiştirilebilir. Aşağıda sunulan durumda, yöntem, çeşitli koşullar altında kanser hücresi invazyonunu değerlendirilmesi için bir çerçeve sağlar. Genel olarak, tüm hücre kuşakları asılı damla parçacıklarının yaratacak ve epitel dönük hücre hatları genellikle, normal küre formunda olduğu belirlendi.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-treated Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24-well TC-treated Plates</td><td>NEST Biotechnlology</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

Sferoid invazyon testi kullanılarak (Şekil 1), kanser hücre soylarının bir paneli, hem de bazal membran malzemeleri ve tip I kolajen oluşan 3 boyutlu bir matris içinde implantasyon sonrası sergilenen hücre egress miktarı için küreler oluşturma kabiliyetleri için test edildi (Tablo 1). Bu sonuçlar, her kanser hücre çizgisi, in vitro olarak bir epitel morfolojisi sahip hücre çizgileri düzenli ve düzgün agrega üretme eğilimindeydi iyi biçimli sferoidler, y...

Watch this Scientific Journal Video about A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting at JoVE.com

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

a-cancer-cell-spheroid-assay-to-assess-invasion-in-a-3d-setting

Research

JoVE Journal

Medicine

32.5K Görüntüleme.  Georgetown University. This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored. 

Video: A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Tıp

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Kanser Araştırmaları

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Kanser Biyolojisinde 3 Boyutlu Modeller: Heterosferoidlerde İnvazyon Dinamiği

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Yazar Spotlight: Baş ve Boyun Kanseri İlerlemesi Sırasında Kanser ve Bağışıklık Hücreleri Arasındaki Karışmanın Deşifre Edilmesi

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Makrofaj-Tümör Sferoid Etkileşimlerinin 3 Boyutlu Kollajen Matriks Kurulumunda İncelenmesi

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi