This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

Yeniden üretilebilir Ölçekli Tümör küremsi 1. Üretim <ol><li> Fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın, tümör hücre mono tabakaları (PBS; 25 cm2 veya 8 5 ml - 75 cm2 şişe için 10 ml), hücre ayrışma enzim (ekleme, bir 75 cm, 25 cm 2 için ise 1 ml ya da 2 ml&#39;lik 5 dakika - 2 37 ° C&#39;de 2 şişe) ve inkübe hücreleri. </li><li> Mikroskop altında hücre ayrışması kontrol edin ve (75 cm 2 şişe için 25 cm, 2 veya 8 ml 5 ml) içinde tam bir büyüme ortamı ile hücre ayrışma enzimi etkisiz hale getirir. </li><li> 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. </li><li> Süpernatantı tüp dokunun ve P1000 pipet kullanarak tam büyüme ortamı 1 ml hücre pelet yeniden askıya. Bu, hücre kümeleri olmadan tek bir hücre süspansiyonu elde edilmelidir. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve elde edilmesi için hücre süspansiyonu seyreltik 0,5-2 x 10 4 hücre / ml (optimum hücre yoğunluğu o, her bir hücre hattı için tespit edilmesi gerekmektedir) hücre 12,13 tohumlama sonra 500 mikron çaplı 4 gün - Sarf 300 tümör sferoidler elde etmek. </li><li> De ultra düşük eki (ULA), 96-gözlü yuvarlak tabanlı plakalarda 12 içine / steril rezervuara hücre süspansiyonu aktarın ve bir çok kanallı pipet kullanarak 200 ul dağıtın. </li><li> Bir inkübatör (37 ° C,% 5 CO2,% 95 nem) plakaları aktarın. Dört gün sonra, görsel tümör oluşumunu sfero onaylamak ve 3D işgali tahlil devam edin. </li></ol> 2. 3D Tümör Sfero Invasion Deneyi <ol><li> Buz üzerinde BMM çözülme. </li><li> P10 için steril filtre ipuçları bir dizi tutun, P200 ve P1000 pipetler ve steril tüpler (1.5 ml hacim gerekli toplam hacmine bağlı olarak veya daha büyük) -20 ° C&#39;de. </li><li> Buz üzerinde 4-günlük sferoidler içeren ULA, 96 gözlü levhalar yerleştirin. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, yavaşça küremsi plakalardan büyüme ortamı içinde 100 ul / yuva çıkarın. Bu adım açısı için i yönünde ipuçlarıoyuk ve parçacıklarının konumu alt tarafı ile teması önleyen U tabanlı kuyu nside duvarı; sferoidlerin rahatsızlığı en aza indirmek. </li><li> Buz soğukluğunda ipuçları kullanılarak, buzla soğutulmuş tüpler BMM aktarın. Ilaç değerlendirme çalışmaları sitokin kaynaklı işgali için veya, buz ipuçlarını kullanarak BMM için (2x nihai konsantrasyon) reaktifler ekleyin. Örneğin, CAL, S ve R, CAL skuamöz karsinom hücreleri istila uyarmak için, epidermal büyüme faktörü (EGF) kullanımı. Yavaşça dönen kabarcık oluşumunu kaçınarak iyice karıştırın. </li><li> Hafifçe de iç duvarına doğru ucu amaçlayan U tabanlı kuyuya BMM 100 ul dağıtmak. Uygun görüntü analizi için, küremsi oyuk 12 merkezinde kalmalıdır, bu adım çok kritiktir. </li><li> 6 çoğaltır / durumu - 5 sağlayarak gerekli tüm kuyuları, için yineleyin 2.6. Gerekirse, taze soğutulmuş ucu değiştirin. NOT: Daha deneyimli, dispenBir çok kanallı pipet kullanarak se BMM. </li><li> Varsa steril bir iğne kullanarak, kabarcıkları. <ol><li> Bir mikroskop kullanarak, görsel sferoidleri merkezi bir konumda olduklarını kontrol edin. Eğer değilse, 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj plaka. Bu sferoidler merkezi de her yer sağlayacaktır. </li></ol></li><li> 37 ° C&#39;de bir kuluçka plaka transferi ve BMM katılaşmaya sağlar. </li><li> 1 saat sonra, çok kanallı bir pipet kullanılarak, yavaşça 100 ul / tam büyüme ortamında kuyusunu ekleyin. Sitokinle indüklenen invazyonu veya ilaç değerlendirme çalışmaları için, ortam içinde adı geçen sitokin veya inhibitörleri (nihai konsantrasyon 1 x) içerir. Reaktifler adım 2.5 BMM ilave değil, alternatif olarak, (arzu edilen nihai konsantrasyonu 3x) bu noktada ortama ekleyin. </li></ol> 3. Otomatik Resim Alma <ol><li> Sitometresindeki Tarama plakalar aralıklarla sta de (özellikler için Ekipman ve Malzemeleri Tabloya bakınız)Hemen 72 saat ya da daha yavaş işgalci tümör hücre hatları için 96 saat kadar adım 2.10 sonra sıfır (t0 = kurmak işgali testinin gün zaman rting. </li><li> &#39;Kavşak&#39; uygulamayı seçin. </li><li> Sfero odakta olduğunu kontrol edin ve gerekirse elle ayarlamak ve &#39;off-set Odak&#39; düzeltin. </li><li> (FOV) bir merkezi alan tarama seçeneğini &#39;Örnekleme ayarlara&#39; altında. BMM ilave işleminden sonra, tümör sferoidler böylece tüm kuyu taramak için bir ihtiyaç vardır, merkezi bir konumda kalmıştır olmalıdır. </li><li> Yazılımda, kuyular plaka harita üzerinde vurgulayarak taranacak tanımlar. &#39;Taramasını başlat&#39; üzerine tıklayın. NOT: Tarama otomatik olarak kaydedilir ve daha sonra off-line gözden geçirilebilir. </li></ol> 4. Otomatik Görüntü Analizi <ol><li> &#39;Izdiham&#39; uygulamasını seçin. </li><li> &#39;Analiz&#39; sekmesinde, Applic ayarlamaktirme ayarları (örneğin, &quot;hassas&quot;: düşük, normal, yüksek; &quot;yoğunluk eşiği&quot;: 1-15) BMM (Şekil 1) içine uzanan hücre süreçleri ve invadopodia dahil sfero etrafında kesin segmentasyon, üretmek. Her bir tümör hücre hattı için ve / veya çeşitli zaman noktalarında ayarları yapılır. &#39;Izdiham&#39; uygulaması tedbirleri seçilmiş FOV içinde, işgalci hücreleri kapsadığı kuyu alanının%. </li><li> Analiz ayarları birkaç farklı kuyuların tıklayarak plaka diğer sferoitlerin (yani, segmentasyon doğru) uygun olup olmadığını kontrol edin. Segmentasyon doğru bir sfero anahat etmezse, ayrıca uygulama ayarlarını yapın. </li><li> &#39;Analizini başla&#39; üzerine tıklayın. </li><li> &#39;Sonuçlar&#39; sekmesinde, analiz kalitesini doğrulamak için birden fazla kuyu kontrol edin. Bir elektronik tablo programı İhracat &#39;Eh düzeyinde veri&#39;. </li><li> Repeatüm zaman noktalarında t analizi. Bilimsel grafik ve seçim istatistiksel yazılımı kullanarak çoğaltmak kuyu ve bir çubuk grafik zamana karşı komplo işgali (% izdiham), ortalama% izdiham hesaplayın. </li></ol> 5. Manuel Görüntü Alma <ol><li> T = 0 72 başlangıç ​​aralıklarla her tümör sfero için bir görüntü kaydetmek - 96 saat, bu yaklaşık 20 alan bir 96-delikli plaka için bir ters mikroskop (kullanarak, söz konusu hücre çizgisi, istilası hızına bağlı olarak - 30 dakika). 10X objektif kullanarak. Bir işgal alanı tamamen görüş 10X alanı içinde çekilecek çok büyük olduğunda 4X hedefi kullanın. </li><li> Edinilen her görüntü kaydetme. </li><li> Kalibrasyon için, hem 10X ve 4X hedeflerini kullanarak bir sahne graticule (1 mm) görüntülerini almak (ve görüntüleri kaydetmek). </li></ol> 6. Manuel Görüntü Analizi <ol><li> Seçim görüntü analizi yazılımı içine sahne graticule görüntüleri açın. </li><li> Grat girinicule ölçümler, birimler (um), hedefleri kullanılan (10X veya 4X) ve kalibrasyonu yapın. Bu adım sadece bir kez gereklidir. Sonraki görüntü analizi için, sadece gerekli kalibrasyon ayarlarını yükleyin. </li><li> Işgali tahlil görüntüleri açın ve mikroskop objektif (10X veya 4X) bağlı kalibrasyon ayarları seçmek görüntüler elde etmek için kullanılır. <ol><li> Içbükey bir mikroskop kullanarak elde edilen görüntüler için tarif edildiği gibi (Şekil 3 ve Şekil 4&#39;te gösterilen sonuçlar), alternatif olarak, alma ve görüntüler (aşama 3) sitometresi bir görüntüleme elde elle analiz eder. </li></ol></li><li> Sferoidler kapsadığı alanı ölçün. <ol><li> (Özellikleri Ekipman ve Malzeme Tablo bakın) Temsilcisi Sonuçlar Burada kullanılan yazılımlar, &#39;Tedbir&#39; gidin ve seçmek ise &#39;/ boyutunu Kont&#39;. &#39;Dosya&#39; ardından &#39;Load ayarları&#39; seçti ve önceden belirlenmiş assa seçiny ayarlar. Ardından &#39;Kont&#39; seçin. sfero sonra doğru parçalı edilmelidir. </li><li> Alternatif &#39;Sihirli Değnek / Trace&#39; penceresini açmak için &#39;Nesneleri Birleştirme / çizin&#39; ardından &#39;Düzenle&#39; gidin. Sfero resmin üzerine tıklayın ve segmentasyon elde etmek için değnek imleci kullanın. Elle fareyi kullanarak sfero anahat (&#39;Sihirli Değnek&#39; penceresinde) &#39;İz&#39; seçeneğini seçin. </li></ol></li><li> Bir e-tabloya farklı parametreler (alan, çap, çevre vs.) İhracat ölçümleri. Tablo üzerinde Tutanak ilgili görüntü bilgisi (örneğin, iyi sayı, nispi zaman noktası). </li><li> Bilimsel grafik ve istatistiksel yazılımı kullanarak zamana karşı çoğaltmak sferoidler (işgali) ortalama alanını çiziniz. Seçenek olarak ise, t alanına göre her zaman noktasında küremsi bölgede değişim hesaplamak = 0 sonra olaylar istilası (% t0) doğrusal gra olarak zamana karşıph. </li></ol>

<ol>
	<li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+vs.+Three-Dimensional+In+Vitro+Tumor+Migration+and+Invasion+Assays.">Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays.</a> Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).</li><li>Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+formation+in+oral+squamous+cell+carcinoma:+the+role+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling.">Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling.</a> Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+invadopodia+formation+for+lung+carcinoma+invasion+with+a+microfluidic+3D+culture+device.">Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device.</a> PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).</li><li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+invasion+and+the+microenvironment:+plasticity+and+reciprocity.">Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li><li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion.">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415 (2009).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Deisboeck, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+self-organization+in+tumour+systems:+complex+growth+dynamics+in+a+novel+brain+tumour+spheroid+model.">Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model.</a> Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29 (2012).</li><li>Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods and Protocols. , 253-266 (2013).</li><li>Box, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum+protein+signature+associated+with+resistance+to+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).</li><li>Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+growth+factors+on+invasion+and+proliferation+of+endocrine+resistant+breast+cancer+cells.">Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).</li><li>Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+is+expressed+by+human+glioma+in+vivo+and+shows+a+strong+association+with+tumor+blood+vessels.">Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels.</a> Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+glioblastoma+cells+acquire+stemness+and+increased+Akt+activation.">Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation.</a> Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).</li></ol>

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması rakip beyan ederim.

Burada açıklanan iki tümör modelleri (glioblastoma ve SCCHN) özel klinik olarak etkili tedaviler 12 karşılanmamış bir ihtiyacı olan uygun lokal invaziv kanserler gibi bizim 3D tahlil örneklemek üzere seçildi. Ilaç tedavisi, in vitro farmakodinamik (PD) biyobelirteç değişikliklerin değerlendirilmesi BMM ve / veya bütün tümör parçacıklarının istila immünofloresan analizi hücre kurtarma izin vermek için belirli bir ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanımından sonra Western blot ya lizatların bağışıklık ile kolayca gerçekleştirilebilir aşağıdakı montaj boyama. Bu işgal tahlil bir yararlı olan bir yarı katı ortam içine tümör hücresi istilasını hızlı ve yeniden üretilebilir bir değerlendirme için bir teknik ve in vitro ilaç tarama gelecek için, bu nedenle özellikle uygundur. Kanser hücreleri tümör sfero tarafından temsil edilen bir &quot;mikro-tümör&quot;, dışarı yayıldı gibi bir 3D şekilde matris işgal ve bir extracellul içine uzatmakar matris gibi bir ortam. deneyinin gerçek üç boyutluluk, katı bir substrat üzerinde hareket ederken hücreler kabul düz, yapışkan morfolojisi farklı hücre morfolojisi, belirgindir. istila derecesi kolay ya da görüntüleme yazılımı ile kombinasyon halinde, standart bir mikroskop kullanılarak otomatik bir okumasını sağlayan sitometresi görüntüleme kullanılarak ölçülür. Ayrıca, bu yöntem, uygun bir flüoresan görüntüleme 13 (floresan proteinleri veya ifade eden hücre çizgileri, örneğin floresan boyalar ile birlikte, önceden etiketlenmiş). küremsi arasında merkezi bir konuma rahatsız riski olduğu zaman bir yöntem BMM eklenmesiyle ile temsil edilen sadece kritik bir aşama ile gerçekleştirmek için basit bir de U-şeklindedir. Bu farklı odak düzlemlerinde sferoidlerle, optimal görüntü analizi ile sonuçlanabilir. O her oyuğa dikkatlice ve yavaşça BMM eklemek nedenle önemlidir. BMM ek sonra plaka kontrol edilmesi tavsiye ediliryerelleştirme kabul edilemez ise mikroskop altında ve bu nazik santrifüj çözülebilir. Tecrübesi ile, bu nadiren gereklidir. Bu yöntem dayanıklı ve yeniden üretilebilen iken arası deney varyasyonu BMM farklı gruplar ile oluşabilir. Bunu önlemek için, bu çalışma bir dizi tamamlamak için tek bir toplu yeterli BMM satın almak için tavsiye edilir. Yöntemin bir sınırlama (herhangi bir tür deneylerde olduğu gibi), tümör hücrelerinin muhtemelen deney zaman dilimi içinde tabi yayılmasını ve çoğalmasını, ayırt edilmesinin güçlüğüdür. Hücrelerin iki katına çıkma süresi dikkate alındığında, ya da sitokalasin D gibi hücre döngüsü önleyicileri dahil edilebilir, ancak bu kontrol etmek ya da açık bir şekilde, özellikle hızlı büyüyen tümör hücreleri için ve bu tümör ilerlemesi, bu iki farklı açıdan birbirinden ayırt etmek kolay olmadığı bir daha &quot;geniş&quot; yerine infiltrasyon, işgal desen var. Bu nedenleBu paralel bir 3D büyüme deneyi herhangi bir inhibitör ya da uyarıcı maddelerin spesifik etkisini değerlendirmek için gerçekleştirilmektedir önerilmektedir. Dikkatli doz yanıt çalışmalar yapılmaktadır, bu çoğalması üzerindeki etkilerini en aza indirmek konsantrasyonları seçmek mümkün olabilir. Mesela HSP90 17-AAG% 50 (GI 50) 12 3D büyümesini inhibe etmek 24 saat sonra ve konsantrasyon altındaki konsantrasyonlarda önce, U-87 mg 3D tümör küremsi invazyonu inhibe inhibitörü olduğunu göstermiştir. Öte yandan, bu deneyde önemi diğer standart invazyon tahlilleri (örneğin, filtre dayalı tahliller ya da 3 boyutlu matrislerle 1 içine tek hücrelerin istila) ile karşılaştırıldığında, tümör hücrelerinin benzer olduğunu, sfero çevreleyen matris içine işgal olduğunu &quot; Bu nedenle mikro tümör &quot;ya da bir&quot; mikro-metastaz &quot;ve tümör kitlesi patofizyolojisinde hesabı önemli yönlerini içine alır. Sunduğumuz yöntem hakkında bilgi verirBaşlangıçta sferoitleri bırakarak, hem de bireysel olarak, tek hücreler BMM daha uzak bölgelere ulaştığında tümör hücrelerinin, kolektif davranış. Ayrıca, tümör küremsi içinde hücreler hipoksi ve besin yoksunluğu yaşayabilirsiniz ki, gen ifadesi değişiklikler yoluyla, göç ve işgali teşvik edebilir; Bu tür özellikler 2D deneylerde yoktur. Ayrıca, tüm bu daha karmaşık bir 3D deney kolay hedef doğrulama ve ilaç keşfi kullanılmak üzere izin, belirli bir 96 oyuklu plakalar kullanılarak yüksek verimli bir format ve son görüntüleme tekniği mevcuttur. Sunduğumuz yöntem tümör hücresi invazyonu ek yönlerini ele ileri uygulamalar barındırabilir. Özellikle, karmaşıklık sfero kendisi ve saran matris içine, fibroblastlar ve / veya endotel hücreleri gibi konakçı hücreler, ilavesiyle düşünülebilir. Bu aynı zamanda, sertlik bakımından (çeşitli ortak kullanımı ile değil, değiştirilebilirBMM ncentrations) değil, aynı zamanda bileşim açısından (kabul tümör modelinde özel doku / organ göre diğer bileşenlerin eklenmesiyle: Meme karsinomu 17) beyin kanserleri 16 ve kollajen örneğin, tenasin. (Sferoitlerin ve görüntüleme) yol benzer bir düzenleme, aynı zamanda, tümör sferoidler ya da diğer hücre spesifik organoids (örneğin, astrositler ile kompleks doku 12 benzeyen embriyoid organları ile birlikte kültürlenir 3D, doku istilası değerlendirmek için adapte edilebilir glioma 18 veya kript gastrointestinal kanserler için kültürler), ancak daha fazla çalışma otomatik görüntü analizi etkinleştirmek için gereklidir.

Klasik kanser ilaç geliştirme, tümör hücresi çoğalmasını inhibe eden ve / veya programlanmış hücre ölümünü (apoptoz) teşvik sitotoksik maddelerin taranması için in vitro hücre-esaslı tahliller kullanımı büyük ölçüde odaklanmıştır. Daha yakın zamanlarda, çabalar habis hücre çoğalması yatan moleküler nedenlerinin inhibitörlerinin gelişimi ile hedefli tedavilerin doğru taşındı. Bazı muhteşem sonuçlara rağmen, bu tür maddeler genellikle ilaç direnci hızla gelişmesi ile ilişkilidir. Kanser ölümlerinin çoğundan sorumludur tümör hücrelerinin invaziv ve metastatik potansiyeli olduğunu ve nüks hastalık genellikle, bu in vitro deneysel modellerde romanı tanımlamak için 1,2 tamamlayıcı dikkate almak da mantıklı bir daha agresif fenotip sunduğu göz önüne alındığında bu kanser ek anahtar &#39;işaretlerinden&#39; inhibe edecek ajanlar. Habis ilerlemesi esnasında, tümör hücrelerinin eldeçevreleyen doku işgal ve / veya uzak organlara (metastaz) yayılabilir yeteneği. Kanser hücreleri invadopodia 3,4 oluşumu ile bazal membran nüfuz eder. Bu yapılar, aktin filamentler, belirli bir yapışma proteinleri ve proteinaz ile zenginleştirilir ve toplu tümör hücre motilitesi ve hücre dışı matrisi (ECM) 5 degradasyonundan sorumlu olan. Invadopodia ECM içine uzanır ve tümör hücre istilası için önemli olduğu ve aynı zamanda kan yoluyla (ya da lenfatik) yayılması ve metastazının kolaylaştıran, vasküler kanallara ekstravazasyonu inanılmaktadır. Mevcut standart metotlar şunlardır, in vitro olarak tümör hücresi istilasını değerlendirmek. Transwell tabanlı veya Boyden haznesi deneyleri, tek hücre süspansiyonları, ECM-türevli proteinler kalın bir tabaka ile kaplanmış bir filtre üzerine ekilir 2,6. Hücreler daha sonra, istila ve kemo-cezbedici yanıt olarak alt bölme içine hareket eder. Yaygın kullanılan ECMproteinler tip I kollajenin, ya da temel zarların doğal bileşimi benzer (EHS tümöründen 7 türetilen BMM, örneğin, Matrigel), bir bazal membran benzeri bir matris. Filtre tabanlı Boyden odasının tipi deneyleri 8 bir alternatif olarak, hücreler jel içine işgal ayrı ayrı veya topluca, sonra, bir tek tabaka ve biçim (fibroblastlar ilave edilebilir olduğu) bir ECM jel üzerine tohumlanabilir. Invasion jel yüzeyi 9 gitti işgal hücreler ve / veya mesafe sayısı cinsinden ölçülebilir. Genellikle hücreleri çevreleyen matris 2,6,10,11, tümör kütle üzerinden işgal etmeye izin ECM Jel- iki katman arasına yerleştirilen - Tümör hücreleri, aynı zamanda, bir matris içine ya tek bir hücre süspansiyonu olarak ya da küresel cisimler olarak gömülebilir. Burada tarif edilen üç boyutlu (3D), tümör istilası küremsi tahlil bir highli kullanılarak hızlı, otomatikleştirilebilir istilası sistemi sağlarOyuk başına bir sfero sahip 96 oyuklu bir plaka formatında y tekrarlanabilir, standart bir yöntem 12. BMM tümör hücreleri, sferoid vücuttan işgal içine, bir yarı-katı bir matris sağlamak üzere her bir oyuğa, doğrudan ilave edilir. 96 saat - tümör hücresi istilasını derecesi 72 arasında bir süre boyunca aralıklarla izlenir. Bu yöntem, yukarıda belirtilen mevcut in vitro invazyon tahlilleri aşağıdaki avantajları sağlar: hücre, bir tümör mikro-bölge veya mikro-metastazı taklit 3D yapı halinde organize tümör; Tümör sferoidler boyutunda yüksek oranda tekrarlanabilir; işgali tahlil ikincil plakalara taşımak gerek kalmadan, tümör sfero geliştirme gibi aynı tabakta in situ yapılır; otomatik bir görüntü analiz son teknolojileri ile bir araya yöntem olup, her ikisi de yüksek oranda sağlar ve yüksek verimli, tümör hücresi istilasını analiz eder. Görüntü analizi bir 96-yuvalı tarar sitometresi görüntüleme kullanılarak gerçekleştirilir10 dakika içinde plaka. Kesişme uygulamasını kullanarak, kapsamı ve istila oranı tek hücre ya da hücre kümeleri, tümör kürelerinden yayılan ve dinamik bir şekilde ölçülebilir matris içine işgal yoluyla elde. Düşük hacmi, görüntü analizi için alternatif bir yöntem, bir ters mikroskop ve standart görüntüleme yazılımının kullanılması göre sunulmuştur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:297px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Web address</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354234</td>
			<td>http://www.corning.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear</td>
			<td style="width:161px;">Trevigen</td>
			<td style="width:135px;">3432-005-01</td>
			<td>http://www.trevigen.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultra-low attachment 96-well plate</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">7007</td>
			<td>http://www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">EGF</td>
			<td style="width:161px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-093-825</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com 
			Add 100 &#181;l 1% BSA (w/v) in water to 100 &#181;g EGF. To 25 &#181;l of this, add 4,975 &#181;l RHB-A medium to give a 10 &#181;g/ml working stock. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">RHB-A medium</td>
			<td style="width:161px;">Stem Cells Inc.</td>
			<td style="width:135px;">SCS-SF-NB-01</td>
			<td>http://www.stemcellsinc.com 
			For diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">31966-021</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:161px;">Biosera</td>
			<td style="width:135px;">1001/500</td>
			<td>http://www.biosera.com 
			Heat at 56 &#176;C to inactivate complement before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">12605</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">Celigo cytometer</td>
			<td style="width:161px;">Nexcelom Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.nexcelom.com 
			Specialist equipment for image capture and analysis.&#160; Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IX70 inverted microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.olympus.co.uk/ 
			Used with camera for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:297px;">Retiga Exi Fast 1394 digital camera</td>
			<td style="width:161px;">Qimaging</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.qimaging.com/ 
			Attached to microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Software used to control camera and microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Analyzer 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Excel 2010</td>
			<td style="width:161px;">Microsoft</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.microsoft.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Prism 6.0</td>
			<td style="width:161px;">GraphPad</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.graphpad.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay

Tümörler (iyi huylu karşıt olarak), normal dokuların Invasion genel malign önemli bir özelliğidir olarak kabul edilir. Özellikle bazı kanserler için (. Örneğin, bu tür glioblastoma multiforme ve baş skuamöz hücreli karsinom ve boyun gibi beyin tümörleri - SCCHN) şiddetli bir morbidite nedenidir ve yaşamı tehdit eden uzak metastaz yokluğunda bile olabilir. Buna ek olarak, relaps kanserleri, ne yazık ki sık sık, bu daha agresif bir fenotip ile işleme tabi. Bu nedenle, standart anti-proliferatif ajanlar tamamlayıcı olabilir yeni tedavilerin sağlamak işgali sürecini hedef için bir fırsat var. Şimdiye kadar, bu strateji işgalinin ayrıntılı bir analiz için ve ilaç taraması için uygun, sağlam, tekrarlanabilir testlerinin olmaması engel olmuştur. Burada basit bir mikro-plaka yöntemi sağlayan (üniforma dayalı, kendinden montaj 3D tümör parçacıklarının) bu tür stu için büyük bir potansiyele sahipölür. Ayrıca, bir insan glioblastoma hücre çizgisi ve hedeflenen epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) engelleyicilerine karşı direnç gelişimi geliştirilmiş matris invaziv potansiyeli ile ilişkili bir SCCHN modeli kullanılarak analiz platformu örnekler. Sitometresi bir görüntüleme kullanarak tek ve basit bir dijital görüntü analizi ile standart mikroskopi ve görüntü yakalama gerektiren ikinci bir: Biz de yarı otomatik ölçümü iki alternatif yöntemler sağlar.

3B, tümör istilası küremsi şematik olarak Şekil 1 &#39;de gösterilen basit ve tekrarlanabilir, otomatik bir yöntem kullanılarak tayin edilmiştir: tekrarlanabilir boyutlu tümör sferoidler ULA 96-gözenekli yuvarlak tabanlı plakalara hücreleri kaplama ile elde edilir. 4 gün sonrası inisiyasyon sferoidler BMM içine gömülürler. Bu tümör hücreleri istila eder ve sfero yayılmış içine bir yarı-katı bir yapı sağlar. Sitometresi görüntüleme kullanarak 96 saat - sferoidler BMM içine her bir taban ve istila merkezi bir konumda yer almaktadır kolay t = 0 72 için başlangıç ​​aralıklarda izlenmektedir. Bu tamamen otomatik bir görüntü analiz ortaya koyar. Kanser hücresi yayılımını tamamen farklı tiplerinin örnekleri, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir -. 4 yüksek malin insan glioblastoma multiforme (GBM) hücre çizgisi, U-87 mg, sıkı, küresel 3D yapısı oluşturur ve beyin tümörleri örnek için kullanılan yerel hangi işgali önemli bir yaşamı tehdit eden birözellik. Bir kez BMM gömülü, tipik bir &quot;dolup taşan&quot; istilası deseni 12 ile yayıldı U-87 MG sferoidler hücreleri. Tümör hücreleri, radyal olarak bir 3-boyutlu bir şekli muhafaza içinde matris içine uzanır. BMM içine uzanan hücresel süreçlerin ayrıntılarını ve invadopodia tümör hücresi istilasını ölçüde, açık bir şekilde belirgin olan, U-87 mg sferoidler için, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, işlem 72 saat arasında bir süre boyunca takip edilir. Tam zamanla tümör hücre istilası hassas kantitatif sağlar sitometresi bir görüntü ile görüntü analizi otomatik. otomatik analiz U 87 mg sferoid gövdeden BMM içine uzanan cep uzantıların etrafında segmentasyon üreten Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, Şekil 2&#39; de miktar elde edilir. Bu hücre kuşağı için tümör küremsi bağışıklık tepki alanının ölçülmesi dışında olduğunu not edin. Invas farklı bir deseniyon insan skuamöz baş ve boyun kanseri hücre hatları tarafından sergilendi. CAL S ve CAL R izojenik ama CAL S duyarlıdır ve EGFR tirozin kinaz inhibitörleri 14 dirençli CAL R. EGF yokluğunda, ne de hücre çizgisi BMM (Şekil 3) EGF konsantrasyonu artış gibi, ancak (2.5 ng / ml), sferoidler &#39;tomurcuk&#39; görünür işgal. EGF (40 ve 80 ng / ml) istila derecesi daha yüksek konsantrasyonlarında indirgendi. Bu, daha önce 15 bildirilmiştir istilası açısından EGF&#39;nin klasik, çan şekilli doz tepki ile tutarlıdır. 20 ng / ml EGF, CAL S hücreleri iken CAL R sferoitlerin ana gövdesinden ekstrüde parmak şeklinde çıkıntılar 72 saat (Şekil 3) sonra daha az invazif idi. Sferoidler hücre hatları arasında maksimum fark için 20 ng / ml EGF içeren BMM (konuldu sonra bu ayırıcı istilası 48 saat açıktı) Ve 72 saat sonra en yüksek (Şekil 4). Bu görüntüler U-87 MG gibi, sitometresinin bir görüntüleme kullanarak hızla elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu durumda, alternatif bir yöntem örneklemek için, istila derecesi, tek başına görüntü analizi yazılımını kullanarak elle ölçüldü ve grafik olarak sunulmuştur (Şekiller 3 ve 4). Bu sonuçlar, spesifik ilaca dirençli, invaziv fenotip antagonize edecek bileşiklerin taranması için yararlanılabilir ilaç-duyarlı ve dirençli hücreler arasında, bir fenotipik fark gösterilmektedir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> 3D tümör sfero işgali tahlil 1. şematik bir bakış Şekil. İş akışı sadece BMM içine gömme sonra yöntem U-87, MG glioblastoma sferoitlerin temsili görüntüler dahil olmak üzere içerir adımları gösterir (üst paneli t = 0) ve işgalden sonra<html> BMM içine; ve işgalci hücreleri kapsadığı alan ölçen segmentasyon olmadan (alt panel t 72 saat =). Bar = 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> Ve BMM. U-87, U-MG içine 87 MG glioblastoma sfero işgali Şekil 2. Zaman kurs BMM içine 3D işgali izlenir ve sitometresi bir görüntüleme kullanarak 72 saat kadar ölçüldü sfero. (A) Temsilcisi görüntüleri ve (B) kantitatif Tümör hücre istilası gösterilmiştir. Bar = 500 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 3 re &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; (Dirençli) Şekil 3. CAL R ve S CAL (duyarlı) tümör sfero işgali. (A) Temsilcisi görüntüleri ve (B) EGF doza bağımlı CAL R ve S CAL tümör sfero işgali manuel ölçümü gösterilmektedir. Bar = 500 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> B yerleştirildiğinde Şekil 4. CAL R hücreler (dirençli) sferoidler CAL S (duyarlı) tümör sferoitlerin daha invazivEGF stimülasyon CAL R tümör sferoidler bir CAL S daha belirgin işgali. (A) Temsilcisi görüntüleri ve (B) işgali manuel miktarının göstermek üzerine MM. Gösterilmiştir. Bar = 500 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

56.9K Görüntüleme.  The Institute of Cancer Research. Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Video: Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Tıp

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üç Boyutlu Model İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

Karmaşık bir aort anomali üç boyutlu baskı

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...