Bu çalışma IG Wellcome Trust ve BBSRC hibe tarafından desteklenmiştir. IG Wellcome Senior Fellow.

1.. Üretimi ve SILAC etiketli Hücre Hatlarının Pasajlanması Not: tripsin örneklerin eksik etiketleme yol açacak etiketsiz amino asitleri içerebilir olarak tripsin-EDTA kullanımının analizi için deneysel örneklerin pasaj ve hazırlama tüm aşamalarında kaçınılmalıdır. <ol><li> SILAC ortamın hazırlanması için bir şişe içeren (Arg / Lys DMEM bir 500 ml şişeye, bir uygun SILAC etiketli argininin (84 mg / ml PBS içinde) ve lizin (PBS içerisinde 146 mg / ml) içinde bir 0.5 ml bir kısım eklemek L-glutamin). </li><li> Daha sonra, 500 ml şişeye diyaliz edilmiş FBS ve 50 ml penisilin / streptomisin, 5 ml ekleyin. Not: HEK 293T hücreleri (ATCC) yoksun DMEM ortamı içinde muhafaza edilmelidir arginin ve lisin ve ışık (R0K0) ile desteklenmiş, orta (R6K4) ya da ağır (R10K8) amino asitler, diyaliz edilmiş cenin sığır serumu (10 kDa kesim) ve penisilin / streptomisin. Hücreler, tam sağlamak için 5 hücre bölünmesi en az ortam içinde muhafaza edilmelidiretiketleme. Çoğu durumda, hücreler kolaylıkla ≥ 2 hafta içinde etiketlenir. </li><li> Geçiş için hücreleri bölmek için, hücreler şişeyi vurarak tek tabaka yerinden alınmalıdır. Alternatifler hücre kazıyıcı ya da enzim içermez, PBS-tabanlı bir hücre ayırma tamponu ile kullanımını içerir. Not: ortamını korumak için, hücreler T25 kaplarına aktarılmıştır edilmeli ve büyük hücre sayıları yalnızca hemen önce bir deneme oluşturulur. </li><li> Önce transfekte hücrelere 24 saat, inceleme altındaki her deneysel koşul için tek bir 10 cm 2 çanak içine 3.5 x 10 6 SILAC etiketli hücreler tohum. </li></ol> PEGFP-füzyon Yapıların ile Etiketli Hücreler 2. Transfeksiyonu <ol><li> Hücrelerden ortamı çıkarın ve antibiyotik içermeyen SILAC DMEM&#39;den (Hafif, Orta veya Ağır) medya 9 ml ile değiştirin. Not: lipozom-esaslı transfeksiyon reaktifleri verimliliğine müdahale olabilir çünkü Antibiyotikler ortama ilave edilmemelidir. </li><li> PrepaUygun plazmidi 10 ug bir karışımı yeniden (epEGFP-C1, pEGFP-eIF4A-I, pEGFP-eIF4A-II) antibiyotik içermeyen SILAC DMEM 500 ul ve antibiyotik içermeyen DMEM SILAC 10 ihtiva eden 500 ul ile karıştırarak transfeksiyon reaktifi ul (örneğin, lipofektamin 2000). Yukarı ve aşağı pipetleme birkaç kez iyice reaksiyonu karıştırın. </li><li> 20 dakika boyunca, oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı inkübe edin ve daha sonra damla damla, hücre mono tabakasına ilave edin. Yanlara doğru hafifçe plaka sallayın. </li><li> 37 ° C&#39;de transfekte hücreler inkübe edin ve% 10 CO2, 24 saat boyunca. Not: belirgin bir toksisite ilgi sonuç, bir proteinin ifadesi, o zaman transfekte edilen plazmid miktarı ve / veya daha sonraki sentezleme dönemin süresini azaltmak için gerekli olabilir. </li></ol> 3.. Hasat hücre lizatları <ol><li> Bir hücre kazıyıcı kullanarak buz gibi soğuk PBS içine çanak Hasat hücreleri. 4, 220 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplayın76, 5 dakika boyunca C. Buz soğukluğunda 10 ml PBS içinde hücreleri bir başka 3 kez yıkayın. </li><li> Hücre parçalama tamponu 200 ul 5 ul 1x konsantrasyon ve RNaz kokteyl (isteğe bağlı) de taze ilave proteaz önleyici kokteyl III ihtiva eden (10 mM TrisCI / pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA,% 0.5 NP-40) &#39;de, hücre pelletini ml başına. Not: bağlanma aktivitesi, bilinen nükleik asit ile proteinler için, önce çökelmesine lizat nükleazlar eklemek için gerekli olabilir. Nükleaz eklenmektedir durumlarda, numuneler her 10 dakikada bir pipetleme ile, buz üzerinde 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilmelidir. Agaroz jel elektroforezi ile analiz numunesi ve küçük bir kısmı toplam nükleik asit ayıklama nükleaz etkinliğini test edebilir. </li><li> 13,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri, 10 dakika boyunca 4 ° C, çözünür hücre lizatı gibi süpernatant saklayın. </li><li> Hücre lizatının konsantrasyonu, üretici firmanın talimatlarına uygun olarak BCA deneyi ile değerlendirilmelidir. </li><li>500 ul&#39;lik bir nihai hacimde protein konsantrasyonu normalleştirmek için proteaz önleyici kokteyl III ihtiva eden liziz tamponu kullanın. </li><li> Seyreltme tamponu içinde 500 ul eklenmesiyle 1x nihai konsantrasyonda proteaz önleyici kokteyl III ihtiva eden (10 mM TrisCI / pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) ile, 1 ml için ses ayarlayın. Numunenin 50 ul alikosu, numune girişi olarak muhafaza edilmeli ve lizat (örneğin, GFP-trap), anti-GFP boncuk hazırlama esnasında buz üzerinde tutuldu. Not: Tipik verimler, nihai 1 ml numune içinde protein 1-3,5 mg arasında değişir. Yukarıdaki tampon ilgi çekici pek çok protein için uygun iken, diğerleri için yem protein çözünebilir sağlamak için ve protein-protein etkileşimleri korumak için tampon bileşenleri değiştirmek için gerekli olabilir. Olası değişiklikler tamponlama maddesi (fosfat, HEPES), tuz konsantrasyonu (150-500 mM), deterjan seçimi veya diğer katkı maddelerini içerir. </li></ol> 4.. Anti-G BağlamaFP Boncuk <ol><li> Kısaca boncuklar tekrar süspansiyon boncuk bulamaç vorteks. Ucu olan bir 200 ul bir pipet ucu kullanılarak kesilmiş, yeni bir tüpe örnek başına 25 ul boncuk aktarın. Not: kullanıcı örnek-örnek varyasyonu en aza indirmek için bir master olarak tek SILAC deney için boncuk hazırlamalıdır. </li><li> Boncuk bulamacın her 25 ul için, 5 dakika boyunca 2,700 x g de boncuk seyreltme tamponu 20 hacim (75 ul bulamaç başına 1500 ul) ekleyin ve santrifüj. Daha sonra, seyreltme tamponunun 20 hacminde boncuklar bir başka 2x yıkayın. </li><li> 25 | il boncuk çamuru başına 100 ul seyreltme tampon çözeltisi ekleyin. Ucu olan bir 200 ul ucunu kullanarak, kesme aşamasında 3,6 SILAC etiketli numunelerinin her biri için bu yeniden süspansiyon haline getirilmiş bulamaç 85 ul transfer. </li><li> 2 saat boyunca 4 ° C&#39;de bir karıştırıcı üzerine boncuklar ile inkübe edin. </li></ol> MS Analizi için Numune 5. Yıkama, sıyrılması, ve Hazırlama <ol><li> 2700 xg santrifüj örnekleri, 46, 5 dakika boyunca C. Süpernatan 50 ul üstte yüzen madde atıldı ve geri kalan, bağlanmamış numune olarak muhafaza edilmelidir. </li><li> 1 ml seyreltme tamponu boncuklar tekrar süspansiyon her bir tüpe ilave edilmelidir ve numune 5 dakika boyunca 4 ° C, 2700 x g&#39;de santrifüj edilir. Süpernatan atılmalıdır. Bu, iki kez uygulanmalıdır. </li><li> 2x SDS yükleme tamponu içinde 50 ul eklenmesi ile boncuklardan proteininin elüt edilmesi, ve 10 dakika boyunca 95 ° C&#39;de ısıtma. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 2700 x g&#39;de santrifüjleme ile boncuk Pelet </li><li> Kullanılana kadar daha sonra -80 ° C&#39;de saklanabilir yağlanan tüpler içinde süpernatant saklayın. Bir kütle spektrometresi tesisine sunulması için, etiketli örnekleri 01:01:01 (örneğin, her biri 10 ul) karıştırın ve karışık örneğini göndermek. Not: Bu noktada numune western blot, gümüş lekeleme ya da bilinen / bilinmeyen bağlanma partnerleri ile etkileşim için test etmek için başka yollarla test edilebilir. Bir örnek şekil l&#39;de verilmiştirwestern blot ile eIF4G ve ilgi konusu bir protein açılan numuneleri içinde bulunan gümüş boyama bantlarının görünüşü, fakat, bir kontrol numunesi, - bilinen bir etkileşim ortağının spesifik bağlanma gösteren ure 2. </li><li> LC-MS/MS analizi için örnek gönder. Not: bir ilgi etiketli protein başarıyla etkileşim ortaklarını, her etiketli örnek eşit hacimlerde (hafif, orta ve ağır) birleştirildi ve LC-MS/MS analiz için gönderilen bağlayıcı olduğunu bir kez memnun. Bu analiz için, bir IP örnek 30 ul toplam gönderme olağandır. Bu, 30 ul toplam vermek üzere orta-etiketlenmiş ve 10 ul ağır etiketli örnekler 10 ul ile hafif etiketli örnek 10 ul karıştırma açmak olur. </li></ol> 6 Veri Analizi I:. Sonuçlar anlama ve Düşük güven Tanınmaları çıkarılması Not: Proteom Discoverer yazılım tarafından döndürülen sütun başlıklarının bir listesi Tablo 1&#39;de verilmiştir dif.ferent yazılımı (örneğin, MSQuant, MaxQuant), ancak bu yalnızca bir alt kümesini farklı başlıkları döndürecektir analiz için gerekli ve bu çeşitli yazılım paketleri için ortak vardır. Veriler her zaman oranı en her örnek oranını karşılaştırarak tanımlanan her protein için bir erişim numarası, (orta vs hafif, ağır vb vs ağır, orta vs ışık) içermelidir, tanımlanan benzersiz peptidler sayısı ve yanlış pozitif oranı ya da güven göstergesi çeşit. <ol><li> Veri üzerinden gitmeden önce, ilk olarak yeni bir elektronik tabloya ham verileri kopyalayın. Bu tablonuzda üyelik numarasını vererek dışındaki tüm sütunları kaldırmak, eşsiz peptidler sayısı, örnekleri, oran değişkenlik ve protein açıklamasını karşılaştırarak oranları. Çoğaltma deneyler olsaydı, bu her deney ayrı bir sekmede görünen ile, tek bir Excel dosyası içine kombine edilmelidir. Not: Hafif güven veriler sadece tek tek peptid tarafından tanımlanan proteinler içerir ve bu wburada miktar mümkün değildi. </li><li> Peptidler sayısına göre verileri sipariş ve birden fazla peptid eksik proteinlerin girdileri kaldırmak için üstünlük &#39;çeşit&#39; işlevini kullanın. Sonra oranına göre sıralamak ve SILAC oranları (belirlenmemiş proteinler) eksikliği proteinleri uzaklaştırmak. </li><li> &#39;SILAC Oranı&#39; hücre tanımlayıcı için ikame edilir &#39;= log (SILAC Oran, 2)&#39;: formülü kullanarak günlük 2 değerlerine SILAC oranları dönüştürün. Not: 0 ve 1 arasında bir değere sınırlı olduğunu bolca bir azalma gösteren proteinler için herhangi bir veri oranının bir SILAC Sonuç olarak, bu artmış ya da azalmış proteinleri de anlamına gelir, bir günlük 2 SILAC oranına bir oranını SILAC dönüştürmek olağandır örnek 2 veya -2, 4-kat artış veya azalma bolca ve 3, ya da -3 9-kat bir artış ya da azalma, sırasıyla bolca temsil eden bir log ölçeğinde temsil edilmektedir. Bu dönüşümden sonra, veriler bir Ga oturmalıdır0 ile 2 arasında bir günlük SILAC oranı etrafında ussian dağılımı. Bunun bir örneği, Şekil 3&#39;te verilmiştir. </li><li> Excel dosyasında yeni sütunlar oluşturun ve tüm numune / sahte sütunları 2 SILAC oranları log hesaplamak. &quot;= 1/ratio&quot;: Bir örnek / sahte oranı bir sahte / numune oranı dönüşüm için, formülü kullanın </li></ol> 7 Veri Analizi II:. Ek Çalışması için Yüksek Güven etkileşimler seçilmesi <ol><li> Açık Graphpad Prism, Yeni&gt; Veri Tablo ve Grafik penceresinin sol taraftaki listeden ... Seç &#39;sütun&#39; seçeneğini seçin ve Enter / İthalat verileri seçin&gt; sütunlar seçenekleri içine yığılmış çoğaltma değerleri girin. Basın &#39;Oluştur&#39;. </li><li> Seçmek ve yeni Prism dosyasına Excel elektronik verilen bir günlük 2 örnek / Mock SILAC oranı sütun kopyalamak. </li><li> Açılan &#39;Ekle&#39; menüsünü tıklayın ve &#39;Yeni analizini&#39; seçeneğini seçin. Sütun analiz altında &#39;seçeneğiniFrekans dağılımı &#39;. Varsayılan seçenekleri tutulması &#39;Tamam&#39; ı tıklatın. Not: Bu adım, belirli bir oranda belirlenen protein sayısını gösteren bir çubuk grafik oluşturur. Bu, Gauss dağılımı oluşturmalıdır. </li><li> &#39;Sonuçlar&#39; klasöründe yeni bir &#39;histogram&#39; bölümünde oluşturulan edilmiş olacaktır. Frekans dağılımı bölümünü seçin. </li><li> Açılan &#39;Ekle&#39; menüsünü tıklayın ve Yeni analizi seçin&gt; XY&gt; Doğrusal olmayan regresyon (eğri). &#39;Gauss dağılımı&#39; üzerine tıklayın ve Tamam&#39;a tıklayın. Not: Bu adım, daha sonra anlamlılık için eşik hesaplamak için kullanılabilir değerleri elde edildi, aşama 7.3 &#39;de elde edilen frekans dağılımı verilere bir eğri uyar. </li><li> Görünen sonuç penceresinde, ortalama ve standart sapma verilmiştir. Ortalamaya 1.96 standart sapma ekleyerek bir eşik oluşturmak. Not: Bu değerler ortalama ve Gauss dist standart sapmaları temsilmalara değil, toplam veri kümesi. 1.96 standart sapma% 95 güven sınırı (p ≤ 0.05) bir eşik yer olacaktır. 2.58 SD% 99 ve 3.3 SD% 99.9 verecek. Bu değişiklik gibi eşik her kopya deney için ayrı ayrı belirlenmelidir. </li></ol> 8 Veri Analizi III:. Kopya Kümeleri birleştirme Not: Tipik bir SILAC açılan deney ideal sonuçlar üzerinde herhangi bir medya etkisini kontrol etmek tekrarlar biri için açık orta ve ağır etiketli örnekleri ile, üç kez yapılmalıdır etkileşim ortakları belirlemek emin olmak için. Ideal olarak, bu birini temsil &#39;switched&#39; ortam numunesi ile üç deneyler en az iki, etkileşim olarak gösteren bir proteini, yüksek bir güven etkileşimdir. <ol><li> , Excel dosyası geri dön &#39;Kombine&#39; adında yeni bir sekme oluşturmak. Etiket sütunu A &#39;Katılım&#39; ve o her gelen tüm üyelik numaraları kopyalamakBu tek bir sütuna f bireysel deneyler. </li><li> &#39;Veri&#39; sekmesini ve ardından &#39;Kaldır Çiftleri&#39; seçeneğini seçiniz. </li><li> SILAC oranları ve her deney değişkenlik oranı hem de protein adı / açıklama sütun için sütunlar oluşturur. </li><li> Açıklama sekmesinde, her bir erişim numarası açıklamasını toplamak için vlookup formülü kullanabilirsiniz. Protein açıklamasında doldurmak için sütunun aşağı formülü sürükleyin. Vlookup formülü: &quot;= DÜŞEYARA (erişim no, WheretoLook, ColumnsAccross, Yanlış)&quot;, burada:.! Erişim no X WheretoLook &#39;Deney sekmesi Adı&#39; $ 2 $ olduğu satır numarası olmak $ aX olan: $ Y $ Z nerede Y ve Z elektronik tablo başvurulan verilerin sağ alt parça vardır. ColumnsAccross katılım num karşısında sütun sayısıber A sütununda istenen değer yatıyor. Not: Katılım sayısı A sütununda olduğunu ve ilgi veri sütun E. yatıyor Örneğin, burada değeri (sütun A 1 olarak sayılır) 5 olurdu. Erişim numaraları aşama b&#39;de havuzlandı gibi, vlookup bir deneyde tüm gerekli isimlerini elde olmayacağı muhtemeldir. Bu N / A döner nerede, tüm açıklamaları edinilen kadar sırayla her deneyde açıklamasını elde etmek için formülü değiştirin. </li><li> Kombine kümesi içinde etkileşen proteinleri vurgulamak için, tek tek her bir oran sütunu seçin ve&gt; Koşullu Biçimlendirme&gt; hücreleri vurgulayın kurallar, ardından Giriş sekmesinde Daha kurallarını tıklayın. </li><li> Seç style &#39;Klasik&#39;. &#39;Hücre değeri&#39; içeren Format sadece hücreler, &#39;Büyüktür veya Eşit&#39;. Kutu, 1.96 standart sapma değeri tip ve &#39;Tamam&#39; ı tıklatın. </li><li> Her olumlu etkileşim oranı değişkenliği değerlendirin. % Değişkeni çıkarılarak varsaiability bir eşik değerin altında &#39;hit&#39; düşeceği, bu dikkatle tedavi edilmelidir. Not: Bu arada, bir proteinlerin SILAC oranını oluşturan her bir peptit için tek tek oranları ne kadar tutarlı temsil eder ve bir yüzde olarak verilir. Bu oran değişkenlik dikkate alınır ve bir protein, eşiğin üstünde bir SILAC oranı verir, bu protein, bir isabet eder. Oran değişkenlik eşiğinin altında kalan bir aralık verirse, &#39;hit&#39; bir kirletici temsil edebilir. </li><li> Sonuçlar sütunların her biri için bu işlemi tekrarlayın ve deneyler arasında karşılaştırma. Iki veya daha fazla deneylerde tespit vurgulanan proteinleri yüksek bir güven etkileşimi temsil eder. Not: Farklı deneylerde bir protein farklı bir, hatta birden fazla erişim numaraları ile tespit edilmiştir olabilir, protein üyelik numaralarını atamak için kullanılan veritabanına bağlı olarak. Bu proteinler yanlışlıkla ihmal değil emin olmak için bu kontrol etmek önemlidir. </li&gt; </ol>

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem Soc Trans. 38, 875-878 (2010).</li><li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification.">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+protein+interactions+and+complexes+by+affinity+purification+followed+by+label-based+quantitative+mass+spectrometry.">Resolving protein interactions and complexes by affinity purification followed by label-based quantitative mass spectrometry.</a> Proteomics. 12, 1623-1638 (2012).</li><li>Emmott, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+interactome+of+the+coronavirus+infectious+bronchitis+virus+nucleocapsid+protein+and+functional+implications+for+virus+biology.">The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology.</a> J Virol. 87, 9486-9500 (2013).</li><li>Li, W., Belsham, G. J., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factors+4A+(eIF4A)+and+4G+(eIF4G)+mutually+interact+in+a+1:1+ratio+in+vivo.">Eukaryotic initiation factors 4A (eIF4A) and 4G (eIF4G) mutually interact in a 1:1 ratio in vivo.</a> J Biol Chem. 276, 29111-29115 (2001).</li><li>Nielsen, P. J., Trachsel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+protein+synthesis+initiation+factor+4A+gene+family+includes+two+related+functional+genes+which+are+differentially+expressed.">The mouse protein synthesis initiation factor 4A gene family includes two related functional genes which are differentially expressed.</a> EMBO J. 7, 2097-2105 (1988).</li><li>Galicia-Vazquez, G., Cencic, R., Robert, F., Agenor, A. Q., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+response+linking+eIF4AI+activity+to+eIF4AII+transcription.">A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AII transcription.</a> RNA. 18, 1373-1384 (2012).</li><li>Zakowicz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+the+DEAD-box+RNA+helicase+eIF4AII+characterizes+its+interaction+with+transformation+suppressor+Pdcd4+and+eIF4GI.">Mutational analysis of the DEAD-box RNA helicase eIF4AII characterizes its interaction with transformation suppressor Pdcd4 and eIF4GI.</a> RNA. 11, 261-274 (2005).</li><li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+nanotrap+for+biochemical+and+functional+studies+with+fluorescent+fusion+proteins.">A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 282-289 (2008).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li><li>Dobreva, I., Fielding, A., Foster, L. J., Dedhar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+integrin-linked+kinase+interactome+using+SILAC.">Mapping the integrin-linked kinase interactome using SILAC.</a> J Proteome Res. 7, 1740-1749 (2008).</li><li>Mittler, G., Butter, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SILAC-based+DNA+protein+interaction+screen+that+identifies+candidate+binding+proteins+to+functional+DNA+elements.">A SILAC-based DNA protein interaction screen that identifies candidate binding proteins to functional DNA elements.</a> Genome research. 19, 284-293 (2009).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Boulon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+protein+frequency+library+and+its+application+in+the+reliable+identification+of+specific+protein+interaction+partners.">Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 861-879 (2010).</li><li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+dynamic+interactors+of+protein+complexes+by+quantitative+mass+spectrometry.">Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 46-57 (2008).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+COP9+signalosome+complex+using+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Characterization of the human COP9 signalosome complex using affinity purification and mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 7, 4914-4925 (2008).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada açıklanan SILAC açılan bir strateji, yeni proteini tespit etmek için bir çok hassas ve güçlü bir mekanizma: protein etkileşimleri ve bundan başka ilgi yakından ilgili örnekler arasında değişmiş bağlanma kalıplarının hızlı ve basit bir ayrım sağlar. EIF4AI ve eIF4AII proteinlerin protein etkileşimleri 6: Bu örnekte, bu teknik proteini incelemek için kullanılmıştır. Yazarın bilgisine, bu eIF4A bu iki izoformlannın hücresel interactome araştırmak için SILAC proteomiks programını istismar literatürdeki ilk çalışmadır. Yukarıda tarif edildiği gibi bir yaklaşım, GFP-tag ve anti-GFP boncuk 9, 10 ve bu nedenle modifikasyonlar etiket N-ya da yer olup olmadığını, örneğin ilgi özel bir protein için, kullanılmak üzere, bu yaklaşım sağlamak için gerekli olabilir kullanır Bir proteinin C-terminus. Mümkün olan yerlerde, western blotlar ya da işlevsel tahlilleri gerektiğiBilinen bir protein etkileşim ortağının bağlayıcı tespit etmek için gerçekleştirilebilir. Bir protein, bir GFP etiketi, diğer etiketleme veya açılan stratejileri ile füzyon tahammül gereken diğer etiketler her ikisini de kullanarak SILAC Pulldowns uygulanmıştır (FLAG 11, 12 Biotin, STREP (kendi veri, yayınlanmamış)) ya da bir proteine ​​karşı antikorlar kullanılarak, birincil ilgi konusu hedef proteinin siRNA portatif bir kontrol numunesi 13 içerir burada. Bu tür deneyler, literatürde başka yerlerde tarif edilmiştir, ama kısa olarak, basamak 1 ve adım 5,4-8 tarif edildiği gibi eşit protein girdileri ile tercih edilen bir ekspresyon / açılan sistemi için uygun şekilde modifiye adımları 2-5,3, yukarıda tanımlandığı gibi uygulanmış olur 2,4-2,5 adımları. Aşamaları miktar non-spesifik bağlanma proteinleri analiz düzeyinde çıkartılmasına olanak sağlamak üzere, düşük-protein afinite korumak için kontrol boncuk veya yüksek tuzlu yıkama ile ön-inkübasyon devre dışı bırakmak için önerilir: ilgi konusu bir protein ile bir protein etkileşimleri . Bir nukleaz may dahil veya belirli bir deney özelliklerine göre bu protokol atlanabilir. Örnek: Bu yöntemde kullanılan proteinler RNA helikazlar gibi, RNaz kokteyl RNA (adım 3.2) aracılık ettiği dolaylı etkileşimleri kaldırmak için protokol dahil edilmiştir. Bazı durumlarda bununla birlikte, nükleik asit bağımlı etkileşimlerini tespit etmek nükleazı ile ve olmadan paralel deneyler çalıştırmasını fayda var olabilir. Bu protokol dahilinde, &quot;orta&quot; ve tekrarlanan deneylerde &quot;ağır&quot; örnekleri arasında sviçleme SILAC ortam veya hücre büyümesi farklılıklardan ortaya varyasyon kontrol etmek için önerilmektedir. Bir alternatif kontrol çoğaltma deneylerinde her üç (&#39;hafif&#39;, &#39;orta&#39; ve &#39;ağır&#39;) medya sıralı anahtarlama içerir. Bu yaklaşım, potansiyel olarak daha sıkı iken, en az bir tekrarında, ilgi konusu bir protein w olarak, analiz karmaşıklığını artırmak etmezhasta &#39;hafif&#39; etiketli hücrelerinde üretilen ve bu nedenle sürekli olarak &#39;hafif&#39; örneklerinde (örneğin keratinlerden gibi çevresel kirleticiler) ve bir proteine ​​bağlı yalnızca &#39;hafif&#39; örneklerinde zenginleştirilmiş olanlar tespit proteinler ayırt etmek gerekir faiz. Nicel veri kullanımı sağlar iken bir eşik kullanımı yoluyla spesifik-olmayan-spesifik etkileşimleri ayrımcılık, kaçınılmaz olarak bazı gerçek etkileşimler atılabilir. Yukarıdaki yaklaşım protein belirlenmesi için basit ve hızlı bir yaklaşımdır: kolayca hiçbir önceki kütle spektrometresi ile deneyim, veya büyük protein analizi ile araştırmacılar tarafından teşebbüs edilebilir protein etkileşimleri: protein etkileşim veri setleri. Birçok kullanım için bu ilgi yeni proteinleri tanımlamak için fazlasıyla yeterli. Bu veri kaybını azaltmak için bu yaklaşım daha fazla başka modifikasyonlar literatürde tarif edilen ve bir PR kullanımını içerirDeneysel parametreler (hücre hattı, kordon matris, tampon koşulları kullanılarak) belirli bir kümesi için kirletici madde proteinlerinin bilinen otein frekans kütüphane 10, 14, iptal edilebilir. Bununla birlikte, özel deneysel parametrelere bağlı olarak bir boncuk proteomesini oluşturmak için kontrol deneyleri bir dizi çalıştırmak için gerekli olabilir ve bu nedenle, bu denemenin masraf ve karmaşıklığını hem de artırabilir. Bu teknikle ilgili ayrıntılı bilgiler www.peptracker.co.uk web sitesinden 14 edinilebilir. Ayrıca protokol (- MAP SILAC deney saflaştırma sonra bir karıştırıcı olarak adlandırılır) immünopresipitasyon işleminin sonunda farklı işaretlenmiş numune karıştırma içerir, yukarıda tarif unutulmamalıdır. Bu protein olarak yapılır: protein etkileşimleri, belirli bir denge 15 meydana gelir. Bu, diğer gruplar örneklerin inkübe bu protokolde tarif edilen bu MAP SILAC yaklaşımı kombine unutulmamalıdırönce aşağı çekme etkisi (Karışım sonra saflaştırma - PAM SILAC) için, farklı zaman süreleri için 15, 16 (2 saat için 20 dakika literatürde kullanılmıştır). Bir protein oranı 1:1 &#39;e doğru düşmektedir ne kadar hızlı göre, bu nitelik bağlanma afinitelerinin saptanması ve stabil veya dinamik etkileşen proteinlere 15 gibi proteinleri tanımlamak mümkündür. Özet olarak, SILAC Pulldowns fizyolojik olarak uygun bir ortamda, ilgi konusu bir protein ile etkileşen proteinlerin belirlenmesi için bir çok güçlü bir aracı temsil eder. Bu teknik, çok kolay bir şekilde ilgi duyulan herhangi bir protein uygulanmasını sağlayan, farklı saflaştırma bir dizi strateji adapte edilebilir. Sonuç miktarının büyük ölçüde gerçek etkileşim tanımlanmasını kolaylaştırır, ve spesifik olmayan bağlayıcı kaldırmak için kullanılan tampon sıkı koşullar gevşemesine izin verir ve bu nedenle düşük afiniteli etkileşimler korur. En fazla üç numune, yukarıda karşılaştırılabilir gibistrateji, bu teknik, farklı protein izoformları, mutant proteinler, ya da farmakolojik inhibitörlerinin etkisi arasında farklılıklar bağlama proteini karşılaştırma açık güçlü sahiptir. Bütün jel dilimleri yerine bu Coomassil leke bireysel gruplarından daha incelendiğinde gibi, yüksek güven de tanımlanan proteinlerin numaraları genelde standart bir GST / TAP-pulldown belirlenen daha yüksektir, ve ilgi proteinleri ortadan kaldırılır seçiminde önyargı deneyci. Teknik, bu yüzden yeni protein-etkileşimleri (maya 2-hibrid, GST / His veya TAP PULLDOWNS) tanımlanmasında kullanılan diğer yaygın olarak kullanılan teknikler ile çok olumlu karşılaştırır.

Protein işlevlerini anlamada önemli bir adım, ilgili etkileşen proteinlerin belirlenmesidir. Bu tür proteinler bilinmeyen Nereye mevcut tekniklerin bir dizi, kendi yararları ve sakıncaları ile her vardır. Bu maya iki-hibrid sistemi, yeniden birleştirici protein kullanılarak açılan deneyleri, hem de tandem afinite arıtma ya da kademe etiketleme 1, 2 içerir. Bu teknikler için daha yeni bir ek (SILAC) 3 hücre kültürü içinde amino asitlerin izotop etiketleme kullanılarak niceliksel ardından kütle spektrometrisi ile ilgili bir memeli hücre hattından ilgi konusu bir proteinin afinite saflaştırma birleşimidir. Bu, hücre lokalizasyonu ve post-translasyonel modifikasyonlar maya iki-hibridli bir yaklaşım göre avantajları fazla avantaj, hem de tedirgin değildir sahip geleneksel TAP etiketlemeyi rea olanak sağlayan bir nicel değil, nitel yaklaşım olmasıylaDily özellikle bağlanan konak faktörler, proteinler ve kirletici etkileşim spesifik olmayan ayırt. Bir örnek olarak, tipik olarak daha çok tek tek protein bantları dışında, bütün incelendiğinde daha ayrıntılı olarak, ilgi konusu proteinlerin benzer bir protein jeli üzerinde göç eden, ne de, tipik olarak boyanarak görünür olması için yeterli seviyelerde mevcut olması gerekir, yol maskelenir değildir güvenle belirlenen protein 4 artan sayıları. Bu tekniği göstermek için, yakından ilgili ökaryotik çeviri başlatma faktörü GFP füzyonlarıdır eIF4AI ve eIF4AII% 90 amino asit kimliği üzerindeki payının SILAC-immünopresipitasyon nicel Proteomikte tarafından incelenmiştir. İnsan eIF4AI ve II GFP eIF4A of N-terminaline bağlı bir füzyon proteini oluşturmak için pEGFP-C1 klonlanmıştır. Geçici transfeksiyon izotop işaretli 293T hücreleri, bu yapıları teslim etmek için kullanılmıştır kararlı hücre kuşaklarının üretilmesi için kaçınmak gerekir. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Hücreler ilk olarak ilgi konusu bir proteini kodlayan plasmid DNA transfeksiyonu ardından hücre kültürü ortamı SILAC iki hafta boyunca işaretlendi. Hücreler daha sonra, lize normalleştirilmiş protein konsantrasyonu ve lizat afinite eşit miktarlarda anti-GFP agaroz üzerinde saflaştırılmıştır. Eluatın eşit miktarları daha sonra, bir araya getirilmiş ve LC-MS/MS analizi için gönderilmiştir. Bu analizin sonuçları daha sonra yüksek bir güven proteini tespit etmek için işlenir: protein etkileşimleri için (Şekil 1). SILAC immüno doğrudan etkileşimleri hem de düşük afinite ya da protein kompleksleri 4 ile doğrudan etkileşimleri sadece tanımlanmasını sağlar. Bu sistemi kullanarak, eIF4AI ve II imüno birincil bağlanma ortağı eIF4G (izoformlar I / II ve III) 5 tekrarlanabilir ve güvenli kimlik, hem de eIF4E ile dolaylı etkileşimleri ve eIF3 kompleksinin çeşitli bileşenler izin verdi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium &#160;(DMEM)</td>
			<td style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td style="width:88px;">LM010</td>
			<td style="width:745px;">DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:271px;">Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml</td>
			<td rowspan="2" style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">DS1003</td>
			<td rowspan="2" style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Arginine (R0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">A8094</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R6) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CLM-2265</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R10) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-539</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lysine (K0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">L8662</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K4) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">DLM-2640</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K8) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-291</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml</td>
			<td style="width:87px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">15140-122</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:88px;">11668-027</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">GFP-trap Agarose (500&#956;l resin)</td>
			<td style="width:87px;">Chromotek</td>
			<td style="width:88px;">gta-20</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">5x SDS Sample loading buffer</td>
			<td style="width:87px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">PN39000</td>
			<td style="width:745px;">The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:88px;">539134</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1.7ml&#160; prelubricated tubes</td>
			<td style="width:87px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">3207</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BCA protein assay kit (1L)</td>
			<td style="width:87px;">Pierce</td>
			<td style="width:88px;">23225</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tris (Trizma)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Rnase cocktail</td>
			<td style="width:87px;">Ambion</td>
			<td>AM2286&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">NP-40 alternative</td>
			<td style="width:87px;">Millipore</td>
			<td align="right">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein interaction partners in mammalian cells using silac-immunoprecipitation quantitative proteomics

Protein etkileşimleri: İmmün afinite temizliğinin, SILAC immüno ile birleştirildi, kantitatif proteomik yeni bir proteinin keşfi için güçlü bir aracı temsil etmektedir. Kontrol ve test örnekleri hem de protein bolluk doğru nispi miktarını vererek, gerçek etkileşimleri kolayca deneysel kirletici ayırt edilebilir. Düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşulların kullanılmasıyla boyunca korunmuş ve kolaylıkla tanımlanabilir devam edilebilir. Bu protokol bir kütle spektrometresi tesisine sunulması için hazırlanmasını takiben ilgi proteini, etiketlenmiş bir yakınlık kararlı izotop etiketli amino asitler, nakil ve immunoprecipitation doku kültürü hücreleri etiketleme tartışır. Bu protokol daha sonra ilgi bir protein ile etkileşim hücresel ortakları belirlemek için kütle spektrometresi döndürülen verileri analiz etme ve yorumlama anlatılır. Bir örnek olarak, bu teknik, kimliklerini uygulanıreIF4AI ve eIF4AII: ökaryotik translasyon başlatma faktörleri için bağlama proteinleri haklı göstermeye çalışıyorlar.

Tipik SILAC açılan bir deneyde tespit proteinleri (&gt;% 90) büyük bir çoğunluğu kirleticiler gibi afinite matrisine spesifik olmayan bağlanma proteinleri temsil eder ve yıkama protokolleri sitoplazmik kirletici maddelerin büyük bir kısmını kaldırmak bile bu, Şekil 2B&#39;de gösterilmiştir Bu tür GAPDH (Şekil 2A) elde edildi. Bununla birlikte, spesifik olmayan normal bir dağılım içinde bağlayıcı proteinlerin kümelenme özel olarak bu olarak ayırt edilmesi için ilgi konusu bir proteinine bağlanan proteinler, daha yüksek bir arka plan örnek / mock oranına sahip sağlar. Kirleticiler teorik 0 günlük 2 SILAC oranı kumelendi gerekir iken, bu mutlaka böyle değildir, bu bir örnek Şekil 3&#39;te verilmiştir. Bunun olası nedenler üzerine eşitsiz hacimleri veya lizatının konsantrasyonlarını yükleme, hücrelerin kusurlu SILAC Etiketleme anti-GFP boncuklar, saflaştırılması ya da eşit olmayan boncuk karışımı sırasında kazara zararSaflaştırma prosedürü 3 sonunda numunelerin ing. Bununla birlikte, normal olarak varsayılarak verilerin dağıtılmış kirleticilerin ortalamasından bir standart sapma eşik göre incelendiğinde, verilerin merkezlenmesi ufak kaymalar sonuçların kalitesini etkilemez. İki ilişkili protein arasındaki protein etkileşimi farklarını karşılaştırırken ilgi duyulan bir protein (ya da bağlı Transfeksiyon etkinliğindeki değişim, ya da protein veya mRNA içsel bir özelliği) bir saniyeden daha hücreler içinde daha yüksek düzeylerde üretilir burada, benzer bir durum ortaya çıkabilir . Bazı ifade değişimi (örneğin, Şekil 2A) Bu iki numune için SILAC oranını analiz tarafından düzeltilebilir. Bu örnekte, bu GFP-eIF4AI ve GFP-eIF4AII örnekleri olacaktır. Bölüm 7&#39;de açıklandığı gibi 4AI/4AII SILAC oranını analiz ederek, bu kimin bağlayıcı izoformlarına arasında anlamlı farklılık proteinleri tespit etmek mümkündür. <pŞekil 4&#39;te class = &quot;jove_content&quot;&gt;, gerçekleştirilen çoğaltma deneyleri birinde tanımlanan eIF4A bağlayıcı protein bir temsilidir, bu protokol elde başlatma faktörü kompleksinin kapsama gösteren gösterilmiştir. En yüksek oranlar genellikle uzağa eIF4A-bağlanma sitesinden bir bölgede eIF4G bağlanan eIF4E, daha düşük oranlarda, eIF4A doğrudan bağlanan eIF4G ile gözlendi. Alt oranları eIF3 kompleks üyeleri için gözlendi. Ancak, bu açıkça deney tatmin edici eIF4AI ve II doğrudan ve dolaylı ortakları bağlayıcı tespit olduğunu göstermektedir. Yüksek dizi özdeşliği 6, ikinci Beklenebileceği gibi protein: protein etkileşimleri için büyük ölçüde bu deney sistemi 7, 8, iki izoform arasında muhafaza ortaya çıktı. Etkileşen proteinlerin bazı bir seçim veri formatını gösteren, Tablo 2&#39;de verilmiştir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Sütun Başlığı </td><td> Tanım </td></tr><tr><td> Katılım </td><td> Sırası için erişim numarası gösterir </td></tr><tr><td> Kapsama </td><td> Belirlenen peptidler kapsadığı protein dizisinin Oranı </td></tr><tr><td> ♯ PSM </td><td> Peptit spektral maç </td></tr><tr><td> Peptidler ♯ </td><td> Bir protein için tanımlanan benzersiz peptitlerin sayısı </td></tr><tr><td> ♯ AAs </td><td> Amino asitleri, bir proteinin uzunluğu </td></tr><tr><td> MW (Da) </td><td> Dalton bir proteinin molekül ağırlığı. Değişiklikleri içermez </td></tr><tr><td> hesaplanan. PI </td><td> Bir proteinin teorik izoelektrik noktası </td></tr><tr><td> Skor </td><td> Indiv toplamını temsil eden bir proteinin (toplam puanidual peptid puanları). Anlamlılık için gerekli tam puan deneyler arasında değişir. Bir MS tesis genellikle% 5 yanlış keşif oranı cutoff geçerli olacaktır. </td></tr><tr><td> Sekans </td><td> Proteini oluşturan amino asitlerin sekansı, </td></tr><tr><td> Oran </td><td> Ikinci bir işaretli örnek göre adlandırılmış işaretlenmiş numunede peptidlerin nispi yoğunluk, </td></tr><tr><td> Oranı Sayısı </td><td> Belirli bir protein oranını hesaplamak için kullanılan peptid oranları sayısı </td></tr><tr><td> Oranı değişkenlik (%) </td><td> Belirli bir protein oranını hesaplamak için kullanılan tek tek peptid oranlarının değişkenliğinin </td></tr><tr><td> Tanım </td><td> Proteinin adı </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Bir Proteom Discoverer rapordan Standart sütun başlıkları.Yararlı bilgiler bu sütunların her elde edilebilir iken, bu analiz için kritik olanlar kalın olarak gösterilmiştir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057"><tbody><tr><td> Katılım </td><td> Peptidler </td><td> 4AI/Mock </td><td> 4AII/Mock </td><td> Isim </td><td> SILAC analizi </td></tr><tr><td> A8K7F6 </td><td> 21 </td><td> 100 </td><td> 1 </td><td> eIF4AI </td><td rowspan="2"> &#39;Bait&#39; proteini </td></tr><tr><td> Q14240 </td><td> 22 </td><td> 0.01 </td><td> 90,855 </td><td> eIF4AII </td></tr><tr><td> G5E9S1 </td><td> 25 </td><td> 47.575 </td><td> 30.53 </td><td> eIF4GI </td><td rowspan="3"> Etkileşen proteinleri </td></tr><tr><td> Q59GJ0 </td><td> 5 </td><td> 11.778 </td><td> 10.619 </td><td> eIF4GII60; </td></tr><tr><td> P06730 </td><td> 3 </td><td> 7.22 </td><td> 7.57 </td><td> eIF4E </td></tr><tr><td> Q5T6W5 </td><td> 4 </td><td> 0.685 </td><td> 0.646 </td><td> hnRNPK </td><td rowspan="2"> Non-spesifik bağlanma kirletici </td></tr><tr><td> P62805 </td><td> 1 </td><td> 0.531 </td><td> 0,498 </td><td> Histon H4 </td></tr><tr><td> H6VRG2 </td><td> 18 </td><td> - </td><td> - </td><td> Keratin-1 </td><td rowspan="2"> Çevresel kirleticiler </td></tr><tr><td> P35527 </td><td> 11 </td><td> 0.01 </td><td> 0.01 </td><td> Keratin-1 sitoskeletal 9 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Bir SILAC immunopresipitasyon deney Tipik Veri. Faiz / yem bir protein için örnek verileri verilmesi (yüksek peptitler, yüksek oran), faiz (yüksek / düşük peptidler, yüksek oranlı) bir protein ile etkileşen proteinler, non-spesifik bağlayıcı proteinler (yüksek / düşük Pept) Bu deneyde 0.96 olarak ve çevresel kirleticiler (genellikle yüksek peptitler, eşiğin altında negatif oranı /) - ides, oran cutoff&#39;a altına düşer. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneysel Plan. İlk olarak hücreler, 2 hafta içinde arginin ve lisin yoksun ortam içinde büyütüldü ve izotop işaretli arginin ve lisin ile ikame edilir (1). (2) Hücreler 10 cm2 tabaklar içine ekildi ve geçici olarak (Örnekler) (Mock) veya GFP füzyon proteinlerinin GFP&#39;yi kodlayan plazmid ile transfekte edilir. (3) Hücreler lizlenir ve GFP ya da GFP füzyon proteinleri, hücre lisatlanndan imüno-çökeltilir. (4) Numuneler 1:1 oranında bir araya getirilmiş ve LC-MS/MS analizine tabi tutuldu. Veriler daha sonra düşük güven protein idendi kaldırmak için analiz edilirifications ve hakiki etkileşen proteinlere karşılık gelen protein zenginleştirme düzeyini seçin. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2.jpg" /> Şekil 2.. Uygun immunopresipitasyon koşulları Onaylanması. A) hücre lizatlarının Western blot analizi, hem de immünopresipitasyon gelen bağlanmamış ve bağlanmış parçacıklar ifade ve ilgilenilen protein imüno doğrulamaktadır. GAPDH karşı bir western blot, eIF4A bir bilinen etkileşim ortak ilgi konusu bir proteinin etkileşim eşleri bilinmemektedir ilgi. B&#39;nin protein) bağlanan proteinlerin başarılı imüno teyit olmayan etkileşen protein ve başka bir western blot tükenmesi teyit bir gümüş lekeli jel etkileşen proteinlerin imunopresipitasyon teyit edebilir. Bu gümüş leke<html> GFP ve GFP-eIF4AI/II için ed jel bantlar açık ve eIF4G için doğru boyutta göç bir bant sadece GFP-4AI/II-bound şeritlerde değil GFP kontrol şeritte mevcuttur. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3.jpg" /> Şekil 3,. Örnek sonuçlanır. Histogram (A) GFP-eIF4AI ya da (B) GFP-eIF4AII pulldown bir tekrar protein oranlarının dağılımını gösteriyor. 1.96 standart sapma kesim kesik bir çizgi ile işaretlenir. Normalde dağıtılmış kirletici maddelerin dışında kalan Etkileşimde bulunan proteinler, (B) &#39;de ~ 0.25 ve 1 (A) ve ~ 0.3-1.5 açıkça görülmektedir. les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4. Bir SILAC IP deneyde tek bir kopyadan eiF karmaşık üyelerinin belirlenmesi. Proteinler yeşil proteinleri etkileşimde pulldown için kullanılan faiz protein olan kırmızı SILAC IP 2 SILAC oranını oturum beyaz göre kırmızı gölgeli edilir Analizde en bol protein olan ve beyaz 1.96 SD kesme olmak. Gri gölgeli Proteinler bu analizde tespit edilmemiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics at JoVE.com

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Protein etkileşimleri: SILAC immunopresipitasyon deneyler yeni proteini keşfetmek için güçlü bir araç temsil eder. Sağlayarak kontrol ve test örnekleri, gerçek etkileşim hem de protein bolluğu doğru nispi miktar kolaylıkla deneysel kirletici ayırt edilebilir ve düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşullarında kullanımı yoluyla korunur.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

identification-protein-interaction-partners-mammalian-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

31.3K Görüntüleme.  University of Cambridge.  Protein etkileşimleri: SILAC immunopresipitasyon deneyler yeni proteini keşfetmek için güçlü bir araç temsil eder. Sağlayarak kontrol ve test örnekleri, gerçek etkileşim hem de protein bolluğu doğru nispi miktar kolaylıkla deneysel kirletici ayırt edilebilir ve düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşullarında kullanımı yoluyla korunur. 

Video: Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biyoloji

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...