Bu çalışma, Wellcome Trust, GlaxoSmithKline (GSK) ve Hücre Sinyalizasyon için İskoç Enstitüsü (MRC Protein fosforilasyonu ve Ubiquitylation birimin parçası) tarafından desteklenmiştir.

1.. Testi Geliştirme Safhası Not: önce siRNA ekran başlatılması için, bir deney geliştirme aşaması, raportör hücre hattı ile taranması için önemli parametrelerini ayarlamak için çok önemlidir. Bu ekranın gelecekteki başarısını destekleyecek olarak bu aşamada önemli çaba yatırım esastır. <ol><li> U20S-HRE raportör hücre hattının hipoksiyaya tepki karakterize etmek için,% 10 FBS ile takviye edilmiş Eagle Medium (DMEM) Dulbeccos Modified içinde% 80-90 birlikte akması için 2 x 75 cm-HRE U20S hücreleri 2 şişeler büyür. </li><li> Aspire hücre bir şişe ortam, 10 ml PBS ile iki kez yıkama ve 2 ml% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ilave edildikten ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilerek hücreleri ayırmak. 8 ml DMEM, homojen bir hücre süspansiyonu oluşturmak için yukarı ve aşağı% 10 FBS ve pipet içinde süspanse edin hücreleri. </li><li> Pipet 20 çift olarak bir hücre sayım bölmesi süspansiyonun ul, ve otomatik bir hücre kurs içine yerleştirin bölmeyiGünter. Hücre sayacı yazılımı &quot;Ekran Görüntüsü&quot; tıklayın ve hücreler odak sağlamak. &quot;Kont&quot; tıklayın ve hücre yoğunluğu not edin. Diğer nüsha için bunu tekrarlayın ve ortalama hücre yoğunluğunu hesaplamak. 60,000 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar DMEM,% 10 FBS ile hücreleri seyreltin. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, aynı üç sütun (örneğin A5-H5, H6 ve A6-A7-H7) 5 steril beyaz duvarlı 96 oyuklu deney plakaları, ve transfer etmek için seyreltilmiş hücre 100 ul (6.000 hücre) ekleyin gece boyunca,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi. Not: 0 saat, 2 saat, 6 saat, 10 saat ve 24 saat: Bu plakalar hipoksi maruziyetin bir dizi için hipoksiyaya bağımlı bir lusiferaz üretimini belirlemek için kullanılacaktır. </li><li> Ertesi gün sonunda, zaman zaman not ve% 1 oksijen hipoksi iş istasyonu seti 24 saat hipoksi plaka ekleyin. 24 saat plaka fr kaldırılması nedeniyle önce Sonraki sabah, süresi 10 saat, 6 saat ve 2 saat hesaplamakhipoksi iş istasyonu om. Bu zamanlarda, hipoksi iş istasyonu için 10 saat, 6 saat ve 2 saat tabak ekleyin. </li><li> 16 mM MgCl2;, 2 mM DTT, 2% Triton-X-100,% 30 gliserol, 1 mM ATP, 1% BSA, 0.25 mM 2x Birleştirilen lusiferaz lizis / deney tamponu içinde 30 ml (50 mM Tris pH 7.8 fosfat hazırlanması lusiferin ve 8 mcM Na 4 P 2 O 7). Not: listelenen sırada bileşenler eklemek ve BSA, en az 30 dakika luciferase ve Na 4 P 2 O 7 eklenmesinden önce çözünmesi için izin verir. </li><li> Uygun zamanda hipoksi iş istasyonundan tüm plakaları çıkarın. Tahlil plakasının uygun oyuklarına 2x lusiferaz lizis / deney tamponu içinde 100 ul ilave edin ve berrak bir film ile kapatın. İyice, hücreleri parçalamak için 500 rpm&#39;de 10 dakika boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde çalkalayın plakaları. </li><li> Otomatik bir 96 plaka Lüminometre rafa plaka yığını aktarın. &quot;Protokoller&quot; menüsü altında, &quot;abs 595&quot; seçin ve tüm wel vurgulayınls &quot;iyi seçim&quot; menüsü altında ekran plaka haritasında okunacak. Iyi o zaman her plaka ortalama okuma hesaplamak her lüminesans ölçmek için &quot;Çalıştır&quot; a tıklayın. Normoksiyada (0 saat hipoksi) kontrol plakası ortalama okuma her hipoksi plakanın ortalama bir değer bölünmesiyle raportör aktivitesinin hipoksiyaya bağımlı kat artış hesaplanır. Not: Bu tarama için uygun olacak olan, sağlam bir hipoksiyaya bağımlı bir lusiferaz yanıtı izlemek için gereklidir. Raportör aktivitesinde bir beş-on kat daha iyi olarak kabul edilir. </li><li> Dört yüksek kontrolü (HIF1A siRNA) replika (kuyu A1-D1), (FIH1 siRNA) (kuyular A12-D12) çoğaltır, dört düşük kontrol içeren bir ana kontrol levhası oluşturmak, dört tampon sadece çoğaltır (kuyu E1-H1) kontrol ve dört Tüm siRNA havuzlar 200 nM &#39;lik bir konsantrasyonda olduğu hedef dışı kontrol siRNA replika (E12-H12). Not: Yüksek ve düşük denetimleri artırmak ve decr bilinen yolu düzenleyiciler göre belirlenmiştirsırasıyla hipoksi tepkisini hafifletmek. Seçenek olarak ise, bir alt kütüphane kullanılarak tahlil geliştirme uygun kontroller belirlemek için kullanılabilir. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, steril beyaz duvarlı bir deney plakası için her kontrol siRNA 10 ul transfer. 10 ul 0.1 ul transfeksiyon reaktifi transfeksiyon karışımı hazırlayın düşük serum ortamında (1:100) her kontrol için iyi ve transfer transfeksiyon karışımı 10 ul başına. Pipet ve aşağı yukarı karıştırmak için kısaca, ve transfeksiyon kompleksi oluşumunu sağlamak için 20-60 dakika dinlenmeye bırakın plaka. </li><li> U20S-HRE hücrelerin ikinci bir şişe ile 75,000 hücre / ml &#39;lik bir hücre süspansiyonu hazırlanır. Bir çok kanallı pipet kullanarak, her bir transfeksiyon karışımı hücre süspansiyonu, 80 ul (6.000 hücre) ekleyin. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatöre plaka aktarın, sonra ilave bir 24 saat için hipoksi bir iş istasyonuna aktarmak ve adımlarda açıklandığı gibi lusiferaz tahlilleri yerine 1,6-1.8. </li><li> [3 x (yüksekten kontrol + düşük kontrolünün standart sapma standart sapma) / (yüksek kontrol demek - - düşük kontrol ortalamasını)] = 1 formülü Z kullanarak, yüksek ve düşük kontrolleri için Z-faktör hesaplayın. Not: 0,5-1 arası bir değer mükemmel bir deneyi gösterir ve için gayret edilmelidir. </li></ol> 2.. Birincil Ekran Not: deney gelişme aşamasından, bu temel koşulların yerine bir kez, birincil ekranı, aşağıdaki protokol kullanılarak 96 kuyulu bir levha formatında üç kopya halinde gerçekleştirilebilir. <ol><li> DMEM içinde% 80-90 birlikte akması için 7 x 75 cm-HRE U20S hücreleri 2 şişeler büyümek,% 10 v ile takviye / h cenin sığır serumu (FCS). Not: Aşağıdaki 2,2-2,13 Gün 1 yapılmalıdır adımları. </li><li> Adım 1.9 ve çözülmeye dışarı SiRNA ubiquitome l bir seyreltme dizi açıklandığı gibi her denetimin 200 ul içeren bir ana kontrol levhası hazırlayarak çoğaltmak 1 başlatın30 dakika içinde en az ibrary. Not: her bir kontrol için, boş kalan sütun 1 ve 12 ile 17 x 96 oyuklu plakalar içinde monte 4 siRNA&#39;lar havuzu içerir. </li><li> Bir laminar akış başlığı içinde, etiket (ya da bar-kod) sayı 1-17 ikinci kapak 17 steril beyaz duvarlı deney plakaları, siRNA kütüphane serinin her bir plakaya tekabül etmektedir. </li><li> Ana kontrol plaka Santrifüj ve siRNA tüm siRNAs kuyunun dibinde birikir sağlamak için kütüphane kısaca (2,000 x g&#39;de 1 dk) ubiquitome. </li><li> Her plaka için aynı 96-iyi ucu yığınını kullanarak, 17 tahlil plakaları üzerine bir otomatik sıvı dağıtıcı robot gibi &quot;pul&quot; ana kontrol plakadan her denetimin 10 ul kullanın. </li><li> Kütüphane 17 plakalarının her biri için yeni bir 96 oyuklu ucu yığını, transfer her biri 10 ul kullanılarak otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanılarak, karşılık gelen deney plakasına siRNA ubiquitome. </li><li> Bu oran es kullanarak 17 deney plakası için 40 ml transfeksiyon reaktifi hazırlayın1.10 olarak kurulmuş. Not: Bu hücre dağıtıcı içinde &quot;ölü hacim&quot; hesaba katmak için, ilave bir 20 ml içerir. &quot;Ölü hacim&quot; hücre dağıtıcı içinde boru ağı içinde sürekli olarak mevcut sıvı hacmine ifade eder. </li><li> 17 deney plakalarının her oyuğa transfeksiyon tepkin maddesi 10 ul transfer etmek için bir otomatik hücre dağıtıcı kullanın. Transfeksiyon reaktifi kompleks oluşumu: kısa bir süre sonra siRNA izin vermek için 20-60 dakika için oda sıcaklığında bırakın yine, siRNA ve transfeksiyon reaktifi tamamen karışmasını sağlamak için, bir çalkalayıcı (500 rpm&#39;de 1 dakika) üzerinde deney plakaları sallayın. </li><li> 10 ml PBS ile iki kez, iki 75 cm U20S hücreleri HRE-2 şişeler yıkanır ve 5 dakika boyunca 37 ° C &#39;de 2 ml tripsin-EDTA ile ayırmak. Bir homojen hücre süspansiyonu oluşturmak için yukarı ve aşağı her balona ve pipet 8 ml DMEM&#39;de birkaç kez% 10 FBS ekleyin. Her iki şişelerinden hücreler birleştirilir ve steril bir 50 ml plastik tüpe aktarın. </li><li> Pipetleme hücre konsantrasyonunu hesaplayın20 ul hücre sayım bölmesi için iki kez hücre ve aşama 1.3 &#39;de tarif edildiği gibi otomatik bir hücre sayacı iki okumalardan ortalama hücre konsantrasyonunu hesaplamak. </li><li> Steril plastik bir kap içinde, ml başına 75.000 hücre konsantrasyonuna DMEM,% 10 FBS ile inceltilir hücre süspansiyonunun 155 ml hazırlayın. Not: Bu birim 17 tabak için yeterlidir ve hücre dağıtıcı içinde ölü hacim için ilave bir 25 ml içerir. </li><li> Hücre topaklanma sınırlamak için laminar akış başlığı içinde kurulmuş bir karıştırıcı üzerinde hücre süspansiyonu ve yere bir steril manyetik karıştırıcı ekleyin. Hücre süspansiyonu ile otomatik hücre dağıtıcı dengeye ve oyuk başına hücre 80 ul (6.000 hücre) dağıtmak için ayarlayın. </li><li> Otomatik hücre dağıtıcı üzerine, sırayla, 17 plakalarının her biri koyun ve hücreleri dağıtmak. 5 grupları olarak zaman ve yığın kaydedin plakaları daha sonra 24 saat boyunca% 5 CO2 ile nemli bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde yığınları yerleştirin. Not: nihai konsantrasyon bölgesininSiRNA havuzu 100 ul toplam hacmi 20 nM olacak. Not: Aşağıdaki 2,14-2,15 2. Gün yapılmalıdır adımları. </li><li> Tekrarında 1 (2,2-2,13) ​​için Gün 1 &#39;de tarif edilen prosedür takip edilerek 2 gün ikinci deney başlatın. </li><li> Transfeksiyondan 24 saat sonra, hipoksi iş istasyonu için, steril bir ortamda suret 1 ila transfer plakaları% 1 oksijen ayarlanır ve HRE raportör uyarılması için 24 saat boyunca bekletin. Not: Aşağıdaki 2,16-2,20 Gün 3 yapılmalıdır adımları. </li><li> Tekrarında 1 (2,2-2,13) ​​için Gün 1 &#39;de belirtilen prosedür takip edilerek, üçüncü, kopya başlatın. </li><li> Transfeksiyondan 24 saat sonra, hipoksi iş istasyonu için, steril bir ortamda suret 2 transfer plakalar% 1 oksijen ayarlanır ve HRE raportör uyarılması için 24 saat boyunca bekletin. </li><li> Iki saat önce, 1 plakalar hipoksi iş istasyonundan kaldırılacak çoğaltmak 1.6 de tarif edildiği gibi 2x lusiferaz lizis / deney tamponu içinde 200 ml hazırlar. Not: Bu hacim içindetampon haznesi kapalı kalmasını sağlamak için, ilave bir 20 ml cludes. </li><li> , 24 saat hipoksi pozlama ve otomatik sıvı dağıtıcı kullandıktan sonra hipoksi iş istasyonundan 1 tahlil plakaları çoğaltmak her tahlil plakasına 2x lusiferaz lizis / deney tamponu 100 ul ekleyin ve net film ile kaplayın çıkarın. </li><li> İyice, hücreleri parçalamak için 500 rpm&#39;de 10 dakika için bir hücre çalkalayıcıda plakaları çalkalayın. Adım 1.8 &#39;de tarif edildiği gibi bir luminometre plaka okuyucu ve kayıt lüminesans sırayla her bir plak aktarın. Not: Aşağıdaki 2.21-2.22 4. gün yapılmalıdır adımları. </li><li> Transfeksiyondan 24 saat sonra, hipoksi iş istasyonu için, steril bir ortamda 3 suret transfer plakalar% 1 oksijen ayarlanır ve HRE raportör uyarılması için 24 saat boyunca bekletin. </li><li> Replika 1 için kullanılan aşağıdaki adımları 2,18-2,20 tarafından Replicate 2 tabak okuyun. Not: Aşağıdaki adım 2.23 5. günde yapılmalıdır. </li><li> Takip ederek suret 3 tabak Okureplika 1 için kullanılan 2,18-2,20 adım. </li><li> Birincil ekranın 3 suret derlemek ve 1.12 &#39;de verilen formül kullanılarak her plaka için Z faktörünün hesaplanması. Not: Herhangi bir tabak az 0.5 Z faktörü varsa, veri kalitesini artırmak için bu plakayı tekrar düşünün. </li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak, yüksek ve alçak kontroller için varyans (CV) katsayısını hesaplayın: kontrolü kontrol / ortalamasının 100 x standart sapma. Not: CV mümkün olduğunca düşük olmalı,% 10-15 varyasyon beklemek mantıklıdır. Değişim önemli ölçüde daha yüksek olması durumunda, plaka tekrar göz önünde bulundurun. </li><li> . X 100 Buna ek olarak, hedef olmayan hesaplamak (NT [- / - (yüksek denetim ortalama düşük kontrolü ortalama) (siRNA puanı yüksek kontrolü ortalama)]: Aşağıdaki formül kullanılarak plaka başına her siRNA&#39;nın yüzde aktivasyonunu hesaplayın formülü [NT Örnek veri / ortalama] kullanarak her siRNA&#39;nın) kat. Yüzde aktivasyonu ve NT-kat ikisi için, üç Replic ortalamasını hesaplamakates ve değerlerini derlemek. </li><li> Ham verileri kullanılarak, üç suret tabak formülü kullanarak ilişkilendirmek ne kadar yakından belirlemek için Spearman Sıra Korelasyon Katsayısı (SRCC) hesaplamak: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51572/51572eq1.jpg" width="120" /> burada r = SRCC; d = Her rütbeleri çifti ve veri çiftleri n = sayısında iki sayı arasındaki fark. Not:. Bir suret, diğer 2 tabak karşı düşük SRCC gösteriyorsa plakası suretin arasında iyi bir korelasyon 1 yakın değerler verecektir, daha fazla araştırmak ve bu plaka tekrar düşünün. </li><li> (80 kadar) ikincil taraması için yeterli ilgi hangi siRNAs karar verin. (Örn. az 5 veya% 95 üzerinde% yüzde aktivasyonunu ya da az 0,5 NT-kat veya 1.5 üzerinden NT-kat gösteren tüm siRNA&#39;lara seçerek) kullanıcı-tanımlı kesme off istihdam veya kümeleri aramak için biyoinformatik veya bilgiye dayalı muhakeme Aynı UBL yol içinde düşen vurur. Not:normal olarak, bu yaklaşımların bir kombinasyonu siRNA ikinci tarama alınır belirler. </li></ol> 3.. İkincil Ekran Not: doğrulayıcı ikinci ekran birincil ekranından ilgi 80 siRNA&#39;lar maksimum göre gerçekleştirilir. Bu numara, uygun birincil ekran başına tam olarak kontrol ile tek bir 96 yuvalı plaka üzerine kaplama her tekrarında (2.2) ile gerçekleştirilebilir. Bu primer elemede tanımlanan düzenleyiciler yeniden üretilebilir aynı fenotip ortaya çıkarmak, ve bu da son üçüncül / ters evrişim ekrana ile yapılmalıdır edecek üzerinde triyaj kararları rafine yardımcı onaylamak için çok yararlıdır. <ol><li> ,% 10 FBS&#39;li DMEM içinde% 80-90 birlikte akması için 1 x 75 cm U20S hücreleri HRE-2 balon büyütün. </li><li> Plaka numarası ve birincil ekran hitlerinden konumunu not alın ve bir kolonlara 1 bırakarak, ikincil ekran kiraz ana plakayı aldım üzerinde yeni bir konum planıd kontrolleri için ücretsiz 12. 1.9 de olduğu gibi, ancak 50 | il her bir kontrol toplam hacmi ile kontrol ana plaka hazırlayın. </li><li> 30 dakika içinde en az ubiquitome kitaplığının ikinci seyreltme serisini (kiraz toplama tek siRNA havuzları için bir kenara) çözülme. Plakalar kısaca (2,000 xg 1 dakika) santrifüj sonra kiraz yeni plaka yerlere ikincil ekran siRNA&#39;ların 50 ul ekleyin usta plakasını aldı. </li><li> Şu değişiklikler ile birinci ekran için belirtilen aynı temel protokolü kullanılarak ikinci ekran yapınız: (a) her tekrar için bir deney plakası aynı günde üç kez tekrarlanmalıdır ve (b) uygun şekilde reaktiflerin hacimleri ayarlayın. </li></ol> 4. Tersiyer / Dekonvolüsyon Ekran Not: üçüncül veya Dekonvolüsyonun tarama ikincil ekranından 20 siRNA&#39;ların maksimum gerçekleştirilir. Bu adım, orijinal poo her birey siRNA&#39;yı kullanarak Nakavt etkisini incelemek içindört l. Normal olarak, her bir havuz en az iki ayrı siRNA dubleks gözlenen fenotipin siRNA hedef dışı etkiler nedeniyle değil güven makul bir derecesine sahip olması ile aynı fenotip kural dışı gerekir. Bundan başka, bu aşamada güven artırmak için, söz konusu hedef gen, ek tek siRNA dubleks tasarlanmış ve verilen fenotip ortaya etme kabiliyetleri açısından test edilebilir. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar daha sonra, H = 0.6, ya da üzerinde (yani, 5 ayrı siRNA&#39;lar üzerinden en az 3 fenotip temin eder) 6 olarak kabul edilebilir olarak kabul edilir, H skoru hesaplamak için kullanılabilir. <ol><li> ,% 10 FBS&#39;li DMEM içinde% 80-90 birlikte akması için bir 75 cm&#39;lik U20S hücreleri HRE-2 balon büyütün. </li><li> Denetimler için ücretsiz sütunları 1 ve 12 bırakarak, üçüncül ekran ana plaka üzerindeki her hit dört ayrı SiRNA dubleksler yerini planlama tarafından üçüncül ekran için bir tabak haritası oluşturun. 1.9 gibi ama toplamda kontrol ana tabak hazırlayın50 ul her bir kontrol hacmi. </li><li> Ters evrişim / birey siRNA plakaları çözülme ve üç x 10 ul tekrarlanmış ve rahat bir 20 ul fazla olanak sağlamak için plaka haritada (4,2) &#39;e göre üçüncü ekran ana plakanın her oyuğuna ayrı ayrı siRNA&#39;lar (200 nM) 50 ul ekle . </li><li> (A) her tekrar için bir deney plakası aynı günde üç kez tekrarlanmalıdır ve (b) uygun şekilde reaktiflerin seviyesini ayarlamak: şu değişiklikler ile birincil ekran için belirtilen aynı temel protokol kullanılarak tersiyer ekran yürütmek </li></ol> Not: İdeal bireysel SiRNA dublekslerden için eşik aynı stringensi&#39;de ayarlanmış olmalıdır kesme havuz gibi. Ancak, en az bir diğer dubleks belirlenen eşiğin içinde kalan, özellikle burada, bireysel SiRNA&#39;lar için% 10-20 barajını dinlenmek için kabul edilebilir. Bu siRNA&#39;ların bireysel etkisi daha az olabilir akılda değerli yataktıraksine havuz ve bazı durumlarda bireysel siRNAs o (konsantrasyon sorumluydu bile) havuzda var olduğunda daha izolasyon hücresel fenotipi üzerinde güçlü bir etki gösterebilir.

<ol>
	<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458, 422-429 (2009).</li><li>Schulman, B. A., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+activation+by+E1+enzymes:+the+apex+for+downstream+signalling+pathways.">Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).</li><li>Siomi, H., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+road+to+reading+the+RNA-interference+code.">On the road to reading the RNA-interference code.</a> Nature. 457, 396-404 (2009).</li><li>Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing+by+metazoans:+the+central+role+of+the+HIF+hydroxylase+pathway.">Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway.</a> Mol Cell. 30, 393-402 (2008).</li><li>Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+remodeler+ISWI+regulates+the+cellular+response+to+hypoxia:+role+of+FIH.">The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH.</a> Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).</li><li>Bhinder, B., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+analyzing+actives+in+random+RNAi+screens:+introducing+the+&amp;#34;H+Score&amp;#34;+for+hit+nomination+&amp;+gene+prioritization.">A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the &amp;#34;H Score&amp;#34; for hit nomination &amp; gene prioritization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).</li><li>Bett, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-body+component+USP52/PAN2+is+a+novel+regulator+of+HIF1A+mRNA+stability.">The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability.</a> Biochem J. 451, 185-194 (2013).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens.">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat Methods. 6, 569-575 (2009).</li><li>Stagg, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRC8+E3+ligase+ubiquitinates+MHC+class+I+molecules+before+dislocation+from+the+ER.">The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER.</a> J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF146+is+a+poly(ADP-ribose)-directed+E3+ligase+that+regulates+axin+degradation+and+Wnt+signalling.">RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling.</a> Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).</li><li>Jackson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+UTR+seed+matches,+but+not+overall+identity,+are+associated+with+RNAi+off-targets.">3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets.</a> Nat Methods. 3, 199-204 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whither+RNAi.">Whither RNAi.</a> Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Memeli hücrelerinde genom siRNA ekranların kullanılması ayrı biyolojik yollar ait yeni regülatörleri belirlenmesinde çok değerli olduğu kanıtlanmıştır. Burada, hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin regülatörleri belirlemek için bir hedef ubiquitome siRNA ekranın kullanımını tarif etmişlerdir. Genellikle, daha ucuz, daha hızlı, daha kolay yönetmek için ve sadece araştırmacılar 7, 10, 11 ilgilendikleri yolu bileşenleri raporu olarak hedeflenen ekranlar giderek daha çekici h...

Ubikuitin ve ubikuitin benzeri moleküller (ubl&#39;ler) ile proteinlerin modifikasyonu çeşitli biyolojik yollar ve stres yanıtlarını düzenleyen geniş bir biyokimyasal sistemini temsil eder. Hedef proteinlerine ubl&#39;ler arasında kovalent bağlanması kararlılık, lokalizasyon, fonksiyon ya da alt tabaka 1 arasında interactome düzenleyen çeşitli çıktılarına sahip olabilir. UBL değişiklik yatan enzimatik adımlar İlk Ubiquitinle için kurulan ve şimdi SUMO, NEDD8, ISG15 ve FAT10 dahil olmak üzere çoğu ubl&#39;ler ile değişiklik için bir paradigma olarak hizmet edilmiştir. Modifikasyonu oluştuğu için, UBL diglisin motifinin karboksilat grubu, ilk olarak bir E2 konjuge enzimin aktif yer sistein aktarılır yüksek enerjili bir tiol oluşturulması için bir E1 aktifleştirici enzim tarafından aktive edilir. E2 sonra (genellikle) bir dallı zincir (isopeptide) oluşturarak, bir hedef lizin tortusu bağlantı 2 üzerine ubl transferine vasıta olan bir alt-tabaka bağlı E3 ligaz ile etkileşime. Modifikasyon ardışık mermi doğrusal ubiquitin zincirleri oluşturmak için ubikuitin için yedi lisin herhangi biri aracılığıyla oluşabilir alt-tabaka, üstüne ya da N-terminal metionin ile isopeptide zincirleri oluşturmak için oluşabilir. Bu değişiklikler, önceden uzman proteazlar tarafından UBL kaldırılması için yeni etkileşim motifleri oluşturmak ve bozulması için proteinleri hedefleme gibi çeşitli amaçlar ile ayrık topolojilerini oluştururlar. Ubikitin durumunda iki E1 enzim, 30-40 E2 konjuge enzimler, en azından 600 E3 ligaz ve yaklaşık 100 deubiquitylating enzimler (seslendirmeler) vardır. Diğer yollar 10 kadar ubl&#39;ler daha az geniş olsa da, genel olarak, belirli bir ubiquitome karmaşıklığı UBL modifikasyonu biyolojik sonucu olarak çok büyük bir çeşitlilik elde edilir. UBL biyoloji büyük ilerlemeler yapılmış iken Ancak, bu ubiquitome bileşenlerin çoğunluğunun hassas hücresel rolleri bilinmemektedir. Kısa int kullanımıerfering ribonükleik asit (siRNA&#39;lar), ayrı ayrı genlerin biyolojik rolü farklı bağlamlarda 3 incelenecek sağlayan nedeniyle özel olarak yok edilmesi için hücresel mRNA hedef siRNA&#39;lar yeteneği ters genetik olarak güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Tüm genom ekranlar birçok hücresel süreçlerin yeni regülatörleri belirlemek ve doğrulamak için kullanılan olmuştur ve daha geniş bilimsel topluluk için erişilebilir kullanışlı bir veri zenginlik yaratmıştır. Tüm genom ekranlar son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır iken Ancak, hedeflenen ekranlar onlar daha ucuz olarak giderek daha popüler hale geliyor, daha hızlı, sadece araştırmacı en ilgi olduğu genomunun üyeleri üzerinde daha az veri yönetimi ve rapor içerir. Bu nedenle, daha iyi hücresel süreçleri UBL aile bileşenleri dahil hangi anlamak için, biz tüm bilinen ve ubiquitome bileşenleri tahmin hedefleyen bir insan siRNA kütüphane derledik. Bu ubl&#39;ler, E1 aktifleştirici enzimler, E2 içeren konjugeenzimler, E3 ligaz, ubikuitin-bağlama alanı (UBD) ihtiva eden proteinler ve takar. Bu kütüphane, böylece bu yollar düzenleyen yeni UBL bileşenlerin ilgili teşhisine izin veren, farklı biyolojik sorunların raportör hücre hatlarının geniş bir karşı ekran kullanılabilir. Aşağıdaki protokol titiz bir hedef siRNA hipoksi HIF1A bağımlı yanıtı yeni regülatörleri belirlemek için ubiquitome ekranını nasıl gerçekleştirileceği açıklanır. Normal oksijen basıncı altında, HIF1A bu Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligaz 4 tarafından tanınan karmaşık ve bozulma için hedef yol açar prolil hidroksilasyon tabidir. Hipoksi HIF1A stabilizasyonuna neden prolil hidroksilasyon inhibe eder ve bunun daha sonraki hipoksi karşılık elemanları (HRE&#39;ler) bağlanma gen ekspresyonunu tahrik etmek için. Burada, stabil bir şekilde Hy üç tandem kopya kontrolü altında ateş böceği lusiferazı ifade eden U20S osteosarkoma hücreleri kullanılarak bir ekran tanımlamakpoxia yanıt elementi (HRE-U20S hücreleri) 5. Raportör etkinliğinin güçlü bir-okuma elde edilebilir ve uygun bir pozitif ve negatif kontroller ile birlikte alınabilir, bu protokol, herhangi bir biyolojik bir yol için adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:288px;">Automated Liquid Dispenser</td>
			<td style="width:147px;">Fluid-X</td>
			<td style="width:200px;">XPP-721</td>
			<td style="width:156px;">http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td>http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hypoxia Workstation</td>
			<td>Ruskin</td>
			<td>In vivo2 300</td>
			<td>http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated Cell Dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Matrix Wellmate</td>
			<td>http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Plate Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Titramax 1000</td>
			<td>http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Envision 2104 Multilabel Reader</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">White Walled Assay Plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655083</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Clear Plate Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-461</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name of the Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">siRNA library</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>On-Target Plus</td>
			<td>http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Lipofectamine RNAimax</td>
			<td>http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reduced Serum Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Optimem</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tryspin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sirna screening to identify ubiquitin and ubiquitin-like system regulators of biological pathways in cultured mammalian cells

Ubikitin ve ubikitin benzeri moleküller (ubl&#39;ler) proteinlerin post-translasyonel modifikasyon hipoksi yanıt proteostasis, DNA hasarı tepkisi ve transkripsiyon da dahil olmak üzere çeşitli biyolojik yollar regüle eden bir dinamik bir hücresel sinyal ağı olarak ortaya çıkmaktadır. Daha iyi ubl&#39;ler insan hastalığı ile ilgili yolları düzenleyen nasıl anlamak için, bir insan siRNA&#39;yı derledik &quot;ubiquitome&quot; tüm bilinen ve UBL sistem yolların bileşenlerini tahmin hedefleme 1186 siRNA&#39;nın dubleks havuzlarından oluşan kütüphanesi. Bu kütüphane UBL bileşenler, söz konusu yolun pozitif veya negatif düzenleyici olarak hareket belirlemek için çeşitli biyolojik yolların muhabir ifade eden hücre hatları, bir dizi karşı taranabilir. Burada, bir transkripsiyon tabanlı bir lusiferaz raportör kullanılarak hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin ubiquitome-regülatörleri tanımlamak için bu kütüphane kullanan bir protokol açıklar. Bir ilk tahlil geliştirme aşamasıbirincil, ikincil ve üçüncül / ters evrişim tarama: üç aşamada ekranı gerçekleştirmeden önce hücre çizgisinin, uygun tarama parametrelerini elde etmek için gerçekleştirilir. Sadece araştırmacılar en çok ilgilenen hangi ile yolun üyelerinin raporlama avantajı sunuyor tüm genom SiRNA kütüphaneler üzerine hedeflenmiş kullanımının giderek daha popüler hale gelmektedir. SiRNA tarama doğal kısıtlamalara rağmen, özellikle yanlış pozitif siRNA hedef dışı etkilerinin neden olduğu, söz konusu yollarının gerçek yeni düzenleyici kimlik dikkatli bir şekilde yapılan kontrol deneyleri bir dizi performans ile aşılabilir bu eksiklikleri, ağır basmaktadır.

Önceki tarama, U20S-HRE hücrelerin hipoksiyaya tepki kurulur. U20S hücreleri, alt-HRE hipoksiye maruz kalma (Şekil 1A) üzerine HIF1A/HIF1B heterodimer ile bağlı olduğu hipoksi karşılık elemanı, üç tandem kopya, bir kaynaşık ateşböceği lusiferaz oluşan bir raportör yapıyı ifade eder. Hücreler, hipoksi maruz tarama için en etkili tepki üreten kurmak için birkaç kez bir dizi için bir iş istasyonu hipoksi yerleştirilir. U20S hücreleri bu nedenle lusiferaz okumalar hipoksi-ara...

Watch this Scientific Journal Video about siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells at JoVE.com

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Burada, hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin yeni ubikitin ve ubikitin benzeri regülatörleri belirlemek için bir hedef siRNA &quot;ubiquitome&quot; ekranı gerçekleştirmek için bir yöntem tarif eder. Bu raportör etkinliğinin üzerinden sağlam bir okuma kullanılabilir herhangi bir biyolojik yoluna uyarlanabilir.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

sirna-screening-to-identify-ubiquitin-ubiquitin-like-system

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Görüntüleme.  University of Dundee.  Burada, hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin yeni ubikitin ve ubikitin benzeri regülatörleri belirlemek için bir hedef siRNA "ubiquitome" ekranı gerçekleştirmek için bir yöntem tarif eder. Bu raportör etkinliğinin üzerinden sağlam bir okuma kullanılabilir herhangi bir biyolojik yoluna uyarlanabilir. 

Video: siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Biyoloji

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

Gen İfadesi DNA etkileşimleri, Discover Transkripsiyonlu Regülatörleri ve Roman Anti-tümör Ajanlar tanımlayın: Protein Eğitim için Kantitatif Testi

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the large size of the human BRCA2 protein (approximately 390 kDa). We report modifications of standard siRNA transfection and immunoblotting protocols to silence human BRCA2 and detect endogenous BRCA2 protein, respectively, in human epithelial cell lines. Key steps include a high siRNA to transfection reagent ratio and two subsequent rounds of siRNA transfection within the same experiment. Using these and other modifications to the standard protocol we consistently achieve more than 70% silencing of the human BRCA2 gene as judged by immunoblotting analysis with anti-BRCA2 antibodies. In addition, denaturation of the cell lysates at 55 &#176;C instead of the conventional 70-100 &#176;C and other technical optimizations of the immunoblotting procedure allow detection of intact BRCA2 protein even when very low amounts of starting material are available or when BRCA2 protein expression levels are very low. Efficient silencing of BRCA2 in human cells offers a valuable strategy to disrupt BRCA2 function in cells with intact BRCA2, including tumor cells, to examine new molecular pathways and cellular functions that may be affected by pathogenic BRCA2 mutations in tumors. Adaptation of this protocol for efficient silencing and analysis of other &#39;large&#39; proteins like BRCA2 should be readily achievable.

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Susturulması<em&gt; BRCA2</em&gt; Kültür İnsan hücrelerinde Roman BRCA2 düzenlenmiş Biyolojik Fonksiyonları Belirlemek İçin

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu

Gen İfadesi DNA etkileşimleri, Discover Transkripsiyonlu Regülatörleri ve Roman Anti-tümör Ajanlar tanımlayın: Protein Eğitim için Kantitatif Testi

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

Görüntüleme Yerel Ca

Susturulması