Sunulan öğretici Ulusal Yahudi Sağlık de Kütle Spektrometre Çekirdek Tesis içinde gerçekleştirilen ve geliştirilmiştir. NJH MS tesis CCSTI UL1 TR000154 tarafından kısmen desteklenmektedir. NIH hibe fon P20 HL-113445 ve R01 HL-095432 de bu çalışmaları destekledi.

1.. İlk Düşünceler, Cihazları ve Standartların Hazırlanması <ol><li> Her zaman (cam kültür tüpleri, cam şişeleri autosampler) depolanması veya (cam pipetler) lipit ve organik çözücüler aktarmak için camını kullanın. </li><li> Havaya tüm lipit örnekleri ve standartları maruziyeti en aza indirmek. Seal politetralforoetilen (PFTE) hava pozlama ve buharlaşmayı önlemek için sıkıca kapakları. Hemen sonraki bir çözücü içinde tekrar süspansiyon ya da kuru lipidler, sabit bir nitrojen akımı içinde tutmak. </li><li> Örnek 100 ul kullanın. Daha fazla (veya daha az) bir numunesi, mevcut durumda, uygun olarak miktarlar ayarlayın. Ancak NH2 SPE kolonu üzerinde lipid parçalanması sırasında gösterildiği gibi, birimler kalmalıdır belirtti. </li><li> Santrifüjde açın ve numune hazırlama başlatmak için önceden 0 ° C&#39;ye ayarlayın. </li><li> Bu teknik pek çok uçucu çözücüler için örnek hazırlama sırasında kapatılmış tüm çözücüleri tutmak kullanır. </li><li> Önerisi başına standartlarının iki tür hazırlayın. </li><li> Sabit bir konsantrasyonda kirpi-standartların her oluşan bir negatif kontrol hazırlayın. Bu, tüm örneklerinde hem de toplu QC (ayrı günlerde örnek hazırlama tekrarlanabilirliği izlenmesi için kullanılan tırnaklı havuzlu numune) ve aracı olarak kullanılan bir araya getirilmiş numune içine çivili QC (havuzlanmış numuneleri daha önce hazırlanmış alt parçalara ayrılmış ve kullanılan çivili ) analizi sırasında ve ayrı günlerde enstrüman koşullar / dalgalanmaları izlemek. <ol><li> 1x, 2x, 4x ve standart sivri pozitif kontrolleri hazırlayın. Pozitif kontroller, tüm örnekler yanı sıra plazma toplanmış numuneye eklenir ve numune hazırlama adımları ve sağlamak için veri analizi sırasında kat değişiklik farkları analiz etmek ve tespit etmek Enstrümantal analiz adımları hem de kalite kontrol bileşikleri olarak kullanılan bu tüm yönleriyle hazırlama ve enstrümantal analiz doğru şekilde yapılmıştır. </li></ol></li><li> -80 ° C&#39;de -20 ° C ve mağaza örneklerinde mağaza standartları Bazı dahili standıUzun süreli depolama aşağıdaki bozunmaya eğilimli ARDS -80 ° C&#39;de saklanmalıdır </li><li> Bu prosedür, örneğin MTBE gibi, tehlikeli yanıcı veya uçucu çözücülerin kullanımını gerektirir. Davlumbaz tüm adımları gerçekleştirin. </li></ol> 2.. İç Standartlar <ol><li> Bireysel projeleri ve kendi özel deneysel tasarıma dayalı iç standartlarını (ISTD) seçin. Bu tür plazma, BAL sıvısında veya idrar, bu örneklerde biyolojik bulunanlara doğada benzer olan izotopik olarak etiketlenmiş bir istDS olarak Biofluids için ideal olacaktır. Bunlar ama amino asitler, hormonlar ya da lipidler sınırlı değildir. Bitki metabolomic örnekleri için, örneğin flavonoidler veya karotenoidler olarak etiketlenmiş standartları kullanılabilir. Aynı araştırmacı örnek tipi analiz edilen temsili bir iç standart seçmelisiniz sayede diğer metabolomic çalışmalar için de geçerlidir. </li><li> Seçilen ISTD kromatogramın geniş bir aralığı kapsar emin olun; Örneğin eğer tO toplama süresi her 5 dk akıtmak standartları kullanılır olabilir, 20 dk. </li><li> Ml numune analiz edilen eksojen olan izotopik olarak etiketlenmiş bir standartlar ve / veya diğer polar çeşitli bileşikler kullanılarak, 2 mg / de hidrofilik stok çözelti oluşturur. 25 ug / ml kreatinin-D 3&#39;ün nihai konsantrasyon, 100 ug / ml lizin-d 4 ve / ml valin-D 8 200 ug tüm standartlara su: her bir stok çözeltisinden, 01:01 metanol içinde bir çözelti oluşturmak . </li><li> Numune analiz edilen eksojen olan izotopik olarak etiketlenmiş standartlara ve / veya diğer non-polar bileşiklerin çeşitli kullanarak hidrofobik stok çözümleri oluşturmak; 17:00 yağlı asit (4 mg / ml) içinde stok konsantrasyonları, 19:01 yağlı asit (4 mg / ml), 17:00 seramid (2 mg / ml), 17:00 PE (1.75 mg / ml), 15 : 0 PC (2 mg / ml), ve testosteron-D 2 (1 mg / ml). Her bir stoğundan alınan, 01:01 kloroform içinde bir çözelti oluşturmak: 50 lik bir nihai konsantrasyona kadar metanol tüm standartlaraug / ml 17:00 seramid, 100 ug / ml 15:00 PC, 100 ug / ml testosteron D-2, 200 ug / ml 17:00 yağlı asit, 200 ug / ml 19:01 yağlı asit, ve 200 ug / standart karışımı ml 17:00 PE. </li><li> Algılama ve bu bileşikler için aletin doğrusallık sınırını belirlemek için her bir standart için en az beş farklı konsantrasyonları kullanılarak vaktinden önce her bir standart için iyonlaşma derecesinin test edin. Her bir standart için stok çözeltisinin konsantrasyonu deneysel tasarım bağlı olarak değişecektir ve birleştirilen çivili standart olarak her bir standart konsantrasyonu 2 mg / ml &#39;ye ml 20 ug / ikinci da iyonize ne kadar iyi bağlı olarak değişebilir. </li><li> Pozitif kontroller bir başak karışımını oluşturmak ve kantitatif numune hazırlama ve enstrümantal verilerin doğruluğu gücünü izlemek için 1x, 2x, 4x veya konsantrasyon seviyelerinde numunelerin ekleyebilirsiniz. Pozitif kontroller nihai konsantrasyonu canolması: 2 mg / ml D-glikoz, 100 ug / ml alanin-D 3, 200 ug / ml metilmalonik asit D-3, 20 ug / ml trigliserid-D 5, ve / veya diğer hidrofobik ve hidrofilik standartları. Analiz için kullanılan MS ve HPLC enstrümantasyon hassasiyetine göre standart konsantrasyonları ayarlayın. </li></ol> 3.. Protein Yağış <ol><li> Aşağıda tarif edildiği gibi Çözünme, oda sıcaklığına kadar örnekler ve her bir örneğe istD 10 ul başak. </li><li> Her bir örnek için (2.3 ve 2.4 &#39;de stoktan oluşturulan) hem hidrofilik hem de hidrofobik standart çözeltilerin 10 ul başak. Analiz için kullanılan MS ve HPLC enstrümantasyon hassasiyetine göre gerekli standart konsantrasyonları ayarlayın <ol><li> Her bir numune için 1x, 2x, 4x veya pozitif kontrol solüsyonu (adım 2.6 stoktan oluşturulan) ya 10 ul Spike. MS ve HP hassasiyetine göre gerekli standart konsantrasyonları ayarlayınLC analizi için kullanılan alet </li><li> Önce protein çökeltme aşamasından 10 saniye vorteksleyin Her numune </li></ol></li><li> Her bir örnek için (-20 ° C&#39;de saklanan) buz soğukluğunda metanol 400 ul ekleyin. </li><li> Tüp başına 10 sn Vortex. </li><li> 18000 x g ile 15 dakika boyunca 0 ° C &#39;de santrifüj. </li><li> Yeni bir cam tüpe tüm kültür süpernatant transferi ve daha sonra N2 altında kuru. </li><li> Protein pelet fraksiyonu analiz adımlara 3,8-3,11 geçin. Protein pelet analiz değilse, Bölüm 4&#39;e atlayın. Not: protein topağı ilaç çalışmaları gerçekleştirirken yararlı olacaktır yüksek hidrofobik olan bileşikleri ihtiva edebilecektir 18, gıda gibi nöronal seroid-lipofuscinoses 20 ve lizozomal lipid depolama gibi çok hidrofobik bileşiklerin birikmesine hastalıkları ile ilişkili hidrofobik flavonoidler 19 veya metabolomic çalışmaları ile ilgili analizler hastalıklar 21. </li><li> T MTBE 1 ml ilave ediliro beyaz (ya da off-white) protein pelet, tüp başına 30 saniye boyunca girdap, daha sonra x g 18.000 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 0 ° C &#39;de santrifüj. Yeni bir camdan yapılmış bir kültür tübüne MTBE katmanı süzün. Bu (temsilcisi sonuçları bkz. Şekil 5) burada hataları büyük ölçüde sonuçlarını etkileyecek gibi kritik bir adımdır. <ol><li> Pellet boyutunun örnekleri arasında değişir çünkü sürekli tüm örnekler için MTBE aynı miktarda aspire. Sadece 900 ul süpernatan en az miktarda numune için dökülmüştür olabilir, bu nedenle, daha sonra, bütün numuneler için 900 ul süzün. </li></ol></li><li> Adımı tekrar 3.9 ve aşama 3.7 &#39;de hazırlanan aynı camdan yapılmış bir kültür tübüne Organik tabakayı bir araya getirir. </li><li> 01:01 kloroform, 200 ul 2 N akışı ve tekrar süspansiyon ile Kuru örnekleri: metanol. Vortex kısaca. </li><li> Bir santrifüj tüpüne aktarılır. 18.000 x g&#39;de 15 dakika boyunca 0 ° C&#39;de santrifüj, sonra camını kullanarak vidalı kapaklı şişeleri autosampler süpernatant aktarmakpipetler. </li></ol> 4. Sıvı-sıvı ekstraksiyon <ol><li> Bir cam pipet kullanılarak, (Bölüm 3, aşama 6) bakiye kurutuldu, metanol, girdap 30 saniye için 3 ml MTBE eklemek girdap sonra, tüp başına 10 saniye 750 ul su ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca ~ 200 xg Spin. </li><li> Aspire MTBE (su almadan) tabakası ve temiz bir cam kültürü tüp transferi 2.5 ml. Not: Bu, burada farklılıkların sonuçlarını etkileyecek gibi kritik bir adımdır. Sabit bir hacim altında, sulu katman pipetle arıtılabilen sağlar çünkü MTBE 2.5 ml dikkatli bir şekilde üst tabakadan boşaltılmalıdır. Deneyin başlangıcında numunenin hacmi, bu yöntem için belirtilen 100 ul daha az olduğu takdirde, orantılı olarak bu başlangıç ​​numune hacmi yansıtacak şekilde MTBE hacmi büyütülebilir. </li><li> Numunenin geri kalan su kısmına 3 ml MTBE ekleyin ve vorteks tüp başına 10 saniye. </li><li> Spin ~ 200oda sıcaklığında santrifüj içinde 10 dakika boyunca xg. </li><li> Aspire (su almadan) MTBE 3 ml ve MTBE tüp ile birleştirir. </li><li> N2 altında kurutulmasıyla geri kalan sulu tabaka konsantre edin. </li><li> Suyun 100 ul tortu yeniden askıya. </li><li> Kısaca cam kültür tüp, girdap buz soğuk MeOH 400 ul ekleyin ve sonra santrifüj tüpüne aktarın. </li><li> 20-30 dakika boyunca -80 ° C&#39;de bırakın. 18000 x g ile 15 dakika boyunca 0 ° C&#39;de Spin. Not: Bu, bu, herhangi bir geri kalan protein metanol içinde çökelmesine izin verdiği bir -80 ° C dondurucu içinde tüm numune rafı yerleştirilmesi önerilir. -80 ° C dondurucu mevcut değilse, diğer seçenekler şunlardır:, -20 ° C&#39;de saklanması kuru buz örnekleri yerleştirerek, ya da bir buz kovası onları tutmak. Bu sürekli çökelmesine izin vermek için soğuk bir ortamda ve aynı sıcaklıkta örnekleri saklamak için önemlidir. </li><li> Için süpernatant ve transfer aspire 450 ulTemiz bir mikrosantrifüj tüpü. En fazla 45 ° &#39;den C&#39; de vakumlu bir santrifüjlü konsantre tamamen Kuru (Yaklaşık 1-2 saat) götürür. </li><li> % 5 asetonitril / su, 200 ul süpernatant kurutuldu, tekrar. Vortex kısaca. -80 ° C&#39;de dondurun </li></ol> 5. Katı faz ekstraksiyon <ol><li> Nitrojen iyi bir akış (yaklaşık 10-15 dakika sürer) ile 35 ° C&#39;de nitrojen altında MTBE fraksiyonu kurutun. </li><li> Ne zaman tamamen kuru, azot akışını durdurmak ve hızlı bir cam pipet kullanarak 1 ml kloroform (CHCl3) tekrar süspansiyon. Vortex kısaca. Not: CHCI3 gibi çözücüler düşük bir viskoziteye sahiptir. Pipetle sırasında, düşük yüzey gerilimli bir pipetten solvent kaybına neden olur. Bu pipet pipetle çözcünün ve pipet alanı arasında denge sağlamak için en az iki ön ıslatılmış olması önerilir. Mevcut ise bir gaz geçirmez şırınga de kullanılabilir. </li><li> Bir SPE vakum manifoldu ve NH 2 kurmak </sub&gt; Fraksiyonasyon için SPE sütunlar. </li><li> Sıcak RT&#39;ye örnekleri ve her zaman N 2 sabit bir akışı altında askıda tutmak. Oda sıcaklığına getirildikten lipid yeniden süspansiyon sağlayacak ve azot oksidasyon ve lipid polimerizasyonunun önleyecektir. </li><li> 400 ul hekzan ile yıkayın ve durum SPE kartuşu 2x. Atık atmak ve yeni bir cam toplama tüpü ile değiştirin. </li><li> SPE kolonuna örnek ekleme, cam tüpler içinde akışı toplamak. </li><li> Cam pipet 02:01 CHCl3 1 ml ekleyin ile: IPA (bu Neutral Kesir olduğu) aynı cam tüpler içinde akar toplamak. </li><li> Oksidasyonunu (yaklaşık 10-15 dakika sürer) en aza indirmek için N2 altında nötr kısmını kurulayın. </li><li> Cam pipet dietil eter içinde% 5 asetik asit, 1 ml ilave olarak, (bu, bir yağ asidi fraksiyonu olan) yeni bir cam tüpler içinde akışı toplamak. </li><li> Oksidasyon (yaklaşık 10-15 dakika sürer) en aza indirmek için N2 altında yağ asidi fraksiyonu kurutun. </li><li> 800 eklemek için plastik ipuçlarını kullanın ve# 181; SPE kartuşa metanol l ve akış yoluyla 15 ml&#39;lik plastik konik tüplerde (bu, fosfatidik asit,) toplar. </li><li> 1.5 ml santrifüj tüplerine fosfolipid fraksiyonu aktarın. 45 ° C (yaklaşık 1-1.5 saat sürer) &#39;de vakumlu bir santrifüjlü yoğunlaştırıcı ile örnekleri kurutun. </li><li> Depolama için şişeler vida kapağı otomatik numune% 100 metanol, girdap ve transfer 200 ul üç fraksiyonlardan numunelerinin her yeniden süspanse edin. </li></ol> 6.. Depolama Koşulları Örnek <ol><li> Alet analiz için hazır olana kadar -80 ° C &#39;de, tüm numuneler saklayın. Not: Organik bir çözücü içinde yeniden ekstraksiyon örnekleri, -20 ° C&#39;de saklanabilir Muhtemel ilgi metabolitleri bu sıcaklıkta ayrışmaktadır Ancak bu tavsiye edilmez. Sıvı azot depolama da müfettişler kirlenme sorunları, özel saklama flakonlar gerekli bildirdin olarak tavsiye ve bölme cau homojenlik eksikliği bulunmadığıgeniş sıcaklık dalgalanmalarını şarkı. </li><li> Numune hacimleri (&lt;100 ul) küçük ise, depolama sırasında üst kısmında çözücünün buharlaşmasını önlemek için şişeler içinde ekler kullanın. </li><li> Numunelerin dondurma-çözme kaçının. Doğru alet analizden önce, sadece bir kez örnekleri çözülme. Tekrarlanan donma-çözülür örnek bozulması neden olur. </li></ol> 7. Sıvı Kromatografi Koşulları <ol><li> Hidrofobik kısmını analiz etmek için bir C-18 2.1 mm x 12.5 mm (5 um) koruyucu kolon ile bir C-18 2.1 mm x 50 mm (1.8 um) analitik sütun kullanarak. </li><li> 4 autosampler sıcaklığını ayarlamak &#160; ° C, 60 kolon sıcaklığı &#160; ° C, 0.25 ml / dk &#39;ya 2 ul ve akış hızı için enjeksiyon hacmi. </li><li> Mobil faz B için su (60:36:4): asetonitril: Mobil faz A için su içinde% 0.1 formik asit ve izopropanol içinde% 0.1 formik asit kullanarak </li><li> Aşağıdaki gradyan elüsyon profili çalıştırın: başlatt% 30 B, ve 0 ila 1 dakika ila 70% B artışı, daha sonra 15 dakika için 1 &#39;den% 100 B&#39;ye artırmak ve 5 dakika% 10 B, yıkama ve 5 dakika sonrası dönemde, ardından 5 dakika için tutun. </li><li> Hidrofil kısmını analiz etmek için bir bekçi sütun ile bir HILIC&#39;i 2.1 mm x 50 mm (2.6 mikron) analitik kolon kullanın. </li><li> 4 autosampler sıcaklığını ayarlamak &#160; ° C, 20 kolon sıcaklığı &#160; ° C, 0.5 ml / dk ve 2 ul akış hızı için enjeksiyon hacmi. </li><li> 10 mM amonyum asetat, mobil faz A için pH 5.8 ve mobil faz B için 10 mM amonyum asetat, pH 5.8 içinde% 90 asetonitril içinde% 50 asetonitril kullanarak </li><li> Aşağıdaki gradyan elüsyon profilini çalıştırmak: 0 ila 2 dakika% 100 B&#39;de başlayın, sonra 5 dakika% 0 B, yıkama ve 10 dakika sonrası dönemde, ardından 15 dakika için, 2 den 50% B&#39;ye azalır. </li></ol>

<ol>
	<li>Beckonert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling,+metabolomic+and+metabonomic+procedures+for+NMR+spectroscopy+of+urine,+plasma,+serum+and+tissue+extracts.">Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.</a> Nature Protocols. 2, 2692-2703 (2007).</li><li>Clarke, C. J., Haselden, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Profiling+as+a+Tool+for+Understanding+Mechanisms+of+Toxicity.">Metabolic Profiling as a Tool for Understanding Mechanisms of Toxicity.</a> Toxicologic Pathology. 36, 140-147 (2008).</li><li>Wang, X., Zhang, A., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+of+Metabolomics+in+Diagnosis+and+Biomarker+Discovery+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Power of Metabolomics in Diagnosis and Biomarker Discovery of Hepatocellular Carcinoma.</a> Hepatology. 57, 2072-2077 (2013).</li><li>Collino, S., Martin, F. -. P. J., Kochhar, S., Rezzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Healthy+Metabolic+Trajectories+with+Nutritional+Metabonomics.">Monitoring Healthy Metabolic Trajectories with Nutritional Metabonomics.</a> Nutrients. 1, 101-110 (2009).</li><li>Cevallos-Cevallos, J. M., Reyes-De-Corcuera, J. I., Etxeberria, E., Danyluk, M. D., Rodrick, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+in+food+science:+a+review.">Metabolomic analysis in food science: a review.</a> Trends in Food Scienc., &amp; Technology. 20, 557-566 (2009).</li><li>Nicholson, J. K., Connelly, J., Lindon, J. C., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabonomics:+a+platform+for+studying+drug+toxicity+and+gene+function.">Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function.</a> Nature reviews. Drug Discovery. 1, 153-161 (2002).</li><li>Wishart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolome Analysis: An Introduction. , 253-288 (2006).</li><li>Vuckovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+trends+and+challenges+in+sample+preparation+for+global+metabolomics+using+liquid+chromatography&#8211;mass+spectrometry.">Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography&#8211;mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403, 1523-1548 (2012).</li><li>Bollard, M. E., Stanley, E. G., Lindon, J. C., Nicholson, J. K., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+metabonomic+approaches+for+evaluating+physiological+influences+on+biofluid+composition.">NMR-based metabonomic approaches for evaluating physiological influences on biofluid composition.</a> NMR in Biomedicine. 18, 143-162 (2005).</li><li>Dong, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern HPLC for Practicing Scientists. , (2006).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent-dependent+metabolite+distribution,+clustering,+and+protein+extraction+for+serum+profiling+with+mass+spectrometry.">Solvent-dependent metabolite distribution, clustering, and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 78, 743-752 (2006).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome.">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> Journal of Chromatography A. 1300, 217-226 (2013).</li><li>Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).</li><li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics.">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> Journal of Lipid Research. 49, 1137-1146 (2008).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, 911-917 (1957).</li><li>Ferreiro-Vera, C., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+sample+preparation+approaches+for+phospholipids+profiling+in+human+serum+by+liquid+chromatography&#8211;tandem+mass+spectrometry.">Comparison of sample preparation approaches for phospholipids profiling in human serum by liquid chromatography&#8211;tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1240, 21-28 (2012).</li><li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC-MS-Based+Analysis+of+Human+Plasma+for+Metabonomics+Using+Solvent+Precipitation+or+Solid+Phase+Extraction.">UPLC-MS-Based Analysis of Human Plasma for Metabonomics Using Solvent Precipitation or Solid Phase Extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li><li>Kerns, E. H., Di, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to toxicity optimization. First edn. , (2008).</li><li>Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., R&#233;m&#233;sy, C., Jim&#233;nez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols:+food+sources+and+bioavailability.">Polyphenols: food sources and bioavailability.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 79, 727-747 (2004).</li><li>Weimer, J. M., Kriscenski-Perry, E., Elshatory, Y., Pearce, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+ceroid+lipofuscinoses.+Mutations+in+different+proteins+result+in+similar+disease.">The neuronal ceroid lipofuscinoses. Mutations in different proteins result in similar disease.</a> NeuroMolecular Medicine. 1, 111-124 (2002).</li><li>Schulze, H., Sandhoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+lipid+storage+diseases.">Lysosomal lipid storage diseases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).</li><li>Kuhn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+evaluation+of+automated,+multiplexed+peptide+immunoaffinity+enrichment+coupled+to+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+for+quantifying+proteins+in+plasma.">Interlaboratory evaluation of automated, multiplexed peptide immunoaffinity enrichment coupled to multiple reaction monitoring mass spectrometry for quantifying proteins in plasma.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11, (2012).</li><li>Rist, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Freezing+and+Storage+Procedure+on+Human+Urine+Samples+in+NMR-Based+Metabolomics.">Influence of Freezing and Storage Procedure on Human Urine Samples in NMR-Based Metabolomics.</a> Metabolites. 3, 243-258 (2013).</li><li>Boomsma, F., Alberts, G., van Eijk, L., Manin&#8216;t Veld, A. J., Schalekamp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Collection+and+Storage+Conditions+for+Catecholamine+Measurements+in+Human+Plasma+and+Urine.">Optimal Collection and Storage Conditions for Catecholamine Measurements in Human Plasma and Urine.</a> Clinical Chemistry. 39, 2503-2508 (1993).</li><li>Wood, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+the+human+circulating+endocannabinoid+metabolome:+clinical+sampling+and+sample+storage+parameters.">Comprehensive profiling of the human circulating endocannabinoid metabolome: clinical sampling and sample storage parameters.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 46, 1289-1295 (2008).</li><li>Bahr, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Peripheral blood mononuclear cell gene expression in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 316-323 (2013).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Klinik metabolomic çalışmaların bir gol hastalık veya tedavi ile ilgili metabolome değişiklikleri tespit etmektir. Bu nedenle numune hazırlama teknikleri, sağlam, tutarlı ve teknisyen teknisyen ve laboratuvardan laboratuvara 22 aktarılabilir olması gerekir. Edilen veriler örnek temsilcisi olması gerekir, ve tespit değişikliği oldukça numune hazırlama hataları daha ayarlamak örnek yansıtmak gerekir. Dolayısıyla doğru pipetleme, doğru sıcaklık, karışmayan katmanlarının verimli durulaştırmanın, azot altında kurutma ve cam ve ipuçları aynı marka ve boyutlarda kullanılması gereklidir. Protein çökeltme aşaması sırasında, çözeltinin aynı miktarda her bir pelet boşaltıldı çok önemlidir. Bu hacim değişimini azaltır ve gibi örnek veri değişimini azaltır. Bu protein çöktürme adım metabolomic çalışmalar için gerekli olan ve ondan protein kaldırır beri Atlanamayacaköncesinde, küçük molekül için numuneler kütle spektrometresinde analiz profil. Bu patojenler ve büyük makromoleküllerin ortadan kaldırır ve bültenleri proteinlerden 7 metabolitleri bağlı. Numunelerdeki protein birikimi eksikliği HPLC kolon kullanım genişler ve doğruluk ve sonuç kalitesinin. 5. plazma örneklerinde bu tekniği gerçekleştirirken oluşan protein pelet bir tasvir olan Şekil artırır. Bu, küçük moleküllerin tespiti, iyon bolluk artırır ve numune içinde proteinlerinden matris etkilerini azaltır sağlar. Tüm proteinler, bu aşamada çıkarılır varsayılmıştır Ek olarak,, LC-MS analizi sırasında tespit edilen amino asitler, metabolik değişiklikler yerine protein arıza kaynaklı olacaktır. Iki karışmayan katmanlar halinde, hidrofilik ve hidrofobik metabolitleri tarafından ayrılmıştır sıvı-sıvı ekstre etme aşaması çok önemlidir. Şekil 6 LLE prosedürü ve bir temsilcisi göstermektedirLLE tabakanın resentation. İki tabakadan bir yanlış ayrılması metabolitleri kaybolma ya da her iki fraksiyonda da elüt edilen iki sonuçlanır. Bu adımın dikkatli uygulama hidrofobik kısmını görünür hidrofilik bileşiklerin sayısını azaltır. Bu temsili sonuçlar içeren fraksiyon tespit edilemez çünkü bu bileşikler için sonuçlar güvenilmez hale gelir. Doğru yapıldığında, metaboliti örtüşme azalır. Özellikle de lipidler değil, aynı zamanda örneğin, tiol grupları ihtiva edebilir, küçük molekülleri, oksidatif bozulmasını önlemek için, oksijene maruz minimumda tutulmalıdır. Bu nedenle, bu işlem her lipit veya tiol içeren bileşiklerin oksidasyonunu önlemek / azaltmak için azot altında gerçekleştirilir. Buna ek olarak, numune ve / veya çözelti transferi örnekleri hızlı bir şekilde kuruması için, sabit bir nitrojen akışı altında yerleştirilir, daha sonra oksijen maruz kalmasını azaltmak için (ilk dakika içinde) hızlıdır. Kuruduğunda, bunlar derhal vardırrilmesi yukarıda bahsedilen nedenlerden ötürü% 100 metanol içinde yeniden süspansiyon haline getirildi. Laboratuar bir dizi yolla, bu kapsamlı bir yöntem yararlanabilir; Bileşiklerin bir sınıf izole etmek isteyen araştırmacılar, onların ihtiyaçlarına en uygun yöntemi bölümünü seçebilirsiniz. Sadece metabolitlerin bir havuz elde etmek için bir protein yağış gerçekleştirmek isteyenler bunu yapabilir. Hidrofilik metabolitleri, birçok ilaç, amino asitler ve şekerler veya yalnızca hidrofobik metabolitleri örneğin trigliseritler, epoksitler, yağda çözünen vitaminler, ve örneğin fosfolipidler gibi, arzu edildiği takdirde, daha sonra araştırmacılar, sıvı-sıvı özütleme gerçekleştirmek gibi, arzu edildiği takdirde protein çökeltme aşağıdaki adım ve istenmeyen kısmını atın. Hidrofobik bileşikler (nötr yağlar, yağ asitleri ve fosfolipid) daha fazla alt sınıflandırma gerektiren Araştırmacılar fraksinasyon adımla devam edebilir. Depolama hususlar maintaini önemlidirDaha sonra analiz için numune canlılığı ng. Örnekler yanlış depolandığı takdirde, bozulma veya ayrışma oluşabilir. İdeal olarak, numune hafif hassas türlerin bozulmasını önlemek için ışıktan uzakta vidalı kapaklı amber şişelerde muhafaza edilmelidir. Örnekler 23-25, aynı zamanda metabolit bozulmasını önlemek için -80 ° C&#39;de donmuş halde muhafaza edilmelidir. Burada ayrıntılı olarak ele rağmen, örnekler her zaman LC-MS analizi sırasında otomatik numune tepsisine 4 ° C&#39;de tutulur. Bu, tüm örnekler, sabit bir sıcaklıkta ve çevre sıcaklığında değişiklikler örneklerin viskozitesi, çözünürlüğünü veya stabilitesini etkilemez tutulmasını sağlar. Bu tür LLE ve SPE olarak bu prosedürün manuel görünümleri, ilgili adımlara güven ve rahatlık sağlamak için uygulanabileceği önerilir. Birkaç sınırlamalar, bu tekniğin var. Hidrofobik ve hidrofilik metabolitlerinin Gizli ayrılması bazı bileşikler özgü olarak meta olacak gibi garantiently nedeniyle, kimyasal bileşimi ve şarj durumu için her iki bölüme aynlır. Şekil 4, protein topak çıkarma aşaması sırasında uygun olmayan örnekleri ve teknik kalite kontrol hem de zayıf tekrarlanabilirlik metabolit neden olabilir gösterildiği gibi, ek olarak. Istatistiksel güç mevcut değildir, çünkü bu özellikle küçük veri kümelerinde istatistikleri etkiler. Bu nedenle, bu adım, tam olarak her bir örnek için, aynı her zaman gerçekleştirilebilir çok önemlidir. Başka bir sınırlama zamanı. Durak noktaları örnekleri dondurulmuş olabilir ve hazırlık ertesi gün de devam bu protokol boyunca olmasına rağmen, bütün bir gün bu yordamı gerçekleştirmek için kenara olmalıdır. Üçüncü olarak, bir biyolojik numune içinde, her bileşiğin iyon bastırılması için değerlendirilebilir değildir. Bu matris her metaboliti nasıl etkilediğini belirlemek mümkün olmadığından, geçerli seçenek teorik endogenou bazı sınıfları taklit dahili standartlar değerlendirmektirs metabolitleri. Son olarak, mutlak tanımlamalar bu yöntemle sadece gerçekleştirilemez. Veritabanı arama ve standartları ile işbirliği içinde tandem MS mutlak metabolit tespiti için gereklidir. Metabolitler önemli bir kısmı, bileşimlerinin tanımlanmasıdır. Burada ayrıntılı olarak ele rağmen, kalite kontrol örnekleri LC-MS kullanılarak analiz edildi. Çoklu numune hazırlama boşlukları ve enstrüman boşlukları böylece daha güvenilir bir metaboliti hit sonuçlanan kirliliklerden yanlış pozitiflerin oranını azaltmak için plan çıkarma olarak kullanılmak üzere hazırlanmıştır. Bu etaptan sonra, &quot;moleküler özellikleri&quot; sayısının, m / z, tutma süresi, izotop oranı ve gerçek bileşiklerin bir listesini üretmek için adüktleri esasına dayanan bir araya gruplandırıldı. Bileşiklerin listesi büyük ölçüde azaltılmış olsa da, aynı bileşikten birden fazla ek ürünlerine dayalı değildi gibi, sonuçları daha güvenilir. Tam bir yöntem kapsamlı ve isolatio sağlarBu tür nötr lipidler, fosfolipidler, yağ asitleri, trigliseritler, steroidler, aynı zamanda, sulu fraksiyonda hidrofilik sınıfları izole ederken, bunların eikosanoidlerin, şekerler, flavonoidler ve amino asitler 12 tespit edilmiştir, 26 gibi hidrofobik metabolitlerin n.

Biyolojik reaksiyonlar hücresel süreçlerin nihai ürünler olarak metabolitler üretmek. Metabolomik Bu işlemlerin bir sonucu olarak bir organizmada mevcut olan tüm bileşiklerin topluluğudur. Bu hücrelerin fizyolojisi bir görüntü sağlar ve içsel veya dışsal uyaranlara 1, 2 bir organizmanın tepkisini yansıtmaktadır. Bu tür uyaranlara, çevresel toksikolojik, farmakolojik, beslenme, hormonal, ya da hastalığa bağlı olabilir. Birçok metabolomic uygulamaları var ve şu anda araştırmacılar tarafından çalışılmaktadır ve biyolojik keşif 3, beslenme çalışmaları 4, gıda bilimi 5 ve uyuşturucu testi 6. içerir. Ne olursa olsun uygulama, veri, kirlenme ve yanlış pozitiflerin mevcudiyetinde varyasyonları azaltılmış ya da tercihan kaldırılması gerekir. Biyobelirtecin keşif veya biyolojik bir f bir kontrol ve bir hastalık grubu arasındaki farklılıkları belirlemek, ya da konularda ilaçların etkilerini araştıran durumundaLUID sorulan sorulara göre seçilir ve metabolitleri türleri 7 araştırılmaktadır. Örneğin, numuneler önce bronkoalveoler lavaj (BAL) metabolitler keşfetmek ve uygulamadan sonra sonra, astımlı akciğerlerdeki bir solunan ilacın hemen etkilerini inceleyerek eğer tercihli olacaktır. Farklar gerçek biyolojik çeşitlilik yerine uygun olmayan örnek hazırlama tekniğine bağlı olarak gözlenen emin olmak için, standart ve tutarlı bir laboratuar protokol 8 gereklidir. Örnek bilgi dikkatle böyle birkaç isim biyolojik sıvının, hayvan zorlanma, örnekleme zaman, konu yaş, cinsiyet gibi değişkenler, tüm kabul ve çalışmaya 9 çarpanlarına sağlamak için dokümante edilmelidir. Buna ek olarak, kirlenme veya yanlış pozitif olasılığını azaltmak için, bu çözücü boşlukları ve enstrüman boşlukları 10 analiz edilmesi tavsiye edilir. Bu protokol için, dönem &quot;Metabolites &quot;belirlenen gerçek bileşikleri ifade etmek için kullanılacaktır. Satıcı yazılımı kullanarak, bir başlangıç ​​zirve bulma algoritması kütle spektrum zirveleri tespit etmek için kullanılır. Bu tepeler kütle-yük (m / z) oranı ile tutma süresi göre hizalanır. İkinci bir algoritma daha sonra bir tek bir bileşik, birden fazla özelliklerini birleştirmek için kullanılır. Bu, sodyum, potasyum, ya da pozitif iyonizasyon modunda amonyum adüktleri ve negatif iyon modunda klorür gibi özellikleri içerir. Yazılımında ek seçenekler gibi dimerleri ve diğer adüktlerin gibi özellikleri içerir. 181.0707, m / z (M + H) zirveleri ile, bir örnek olarak glikoz kullanarak, 198,0972 m / z (M + NH4) ve 203,05261 m / z (M + Na), aynı tekabül eden üç adet tepe noktası olacaktır İlk algoritması ile bileşik. Moleküler formüle dayanır ikinci algoritması, uygulandığında Ancak Bu üç ilave bileşikleri bir bileşimi elde edilir gruplanmış olur. Metabolitler samp içinde girişimlere sebep olabilirMevcut bileşiklerin karmaşıklığı nedeniyle les. Bir numune nedenleri metabolitlerinin varlığı bin özellikle alt bolluk metabolitlerin bastırılmasına işaret etmektedir. Örnek temizleme proteinleri müdahale kaldırmak ve birden çok bölüme daha sonra ayrılması, böylece, numune, en yüksek ayrılma iyileştirilmesi artan çözünürlük ve metabolit birlikte elüsyona uğratılmasına azaltılması karmaşıklığını azaltır. Bu nedenle, örnek temizleme ve bileşiklerin geliştirilmiş ayırma gereklidir. Hatta çeşitli kutupluluk çözücülerin kullanımı ile tek başına protein yağış, kanıtlanmıştır, bu meseleyi 11, 12 çözemez. Ancak, fraksiyonasyon sonraki adım MTBE gibi bir güçlü organik çözücü birleştirerek, metabolit kapsama artar. Yang et al. 12 Birleştirilen MTBE solven ekstraksiyonu kullanılarak 3806 metabolitlere, sırasıyla metanol ya da tek başına metanol-etanol çökeltme ile 1851 veya 2073 metabolitlerin bir artış raporKatı faz ekstraksiyonu (SPE) adım izledi. Azaltılmış metabolit örtüşme, geliştirilmiş ayırma ve yüksek tepe metabolit bolluk Bu yöntem ile gözlenmiştir. Bu gibi polimer olmayan metabolitleri, bulaşma tehlikesi numune toplama, solventler veya alet gürültüye neden olabilir, ve potansiyel olarak önemli metabolitleri sinyal baskılanmasına neden olabilir. Tavsiye edilir teknisyeni (ler) ve hazırlama sürekli aynı marka, tipi ve örnek toplama şişeler, pipet uçları ve numunelerin toplanması ve hazırlama sırasında kullanılan herhangi bir başka tüplerin boyutunu kullanmak örnek önce numuneler edenler. Bu veri analisti gözlenen değişiklikler gerçek ve diğer kaynaklardan gelen arka plan farklılıkları nedeniyle olmadığını, tam güven duymalarını sağlar. Tedavi etkinliği, hastalık ve kontrol gruplarının, veya herhangi bir diğer metabolik analizler arasındaki farklılıklar daha sonra artan güven ile araştırılabilir. Method Burada ele plazma, BAL sıvısında veya beyin omurilik sıvısı (CSF), sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LCMS) göre analiz için non-hedefli metabolomic profil için örnekler uygulanabilir kombine numune hazırlama yöntemleri 13-15 odaklanır. Sıvı kromatografisi (LC) ve ultra-performans sıvı kromatografi Hem (UPLC) ayırma teknikleri, bu prosedür daha sonra MS akuple edilebilir. Metabolomic çalışmalar yapan birçok araştırmacı bir protein çöktürme tekniği ve / veya sıvı-sıvı ekstraksiyon tekniği 16, 17 ya kullanın. Çalışmalarda, bu az metabolitleri tespit sonuçlandı. Burada tarif edilen yöntem, 12 metabolome daha geniş bir aralığını kapsayan, metabolitlerin daha fazla sayıda algılama ve tanımlanmasını sağlar. Bu artış, metabolit sınıfların önce ayrılması neden olduğu örnekleri ve düşük matris etkileri yüksek saflık kaynaklanmaktadır. Bir ilk protein çöktürme aşaması numuneden proteini uzaklaştırmak için soğuk metanol (MeOH) kullanılarak gerçekleştirilir. Metil tert-butil eter (MTBE) ve su kullanılarak sıvı-sıvı ekstraksiyonu (LLE) hidrofilik ve hidrofobik bileşikleri ayırmak için kullanılır. Yağlı asitler, nötr yağlar, fosfolipidler ve - sonra katı faz ekstraksiyonu (SPE), üç sınıfa hidrofobik bileşikleri ayırmak için bir hidrofobik tabaka üzerinde gerçekleştirilir. Hidrofilik kısımlar su içinde% 5 asetonitril içinde yeniden ise hidrofobik kısımlar,% 100 metanol içinde yeniden edilir. Katı faz ekstraksiyonu (SPE) aşaması, aksi takdirde mevcut olacak birlikte elüt edilen bileşiklerin sayısını azaltarak sonuçlarda güven seviyesi, ilave bir ayırma aşaması gerçekleştirilir olmasaydı sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="628">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A955-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L-6815</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C606-1</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Hexane</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34859</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">49199-50ML-F</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methyl tert-butyl ether</td>
			<td style="width:163px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9042-03</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34965-2.5L</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Water</td>
			<td style="width:163px;">Honeywell Burdick &#38; Jackson</td>
			<td style="width:119px;">365-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">OA-SYS heating system</td>
			<td style="width:163px;">Organomation Associates, Inc</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">12-position vacuum manifold</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">Strata NH2 (55&#181;M, 70&#197;) 100mg/mL SPE cartridges</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">8B-S009-EAK</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass pipette tips</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20C</td>
			<td style="width:183px;">Used to transfer sample to SPE column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Plastic pipette tips</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1182-1830</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used when glass tips are not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">1182-8810</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Graduated glass pipets</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-27B</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used to transfer organic solvents during sample prep</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">13-678-27E</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Pyrex glass culture tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">99499-16X</td>
			<td style="width:183px;">Used to store aqueous and lipid fractions until the next step</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0545</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Snap cap vials for autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0541</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass inserts</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5183-2085</td>
			<td style="width:183px;">Used for small sample volumes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Qualitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.06.00</td>
			<td style="width:183px;">Used to monitor retention times and pressure curves</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Quantitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.05.02</td>
			<td style="width:183px;">Used to analyze quality control and sample data</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Mass Profiler Professional software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.12.50</td>
			<td style="width:183px;">Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-step preparation technique to recover multiple metabolite compound classes for in-depth and informative metabolomic analysis

Metabolomik biyolojik süreçler hakkında fikir elde etmek amacıyla canlı organizmaların örnekler profilleme sağlayan gelişmekte olan bir alandır. Metabolitler bir önemli yönü tutarsız teknikleri güvenilmez sonuçlar üretmek sayede örnek bir hazırlıktır. Bu teknik, protein çökeltme, sıvı-sıvı ekstraksiyonu, ve dört farklı sınıfa metabolitleri kısımlara ayrılması için bir araç olarak bir katı faz ekstraksiyon kapsar. Duyarlılığında bir artış ile sonuçlanan düşük bolluk moleküllerin geliştirilmiş zenginleştirme elde edilir ve sonuçta moleküllerin daha emin tanımlanmasında sonuçlanır. Bu teknik, plazma, bronkoalveolar lavaj sıvısında ve 50 ul kadar düşük hacimli beyin omurilik sıvısı numune uygulanmıştır. Örnekler çoklu alt uygulamalarda kullanılabilir; örneğin protein çökeltme elde edilen pelet bir sonraki analiz için saklanır. Bu aşamadan gelen süpernatan kullanılarak sıvı-sıvı ekstraksiyonu uğrarsu ve hidrofilik ve hidrofobik bileşikleri ayırmak için güçlü bir organik çözücü içinde eklenmektedir. Parçalanmış sonra, hidrofil tabaka, daha sonra analiz için işlenebilir ya da gerekli değilse atılır. Hidrofobik parça bundan başka yağlı asitler, nötr yağlar, fosfolipidler ve içine ayırmak için, üç katı faz ekstraksiyon adımları sırasında çözücülerin bir dizi ile muamele edilmektedir. Bu teknisyen bileşiklerin sınıf analizi için tercih edildiği seçmek için esneklik sağlar. Ayrıca kimyasal sınıf mevcut bazı bilgi beri daha güvenilir metaboliti belirlenmesine yardımcı olur.

Tüm numune hazırlama tekniği yukarıda tarif edildiği gibi yapıldı ve en önemli ve / veya ilgili yönleri aşağıda sunulmuştur. Hidrofilik ve hidrofobik iç standartları çeşitli ekstraksiyon yöntemleri kullanarak iç standartları ve endojen metaboliti bollukları doğrudan karşılaştırmalar yapmak için toplanmış plazma örneklerinde içine çivili edildi. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) veri kalitatif ve kantitatif yazılımı kullanılarak analiz ve mükemmel iyileşme ve endojen bileşikler ve hem de iç standartları ayrılması ile sonuçlanmıştır. Şekil 1, standart iki lipid ekstraksiyonunda MTBE-SPE metodunun etkinliğini göstermektedir (A) ve endojen bileşikleri (B). Genel olarak, daha iyi bir ekstre etme ve metabolitlerinin kapsamı metanol ekstre etme, ya da &#39;MTBE Yalnızca&#39; çıkarma gibi diğer yöntemlere göre elde edildi, bu numara of özellikleri, LC-MS analizi, aşağıdaki niteliksel ve niceliksel yazılımı kullanılarak karşılaştırılmıştır. Örneğin, yalnızca metanol ekstraksiyonu kullanılarak, kreatinin-D 3 için varyasyon% 15.2 idi. Bununla birlikte, MTBE LLE ile, bu% 1.04 CV düşürülmüştür. MTBE kullanılarak, lipid ve sulu bileşiklerin tekrarlanabilirliği &lt;lipit ve sulu bileşikler için sırasıyla% 29 daha büyük bir varyasyon% 15 sonuçlanan daha basit bir ekstraksiyon metanol ile karşılaştırıldığında sırasıyla% 8 ve &lt;% 5 idi. Lipid kurtarma izlenmesi için kullanılan iç standartlar - testosteron D-2, C17 seramid, 15:00 PC ve tek başına metanol kullanılarak göre% 26,% 200,% 100,% 400 artmıştır sırasıyla 17:00 PE. Benzer artışlar yağ asidi iç standartları ve fosfotidilkolini ve phosphotidylethanolamine endojen metabolitleri tespit edilmiştir. Bu tür sphingosines, seramidler, diasilgliseroller, triaçilgliserol, kolesterol ve sfingomyelin gibi diğer endojen metabolitlerin tespit edilmemiştir ya dametanol kullanılarak ya da ihmal edilebilir düzeylerde tespit edildi. Bununla birlikte, bu endojen lipidler kolayca MTBE ekstraksiyonu kullanılarak tespit edildi. Standart protokoller karşılaştırma eden analizlerde, aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir: Metanol çökeltme tek başına 1851 metabolitleri ile sonuçlanmıştır, metanol-etanol çökeltme 2073 metabolitleri verdi, sıvı-sıvı ekstraksiyonu ile MTBE sıvı-sıvı ve geri kazanılan katı faz ekstraksiyonu ile 3125 ve MTBE verdi 3806 metabolitleri. Azalma nedeniyle iyon bastırma ve önceki LC-MS temizleyici örnekleri için en olası ekstre edilen metabolitler, bir daha fazla sayıda Dolayısıyla bu yaklaşım, sonuç. Şekil 2, daha emin, metabolit tespiti için ilgili kimyasal sınıfa hidrofobik metabolitleri ayrılması verimini göstermektedir. SPE sonra üç lipid fraksiyonlarında tespit edilen bileşiklerin en az bir örtüşme vardır. Destek olarak, 3: ŞekilISTD ait kimyasal sınıfına ilişkin fraksiyonda elute edilmiştir olduğunu gösteren, iç standartlar geri kazanımı. Kalite kontrol numuneleri, numune hazırlama kalitesini değerlendirmek için analiz birden fazla gün büyük bir örneklem kümesi için gerekli olduğunda herhangi bir toplu etkilerini belirlemek için, ve enstrüman tekrarlanabilirlik izlemek için kullanılır. Kromatogramlar kirpi-standartları az ±% 5 den daha az ± 3 ppm ve tutma süresi penceresinde toplu hata geri kazanılan en az% 90 olduğundan emin olmak için incelenir. Bu kriterler yerine getirilmediği takdirde, sonuçlar atılır ve numuneler tekrar analiz edilir. Tutuşunda bir kayma bir seri için görülmektedir, böylece yığın etkileri bir durumda, veri analiz yazılımı bu düzeltebilir. Toplanmış plazma numunelerinin bir önceden hazırlanmış yığın örnek hazırlama uygulandı. Bölümler daha sonra, otomatik numune alıcı ampüller içine alt-numune alınır ve izleme aracı şartların kullanılmak için -80 ° C&#39;de saklandıHer numune analiz boyunca yazıtlarıdır. Tablo 1 bu başak-standartların sonuçlarını gösterir. QC örnek için başak-standartların% CV% 10 daha büyük olduğu için yağ asidi negatif iyonlaşma modu fraksiyon (veriler tabloda gösterilmemiştir) analiz için kullanılmadı. Bu kısmıyla bu nedenle veri kümesi atılır ve alet kontrol ve muhafaza edildi. Tablo 2 Numune hazırlama ve üç nüsha alet enjeksiyonları üç farklı gün sonra numunelerde endojen metabolitlerin sonuçlarını gösterir. Numune hazırlama QC örnekleri, endojen metabolitler, numune hazırlama gücünü, hem de alet enjeksiyon tekrarlanabilirliğini gösteren, her tekrarlanabilir. Numune hazırlama adımları düzgün takip değildir, ancak, güvenilir ve tutarsız sonuçlar elde edilir. Şekil 4, elde edilen sonuçları göstermektedir zaman, yöntemin protein çökeltme adımıözetlenen olarak takip edilmemektedir. Üç operatör, A, B, ve C toplanmış plazma örneklerinde aynı numune hazırlama prosedürü takip edilerek gerçekleştirilir. Operatör A, daha çok deney protokolüne göre yüzer gerekli miktarda pipetle göre yerine pelet bir ile her yıkama için&gt; 1 ml pipetle. Bu, bir kısmı için yanlış pozitif bir daha fazla sayıda sonuçlandı ancak verilerin değişkenlik arttırdı. Verilerin kromatografik tekrarlanabilirliği, Şekil 7&#39;de görülebilir. Toplanmış plazma örnekleri bu protokolde tarif edildiği gibi protein çökeltme, sıvı-sıvı ekstraksiyonu, ve katı faz ekstraksiyonu kullanılarak ayrı günlerde üç kopya halinde hazırlanmıştır. Her bir fraksiyon protokol bölüm 7&#39;de tarif edilen kromatografik ayırma kullanılarak analiz edilmiştir. Numuneler daha sonra, alet ve numune hazırlama tekrarlanabilirlik değerlendirmek için LC-MS ile ilgili üç kez enjekte edildi. Bu tutarlı bir örtüşme streng hem göstermektedirÜç farklı günlerde hazırlanan numune hazırlanması, hem de yeniden üretilebilir sonuçlar üretiminde kromatografik yöntemin gücü tekrarlanabilirliği th. Kimyasal gürültü bir artış yağ asidi fraksiyonu: negatif iyonlaşma modu için görülmektedir. Bu, LC-MS çözücüler içinde kirletici oluşabilir ve tutarsız kantitatif metabolomic sonuçlara neden olabilir. Bu nedenle önce 9 dakika için yıkanmış, sadece metabolitleri analiz edilmiştir. Uzun iş listelerini çalıştırırken, cihazın duyarlılığı ve tampon konsantrasyonlarının değişim kaybı azalmış sinyal yoğunluğu ve tutma süresi kaymasına yol zamanla oluşabilir. Tutma süresi, üst üste binme varyasyon az% 5 ve sinyal yoğunluğu değişim% 10&#39;dan daha az ise, veri standart laboratuar sınırlar içinde devam etmektedir. Analiz yazılımı aracı ve tutma süresi sürüklenme düzeltmek için verileri hizalamak ve normalize etmek için kullanılabilmektedir. Bununla birlikte, varyasyon lar isege, o nedeni belirlenmelidir. Bu rektifiye sonra, numuneler yeniden analiz edilebilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Çıkarma ve ters fazlı kromatografi (RPC) 12 Aşağıdaki Lipid istDS (A) ve endojen metabolitlerin (B) bolluğu. Ekstraksiyon yapıldı ve elde edilen numuneler RPC kullanılarak ayrıldı ve pozitif ve negatif iyonizasyon modunda LC-MS kullanılarak analiz edildi. Bu rakam, Yang ve arkadaşları, 1300 A kromatografi, 217-226 (2013), Journal of modifiye edilmiştir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2.. MTBE-SPE karşılaştırılması 12 fraksiyon. Her bir fr tanımlanan metabolitlerhareket hazırlık SPE bölümü sırasında üst üste binme miktarını belirlemek için karşılaştırılmıştır. Venn diyagramı içindeki rakamlar, her fraksiyon tespit metabolitlerin sayısını yansıtmaktadır. İşte küçük örtüşme SPE adımında başarılı bileşik çıkarma ve metaboliti sınıf ayrımını temsil eden üç fraksiyon arasında görülmektedir. Bu rakam, Yang ve arkadaşları, 1300 A kromatografi, 217-226 (2013), Journal of modifiye edilmiştir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. MTBE-SPE yöntemi kullanan 12 kesirleri istDS kurtarma. Ekstraksiyon yapıldı ve elde edilen numuneler RPC kullanılarak ayrıldı ve metinde tarif edildiği gibi pozitif ve negatif modda LCMS ile analiz edilmiştir. Bu rakam, Yang ve diğerleri, 217-226 (2013) Kromatografi A 1300, Journal of modifiye edilmiştir. &#39;/ P&gt; <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. Üç operatör tarafından hazırlanan pelet fraksiyonu Sonuçları. Üç örnek hazırlama operatörler A, B, ve C toplanmış plazma örneklerinde aynı protein hazırlama adımı gerçekleştirilir. Venn şemasında sayılar her operatör tarafından tespit metabolitlerin sayısını yansıtmaktadır. Operatör A 500 üzerinde daha fazla metabolit, çoğunluğu belirli bir kısmı için yanlış pozitif olarak sonuçlanan tüm süpernatant ve pelet bir pipetle ise operatörler B ve C Numune hazırlama protokole göre, gerekli hacmi pipetlenir. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig5highres.jpg" width="500" /> Protein çökeltme aşaması sırasında protein pelet Şekil 5,. Formasyonu &lt;. / Strong&gt; (A) insan plazması içinde 100 ul önceden hazırlanmasını örnek için (B) plazma soğuk metanol ilave edildikten sonra, 18,000 x 15 dakika boyunca 0 ° C &#39;de santrifüjden sonra borunun alt kısmında oluşturulmuş (C) protein topağı g. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig6highres.jpg" width="500" /> Sıvı-sıvı ekstraksiyonu (LLE) aşaması sırasında, hidrofilik ve hidrofobik tabakaların Şekil 6.. Ayrılması. Organik çözücü, metil tert-butil eter (MTBE) ve su hidrofilik ve hidrofobik metabolitleri ayırmak için kullanıldı. MTBE tabakası polar olmayan bileşikler çözülene ve su katmanı, polar bileşiklerin çözülene (A) yüzer plazma protein çıkarılmasından sonra,. (B) plazma azot altında kurutulduktan sonra, MTBE ilave edildikten sonra (C), plazma; <str<html> Ong&gt; plazma ve MTBE su (D) Ayrıca, santrifüjden sonra meydana (E)-MTBE su katmanı, üst tabaka MTBE (F) çıkarılması, (G) MTBE bertaraf edilmesinden sonra geri kalan esas olarak hidrofilik bir tabaka. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7... Numune hazırlama üç ayrı havuza plazma QC örnekleri ve her bir numune üzerinde gerçekleştirilmiştir seçilen bir veri kümesinden fraksiyonların Kromatogramlar LC-MS alet üzerinde üç kez enjekte edilmiştir. Yöntem protokol bölümü 7&#39;de gösterilen LC-MS parametreleri kullanılarak elde edilen plazma numunelerinin toplam iyon kromatogramları olan temsil etti. Diğer biyolojik sıvıların kromatografik gösterimi nedeniyle metabolit bileşim içinde farklılıklara değişir.&quot;k&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="485"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="42"><td height="42" style="height:42px;width:85px;"> Kesir </td><td style="width:72px;"> İyonizasyon modu </td><td style="width:127px;"> İç Standart </td><td style="width:23px;"> n </td><td style="width:103px;"> Ortalama Tepe Alanı </td><td style="width:77px;"> Tepe Alan% CV </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Sulu </td><td> Pozitif </td><td> Kreatinin-D 3 </td><td> 31 </td><td> 2217311 </td><td> 3.8% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Nötral lipid </td><td> Pozitif </td><td> Trigliserid-D 5 </td><td> 31 </td><td> 4837032 </td><td> % 9.9 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td&gt; <td></td><td> C17 Ceramid </td><td> 31 </td><td> 12736707 </td><td> % 7.9 &#39; </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Phospholipid </td><td> Pozitif </td><td> 15:00 PC </td><td> 32 </td><td> 1248929 </td><td> 9.3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 17:00 PE </td><td> 32 </td><td> 517234 </td><td> % 7.9 &#39; </td></tr></tbody></table> Çivili iç standartlar Tablo 1. Kalite kontrol sonuçları. Bir fare modeli, amfizem veri kümesinden toplanan plazma örnekleri, bu çok-haftalık çalışma için günlük olarak alet koşullarını izlemek için analiz edilmiştir. Kantitatif analiz yazılımı, iç standartlar, (n alet QC enjeksiyonlar = sayısı) tepe noktası alanlarını belirlemek için kullanılmıştır. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="555"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="42"><td height="42" style="height:42px;width:85px;"> Kesir </td><td style="width:76px;"> İyonizasyon modu </td><td style="width:212px;"> Endojen metabolitleri </td><td style="width:103px;"> Ortalama Tepe Alanı </td><td style="width:80px;"> Tepe Alan% CV </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Sulu </td><td> Pozitif </td><td> Kreatinin </td><td> 2554574 </td><td> 2.3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> Valin </td><td> 3712151 </td><td> 3.3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> Glikoz </td><td> 2669190 </td><td> % 6.9 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Nötral lipid </td><td> Pozitif </td><td> 3-Dehydrosphinganine </td><td> 226644 </td><td> 3.9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td&gt; DG (16:00 / 16:01 / 00:00) </td><td> 11301 </td><td> % 8.2 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> DG (P-14: 0/18: 1) </td><td> 364119 </td><td> % 1.9 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Phospholipid </td><td> Pozitif </td><td> PC (24:0 / 0:0) </td><td> 27599 </td><td> % 0.9 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> PC16: 0/22: 6) </td><td> 2873326 </td><td> % 4.5 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> PI (16:0 / 18:1) </td><td> 112998 </td><td> 4.4% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Yağ asidi </td><td> Pozitif </td><td> 10-okzo-5 ,8-dekadienik asit </td><td> 1363284 </td><td> 2.3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 16-okso-heptadekanoik asit </td><td> 83700 </td><td&gt; 2.9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 2-metil valerik asit </td><td> 285782 </td><td> % 5.7 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Yağ asidi </td><td> Negatif </td><td> 10-hidroksi-8-oktadesenoik asit </td><td> 10042 </td><td> % 4.9 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> (R)-laballenic asit </td><td> 173929 </td><td> % 6.5 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 2-keto valerik asit </td><td> 35488 </td><td> % 6.0 </td></tr></tbody></table> Endojen metabolitlerden Tablo 2. Kalite kontrol sonuçları. Insan hastalık veri kümesinden Toplanmış plazma örnekleri ayrı günlerde örnek hazırlama tekrarlanabilirliği izlemek için analiz edilmiştir. Örnekler, üç gün boyunca üç kez hazırlandı (n = 9 prep QC enjeksiyon) tabi tutulmuştur.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis at JoVE.com

Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

Metabolomiks deneylerde sonuçların güvenilirliği numune hazırlama etkinliği ve yeniden üretilebilirlik bağlıdır. Daha sonra bileşikler bin kadar analiz, ya da ilgi sadece bileşik sınıfları seçeneği ile biyolojik sıvılardan metabolitlerin çıkarma sağlayan bir sıkı ve derinlemesine bir yöntem tarif edilmektedir.

Derinlemesine ve Bilgilendirici metabolomic Analizi Çoklu Metaboliti&#39;nin Bileşik Sınıfları Kurtar Multi-step Hazırlama Tekniği

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital ...

multi-step-preparation-technique-to-recover-multiple-metabolite

Research

JoVE Journal

Bioengineering

32.2K Görüntüleme.  National Jewish Health.  Metabolomiks deneylerde sonuçların güvenilirliği numune hazırlama etkinliği ve yeniden üretilebilirlik bağlıdır. Daha sonra bileşikler bin kadar analiz, ya da ilgi sadece bileşik sınıfları seçeneği ile biyolojik sıvılardan metabolitlerin çıkarma sağlayan bir sıkı ve derinlemesine bir yöntem tarif edilmektedir. 

Video: Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Bıçak kenar Tarama Mikroskopi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Biyomühendislik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Altın nanorods İçeren Hücresel Araçların Hazırlama ve foto akustik Analizi

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant adhesion strength than commercial tissue adhesives. Medical adhesives have attracted great attention as potential alternative tools to sutures and staples due to their convenience in usage with minimal invasiveness. Although there are several protocols for developing tissue adhesives including those commercially available such as fibrin glues and cyanoacrylate-based materials, mostly they require a series of chemical syntheses of organic molecules, or complicated protein-purification methods, in the case of bio-driven materials (i.e., fibrin glue). Also, the development of surgical glues exhibiting high adhesive properties while maintaining biodegradability is still a challenge due to difficulties in achieving good performance in the wet environment of the body. We illustrate a new method to prepare a medical glue, known as TAPE, by the weight-based separation of a water-immiscible supramolecular aggregate formed after a physical mixing of a plant-derived, wet-resistant adhesive molecule,&#160;Tannic Acid (TA), and a well-known biopolymer, Poly(Ethylene) glycol (PEG). With our approach, TAPE shows high adhesion strength, which is 2.5-fold more than commercial fibrin glue in the presence of water. Furthermore, TAPE is biodegradable in physiological conditions and can be used as a potent hemostatic glue against tissue bleeding. We expect the widespread use of TAPE in a variety of medical settings and drug delivery applications, such as polymers for muco-adhesion, drug depots, and others.

We describe the simplest protocol to prepare biodegradable medical glue that has an effective hemostatic ability. TAPE is a water-immiscible supramolecular aggregate prepared by mixing of tannic acid, a ubiquitous compound found in plants, and poly(ethylene) glycol, yielding a 2.5 times greater water-resistant adhesion compared with commercial fibrin glue.

BANT: Cerrahi Uygulama için Bitkilerde bir Ubiquitous Bileşik esinlenerek bir Biyobozunur Hemostatik Tutkal

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Çoklu Renkler Yüksek hızında Yapısal Aydınlatma TIRF Mikroskopi A Guide

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Ventilli Katmanlı mikroakışkan Cihazlar için çok adımlı Değişken Yükseklik Fotolitografi

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...