Yazarlar kütle kalibrasyon ve veri işleme değerli tartışmalar için Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) ve Nathaniel Snyder (Pennsylvania Üniversitesi) kabul etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen Araştırma Ödülü sayısı R00CA168997 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1.. LC-MS Kimyasalları, bir Kromatografi Yöntemi Kuruluş hazırlanması ve Enstrüman Çalışma Usul kurulması <ol><li> LC Solventler hazırlanması <ol><li> 500 ml mobil faz hazırlayın. Bir 20 mM amonyum asetat ve% 3 oranında asetonitril / su içinde 15 mM amonyum hidroksit, son pH, 9.0; ve B 100% asetonitrildir. </li><li> Gevşek, şişe kapağı bir su banyosu sonikatörde yerleştirin ve ekstra ısıtma olmadan 10 dakika boyunca sonikasyon. (Bu adım, amonyum tuzları, tüm tam olarak çözünmesi ve herhangi bir artık hava kabarcıkları olduğu sağlamaktır.) </li><li> LC-MS kullanım için bir 250 ml cam şişe için bir çözücü, ve 4 ° C &#39;de kalan tutmak transferi 250 mi </li></ol></li><li> Düşük kütle aralığı kalibrasyon çözeltisi hazırlayın. O doğru kütleleri düşük molekül ağırlıklarında tespit sağlamak için metabolomiks uygulamalar için özelleştirilmiş bir düşük kütle aralığı kalibrasyon karışımının kullanılması önemlidir. <ol><li> Sodi hem de, 5 mg tartılırum fluoroasetat ve homovanillic asit ve 1 mg / ml &#39;lik bir son konsantrasyon sağlamak için 5 ml su içine çözülür. 10 mg / ml &#39;lik bir son konsantrasyon sağlamak için, metanol içinde diazinon çözülür. </li><li> Negatif düşük kütle kalibrasyonu çözeltisi 1 ml hazırlamak için, sodyum fluoroaceate ve homovanillic asit solüsyonu, 20 ml termo negatif kalibrasyon çözeltisi 960 ml karıştırın. Pozitif düşük kütle kalibrasyonu çözeltisi 1 ml yapmak için, ısı ayarlama pozitif çözeltisi 990 ml ve 10 mi diazinon çözelti karıştırın. (Düşük kütle kalibrasyonu solüsyon 4 ° C &#39;de muhafaza edilmelidir ve her 2 ayda bir taze olarak hazırlanmalıdır.) </li></ol></li><li> Düşük Kütle Aralığı QE-MS Kalibrasyon <ol><li> Düşük kütle aralığı kalibrasyonu yapmadan önce, üreticinin talimatlarına göre olumlu ve olumsuz modlarında standart bir kitle kalibrasyon (m / z, 150-2,000) yürütmek. </li><li> Düzenli bir kitle kalibrasyon geçtiğinde, gösterge kontrol panelindeki 60-900 m / z tarama aralığını ayarlamakve pozitif ve negatif mod modu için 35 eV 25 eV kaynağı CID uygulanır. (Bu kafein fragmanı iyon ve sülfat iyonu güçlü sinyaller verecektir. Burada tarama aralığı sabittir, son m / z başlangıç ​​m / z 15x daha büyük olmamalı, çünkü) </li><li> Iyon kaynağı stabil olduktan sonra özel kalibrasyonu gerçekleştirin. Not: Stabil bir kaynak pozitif modda toplam iyon akımı varyasyonun% 10&#39;dan daha az olarak tanımlanır ve negatif modda en az% 15 olduğu. Özel kalibrasyon iyonları ve karşılık gelen m / z Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. </li></ol></li><li> Polar metabolit analizi için LC-MS aletleri kurulması. LC metabolit ayrılması ve keşfi için bir QE-MS kuple edilir. <ol><li> Isıtmalı elektrosprey iyonizasyon probu (H-ESI) ile QE-MS donatın. Listelenen prob için ilgili ayar parametrelerini ayarlayın: Isıtıcı sıcaklığı, 120 ° C; kılıf gaz, 30; Yardımcı gaz, 10; Doğal gaz, 3 süpürme; gerilimi, 3.6 kV spreypozitif mod ve negatif mod için 2.5 kV. 55 ° C&#39;de 320 ° C&#39;de kılcal sıcaklık ve S-lens ayarlayın. </li><li> Tam tarama aralığı: aşağıdaki gibi tam bir tarama yöntemi oluşturmak 60-900 (m / z); çözünürlük: 70.000; maksimum enjeksiyon süresi: 50 ms civarında tipik enjeksiyon süreleri ile 200 msn; otomatik kazanç kontrol (AGC): 3,000,000 iyonları. Bu ayarlar hem pozitif hem negatif modda taramaları yürütmek için yaklaşık 550 msn bir görev döngüsü sonuçlanır. </li><li> Kromatografi yöntemi kurmak. Oda sıcaklığında 13,15, bileşik ayrılması için bir sütun amid (100 x 2.1 mm id, 3.5 mm) kullanır. Yukarıda tarif edildiği gibi, mobil faz A ve mobil faz B asetonitrildir. Aşağıdaki gibi lineer bir miktar kullanın: 0 dak,% 85 B; 1.5 dakika,% 85 B, 5.5 dakika,% 35 B; 10 dakika,% 35 B, 10.5 min,% 35 B, 14.5 dak,% 35 B, 15 dakika,% 85 B, 20 dakika,% 85 B Akış hızı 0.15 ml / dk 0-10 dakika ve 15&#39;tir 20 dakika ve 10.5 &#39;den 14.5 dakika, 0.3 ml / dk.&#39; </li></ol></li></ol> 2. Prmetabolit Numune Ayırma <ol><li> Bir ekstraksiyon solventini hazırlayın. 50 ml&#39;lik bir tüp içinde 40 ml metanol (LC-MS sınıf) ve 10 ml su (LC-MS grade) karıştırılmakta ve kullanılmadan önce en az 1 saat boyunca -80 ° C dondurucuda tutun. Not: Bu prosedür ve aşağıdaki adımları biyolojik doku ve sıvı numunelerin çıkarılması için modifiye edilebilir. <ol><li> Tam büyüme ortamı ile üç adet 10 cm tabaklar veya 6 oyuklu plakalar içinde kültür kolon kanseri HCT 8 hücreleri, RPMI 1640,% 10 ısı inaktifleştirilmiş Fetal Sığır Serumu ve 100,000 ünite / L penisilin ve 100 mg / L streptomisin ile takviye edilmiştir. </li><li> Hücreler% 80 izdiham ulaştığınızda, hızla orta kaldırmak ve kuru buz 13,15 üstüne yemek ya da plaka koyun. Hemen (% 80 metanol / su) çözücü 1 ml ekstraksiyon ekleyin ve -80 ° C dondurucu plaka transfer. , 10 cm tabak için, her bir göze bir ekstraksiyon çözücüsü 3 ml ekleyin. (Ortam, bakiye tuzları nedeniyle iyon bastırma etkisini önlemek için mümkün olduğu kadar ortadan kaldırmak için deneyin.)</li><li> 15 dakika boyunca plaka bırakın. Dondurucu çıkarın ve kuru buz üzerinde çözücü içine hücreleri kazıyın. 1.7 ml Eppendorf tüplerine transfer çözeltisi ve 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 20,000 x g hızında santrifüj ile. (Üç suret örnekleri yapmak için üç ayrı yemekler hücre metabolitleri hazırlayın. Iki tüp tutmanın amacı, bir yedek olarak bir tane olduğunu.) </li><li> Iki yeni Eppendorf tüplerine süpernatant aktarın ve bir hızlı vakum içinde kurutun. Bu, kullanılan hızlı vakum bağlı olarak yaklaşık 3-6 saat sürer. (Numuneler, aynı zamanda, azot gazı altında gece boyunca kurutulabilir.) </li><li> -80 ° C derin dondurucuda her numunenin kurutulması, mağaza tüpler sonra. Hazır olduğunda, 20 ml su (LC-MS grade) içine bir örnek tekrar oluşturmak ve analiz için LC-MS QE-5 ml enjekte edilir. </li></ol></li></ol> Örnek 3. Sekans. Setup <ol><li> Kalibrasyon düzgün QE-MS üzerinde gerçekleştirilmiştir sonra, bir akışta% 85 A&#39;ya, 5 dakika boyunca LC kolon dengeLC gradyanın başlangıç ​​durumdur, 0.15 ml / dakika, oranı. </li><li> Rastgele sırayla örnek sırasını ayarlayın. Not: Bu şekilde, her bir örnek için LC-MS ile tanıtılan dalgalanmaları dağıtır ve farklı numuneler arasında, daha doğru karşılaştırma sağlar. LC gradyan, 10 dakika boyunca% 95 A ve 0.15 ml / dk &#39;lık bir akış oranı ile% 85 A&#39; da, 5 dakika kolon dengeleme izledi hariç her 6 numuneleri, aynı MS yöntemi paylaşan bir yıkama çalışma, ekleyin. Sistem arka plan değerlendirmek ve seviyeleri üzerinde taşımak için her yıkama çalıştırdıktan sonra boş örnekleri (100% su) ekleyin. </li><li> Dizisini kaydedin ve LC sütun 400 psi civarında istikrarlı basıncını gösterir zamanlar, dizi çalışma başlatmak. Başka bir örnek, bu dizinin sonra çalıştırmak için orada ise bitirdikten sonra, daha sonra gradyan sonunda 0 ml / dk &#39;lık bir akış hızı olan sekansı sonunda bir durdurma çalıştırmak ekleyin ve &quot;bekleme&quot; tercih sırası. </li><li> Yeniden çalıştırmak aynı örnek kalibrasyon sonrasında 12 saat ayarlayın. (Bu ikalibrasyon sonrasında kitle hata dalgalanmayı değerlendirmek için s.) </li></ol> 4. Mesaj Analizi Enstrüman Temizleme ve Bakım <ol><li> Dizinin sonunda, 0.2 saat boyunca 2 ml / dak &#39;lık bir akış hızında% 95 A ile sütun yıkama ve gerekirse, yıkamadan önce sütun ters. </li><li> LC sütun çıkarın ve doğrudan bir sendika tarafından iyon kaynağına LC bağlayın. Solvent, su / metanol / formik asit temizleme hazırlayın (v: v: v, 90:10:0.2) bekleme modunda MS ayarlamak, ve 0.1 &#39;lik bir akış oranında yıkama LC-MS sistemi ml / dakika, 1 saat boyunca kaldırmak için kalıntı tuzlar ya da diğer yabancı maddeler çökeltilir. Çok fazla sistem basıncı yoksa akış hızını düşürün. </li><li> 50 ° C&#39;de kılcal sıcaklık ayarlama ve iyon kafes çıkarın. Kılcal sıcaklığı 50 ° C&#39;ye düşer sonra dikkatlice iyon süpürme koni ve iyon transferi tüpü çıkarmak Iyon tarama koninin yüzey üzerinde kalan kirleri çıkarmak için, bu tür zımpara gibi kaba bir örgü kullanın. </li><li> Iyon transferi yerleştirin% 0.1 &#39;lik formik asit ile 10 ml% 90 su / metanol ihtiva eden bir 15 ml Falcon tüpü içine tüpü. 20 dakika boyunca bir su banyo sonikatörü içinde sonike tüp sonra, içindeki solvent dekante 10 mi saf metanol ile değiştirin ve 20 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır. (Gerekirse, sonication, 40 ° C ya da daha iyi temizleme sonuçları elde etmek için daha yüksek bir sıcaklıkta yapılabilir.) </li></ol> LC-MS verileri, 5. Analizi <ol><li> Örnek sırasını sağlamak için sırayla ilk iki örnekleri bittikten sonra, bilinmeyen metabolitleri için zirveleri onay, sorunsuz çalışır. Metaboliti isimleri, nötr kimyasal formülü ve algılama modu (pozitif veya negatif), girdi dosyası olarak ve çıktı dosya ayıklanır zirveleri ve ppm kitle hatayı içeren listeleyen bir csv dosyası kullanın. Tepe şekli anormal veya kitle hata fazla 5 ppm kapalıysa, daha sonra dizinin geri kalanı durdurulmuş ve sorun yapılması gereken edilmesi gerekmektedir. </li><li> &quot;Pik hizalama yöntemini seçinve ticari olarak mevcut yazılım üzerinde kare çıkarma &quot;. LC-MS ve grup onlardan ham verileri seçin. Tepe hizalama için kromatografi referans örnek olarak çalıştırmak sekansının ortasında örnekleri almak. Toplanan veriler ile hedeflenen metabolitler analizi ve karşılık gelen çerçeve tohum için bilinen metabolitler içeren bir çerçeve tohum yükleyin. </li><li> Ayrı ayrı pozitif ve negatif modunda veri analizi yapın. Diğer parametreler için varsayılan ayarı kullanın. Veritabanı arama fonksiyonunu kapatın ve iş akışını çalıştırın. Her çerçevenin pik alanı içeren bir excel levha olarak işlenmiş verileri. Çerçeveleri ilk set hedeflenen listesindeki metabolitlere karşılık gelirler. Not: bir hedef metabolit analizi için, metabolitler bilgi önceki çalışmalarda 13,15 göre elde edilir. </li><li> An hedefsiz metabolit analizi için, &quot;bileşen çıkarma&quot; yöntemini seçin. Arka plan çıkarma için boş örnekleri yükleyin. Set tepe yoğunluğu eşikt 10 5, 3 gürültü oranı 10 ppm ve sinyal m / z genişliği. </li><li> Bilinmeyen bileşikler tanımlanması için insan metabolome veritabanı kullan. Tekrar örnekleri içinde büyük özgeçmişleri ile bileşenleri kaldırmak için bir CV filtresi kullanın. El ile her bileşen geçmesi ve iyi tanımlanmış zirve veya veritabanı arama için farklı örnekler türleri nispeten büyük farkı bu almak. Veritabanında hit ile İhracat verileri. (Tepe hizalama puanı çok düşük ise Tepe hizalama bypass olabilir.) </li></ol>

<ol>
	<li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genomics,+metabolome+analysis,+and+biochemical+modelling+to+understand+metabolic+networks.">Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks.</a> Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).</li><li>Mulleder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prototrophic+deletion+mutant+collection+for+yeast+metabolomics+and+systems+biology.">A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology.</a> Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).</li><li>Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircadiOmics:+Integrating+circadian+genomics,+transcriptomics,+proteomics+and+metabolomics.">CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics.</a> Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).</li><li>Ideker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+and+proteomic+analyses+of+a+systematically+perturbed+metabolic+network.">Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network.</a> Science. 292 (5518), 929-934 (2001).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+identifying+differences+in+large+series+of+metabolomic+samples+analyzed+by+GC/MS.">A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.</a> Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+data+analysis+for+detecting+and+identifying+differences+between+samples+in+GC/MS-based+metabolomic+analyses.">High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).</li><li>Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+profiling:+Quantitative+analysis+of+1H+NMR+metabolomics+data.">Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).</li><li>Wiklund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+GC/TOF-MS-based+metabolomics+data+for+identification+of+biochemically+interesting+compounds+using+OPLS+class+models.">Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).</li><li>Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboMiner--semi-automated+identification+of+metabolites+from+2D+NMR+spectra+of+complex+biofluids.">MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids.</a> BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+NMR+isotopomer+analysis+reveals+a+connection+between+pyruvate+cycling+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+(GSIS).">13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+rate+of+the+glutamate/glutamine+cycle+in+the+human+brain+b.+in+vivo+13C+NMR.">Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).</li><li>Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+quantitative+biomarker+analysis+in+proteomics+and+metabolomics.">Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).</li><li>Locasale, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+human+cerebrospinal+fluid+identifies+signatures+of+malignant+glioma.">Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).</li><li>Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+robust+quantitative+proteomic+analysis+of+cellular+signaling+networks.">Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).</li><li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive/negative+ion-switching,+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids,+cells,+and+fresh+and+fixed+tissue.">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li><li>Ramanathan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+is+time+for+a+paradigm+shift+in+drug+discovery+bioanalysis:+From+SRM+to+HRMS.">It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS.</a> Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).</li><li>Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer.">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+(orbitrap+elite)+facilitates+top+down+LC+MS/MS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes.">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive,+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer.">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li><li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry.">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li><li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis:+Application+to+human+urine.">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması beyan ederim.

Bu protokol kullanılarak hücre başarılı metabolit profil için en önemli adımlar şunlardır: 1) büyütme ortamı ve hücreler dikkatli çıkarma kontrol edilmesi; 2) kantitatif bir tepe üzerinde yeterince (genellikle en az 10) veri noktaları vardır sağlamak için MS yöntemi kurulum dayalı LC yöntemini ayarlanması; 3) örnekleri çalıştırmadan önce düşük kütle kalibrasyonu yapıyor; 4) vites tutma süresini önlemek için en fazla 5 ml enjekte ve zirve genişletilmesi su neden; ve 5) toplu etkile...

Aynı anda birden fazla metabolitleri ölçen bir deney olarak tanımlanan Metabolomik, yoğun bir ilgi alanı olmuştur. Metabolomik moleküler fizyoloji doğrudan okunmasını sağlar ve kanser 1-4 gibi geliştirme ve hastalık halinde anlayışlar sağladı. Nükleer manyetik rezonans (NMR) ve gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS), en yaygın olarak kullanılan araçlar 5-9 arasındadır. NMR, özellikle 13 C etiketli metabolitleri gibi ağır izotop etiketli bileşikleri, tarihi akış deneyleri için kullanılmıştır, 10,11-NMR etkindir. Ancak, bu strateji metabolitler onun uygulamalarını sınırlar, nispeten yüksek saflık ve büyük örnek miktar gerektirir. Bu arada, NMR toplanan verilerin analizi yoğun ve karmaşık NMR spektrumları bileşik atama zordur gerekiyor. GC-MS çok polar metabolitleri ve lipid çalışmaları için kullanılmıştır, ama bu uçucu compoun gerektirirds ve bazen zaman alıcı olabilir karmaşık kimya içerir ve deneysel gürültü tanıttı metabolitleri bu nedenle sık sık türetme,. Üçüncü dört kutuplu karakteristik fragmanları veya kız iyonları seçmek için kullanılır ise üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi birleştirilmiş sıvı kromatografisi (LC), daha sonra ikinci bir dört kat olarak parçalanmış dokunulmamış ana iyonları, seçme için ilk kuadruple kullanır. Belirli bir kız iyonlarına ana iyonu geçişi kaydeder bu yöntem, çoklu reaksiyon takip işlemi (MRM) olarak adlandırılır. MRM küçük molekül ve protein kantitatif 12-15,21 hem de çok duyarlı, spesifik ve güçlü bir yöntemdir. Ancak, MRM sınırlamaları var. Yüksek özgüllük ulaşmak için MRM yöntemi, her metaboliti için inşa edilmesi gerekmektedir. Bu yöntem, özel bir fragmanının belirlenmesi ve prope ön bilgi gerektirir optimize çarpışma enerjisi, ilgili oluşmaktadırBu tür kimyasal yapı bilgileri gibi ilgilenilen metabolitleri, ve ilgili taraflar. Bu nedenle, ortak parçalarının nötr kaybı ile ilgili bazı özel durumlar dışında, bu yöntem ile bilinmeyen metabolitlerin tespit etmek mümkün değildir. Son yıllarda, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS) aletler gibi LTQ-Orbitrap ve Exactive serisi, QuanTof olarak yayımlanan ve TripleTOF 5600 16-18,22 edilmiştir. HRMS birkaç ppm bir hata payı içinde sağlam iyonları oranını (m / z) şarj etmek için bir kütle sağlayabilir. Bu nedenle, tüm ön-madde iyonları (tam tarama modu) tespit edilmesi ile işletilen bir araç HRMS tam kütlesi ve bir analit &#39;in elde edilen temel bileşiminin doğrudan yapısal bilgi elde edebilir ve bu bilgiler potansiyel metabolitleri tanımlamak için kullanılabilir. Gerçekten de, bir bileşik ile ilgili tüm bilgiler yapısal izomer seviyesine kadar, tam bir kütle ile elde edilebilir. Ayrıca, tam birTarama yöntemi metabolitleri önceki bilgi gerektirmez ve yöntem optimizasyonu gerektirmez. M / z tarama aralığı içine düşen tüm iyonları analiz edilebilir Dahası, HRMS MRM yöntemine göre tek vadede kantifiye edilebilir metabolitlerin sayısı açısından neredeyse sınırsız bir kapasiteye sahiptir. HRMS nedeniyle tarama, tam MS elde edilebilir veri noktaları benzer bir dizi ile sonuçlanan kısa görev döngüsü için, aynı zamanda nicel kapasitede bir üçlü dört kutuplu MRM karşılaştırılabilir. Bu nedenle, HRMS kantitatif metabolitler için alternatif bir yaklaşım sağlar. Son zamanlarda, HRMS geliştirilmiş bir versiyonu (QE-MS) algılama mesafesi 19 genişleten tek bir yöntemle, yeterince hızlı döngü süreleri ile pozitif ve negatif modları arasında geçiş altında ameliyat edilebilir Q-Exactive kütle spektrometresi olarak adlandırılır. Burada QE-MS kullanılarak bizim metabolomiks stratejisini açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Ancak, mevcut platformlar gibi emek yoğun numune hazırlama, düşük tespit limitleri, yavaş tarama hızları, her bir metaboliti için yoğun metot optimizasyonu ve olumlu hem ölçmek için yetersizlik ve tek deneylerde negatif yüklü iyonlar gibi farklı sınırlayıcı faktörler var. Bu nedenle, yeni bir metabolomiks protokol metabolomiks çalışmaları ilerlemek olabilir. Amid bazlı hidrofilik kromatografi kimyasal türetme olmaksızın polar metabolit analizi sağlar. Q-Exactive (QE-MS) kullanılarak yüksek çözünürlüklü MS, iyon optik geliştirilmiş tarama hızlarını (çözünürlükte 70,000 256 msn) artmış, ve pozitif / negatif anahtarlama yürüten yeteneğine sahiptir. Soğuk metanol ekstre strateji kullanarak, ve QE-MS ile bir amid sütun bağlanması aynı anda ek özellikler 168 hedef polar metabolitleri ve binlerce sağlam algılanmasını sağlar. Datbir işleme, yüksek verimli bir şekilde ticari olarak temin edilebilen yazılımı ile gerçekleştirilir, ve kütle spektrumları elde edilen bilinmeyen özellikleri veritabanlarında sorgulanabilir.

Metabolomiks verilerin doğruluğu son derece LC-QE-MS cihazı performansına bağlıdır. Gösterge iyi durumda olup olmadığını değerlendirmek için, ve Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi uygulanan yöntem uygun olup olmadığı, bilinen birkaç metabolit LC zirveleri, toplam iyon kromatografisiyle (TIC) elde edilir. Amino asitler de dahil olmak üzere Polar metabolitler, ara maddeleri, glikoliz , TCA ara maddeleri, nükleotitler, vitaminler, böylece ATP, NADP + ve mevcut LC koşulla...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics at JoVE.com

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

a-strategy-for-sensitive-large-scale-quantitative-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Görüntüleme.  Cornell University.  Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar. 

Video: A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Biyoloji

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Tüm Maymun Beyin Büyük Ölçekli Protein Algılama için Toplu immün

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Büyük ölçekli SNP Genotiplendirme Uygulamaları için infinium Tahlili

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Büyük Ölçekli Epigenetik Çalışmalar için Yarı Otomatik ChIP-Seq Prosedürü

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. Exosomes for clinical application require large-scale production. To this aim, human synovial fluid MSCs (hSF-MSCs) were grown on microcarrier beads, and then cultured in a dynamic three-dimension (3D) culture system. Through utilizing 3D dynamic culture, this protocol successfully obtained large-scale exosomes from SF-MSC culture supernatants. Exosomes were harvested by ultracentrifugation and verified by a transmission electron microscope, nanoparticle transmission assay, and western blotting. Also, the microbiological safety of exosomes was detected. Results of exosome detection suggest that this approach can produce a large number of good manufacturing practices (GMP)-grade exosomes. These exosomes could be utilized in exosome biology research and clinical osteoarthritis treatment.

Here, we present a protocol to produce a large number of GMP-grade exosomes from synovial fluid mesenchymal stem cells using a 3D bioreactor.

Sinovyal Sıvı Mezenkimal Kök Hücre Kaynaklı Eksozomların 3D Biyoreaktör Kültürü ile Büyük Ölçekli Hazırlanması

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale quantitative phenotypic measurements from cells. This approach has proved powerful for deepening our understanding of a wide range of both fundamental and applied events in cell biology. To date, the majority of applications for this technology have relied on the use of cells grown in monolayers, although it is increasingly realized that such models do not recapitulate many of the interactions and processes that occur in tissues. As such, there has been an emergence in the development and use of 3-dimensional (3D) cell assemblies, such as spheroids and organoids. Although these 3D models are particularly powerful in the context of cancer biology and drug delivery studies, their production and analysis in a reproducible manner suitable for HCS and HCA present a number of challenges. The protocol detailed here describes a method for the generation of multicellular tumor spheroids (MCTS), and demonstrates that it can be applied to three different cell lines in a manner that is compatible with HCS and HCA. The method facilitates the production of several hundred spheroids per well, providing the specific advantage that when used in a screening regime, data can be obtained from several hundred structures per well, all treated in an identical manner. Examples are also provided, which detail how to process the spheroids for high-resolution fluorescence imaging and how HCA can extract quantitative features at both the spheroid level as well as from individual cells within each spheroid. This protocol could easily be applied to answer a wide range of important questions in cell biology.

This protocol details a method for the production of three different types of spheroids in a manner that makes them suitable for large-scale high-content screening and analysis. In addition, examples are presented showing how they can be analyzed at spheroid and individual cell levels.