Bu çalışma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Hibe HL 103542, ve CAP için BCH Anestezi Araştırma Vakfı&#39;nın Değerli Malibu Ödülü ile desteklenmiştir.

Hazırlık <ol><li> 1 M K-HEPES stok çözeltisi (KOH ile pH 7.2 ayarlayın) hazırlayın. </li><li> , 0.5 M EGTA K stok çözeltisi (KOH ile 8.0 pH ayarlayın) hazırlayın. </li><li> 1 M KH 2 PO 4 stok çözelti hazırlayın. </li><li> , 1 M MgCl2 stok çözelti hazırlayın. </li><li> Homojenizasyon tampon maddesi (pH 7.2), 300 mM sakaroz, 10 mM K-Hepes ve 1 mM EGTA K hazırlayın. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Solunum Tampon 250 mM sakaroz, hazırlama 2 mM KH 2 PO 4, 10 mM MgCI2, 20 mM K-HEPES tamponu (pH 7.2) ve 0.5 mM K-EGTA (pH 8.0). 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> NaCl 80 g, KCl 2 g Na 2 HPO 4, 14.4 g ve 1 L&#39;lik iki kez damıtılmış H2O (pH 7.4), KH 2 PO 4 2.4 g eritilmesi ile 10x, PBS stok çözelti hazırlayın. </li><li> 1 L çift distile H 2 O içine 100 ml 10x PBS pipetleyerek 1x PBS hazırlayın </li><li> Subtilisin A 4 mg dışarı ağırlığında tarafından Subtilisin bir Stok hazırlayın1.5 ml mikrofüj tüpüne. Kullanılana kadar -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 1.5 ml mikrofüj tüpüne BSA 20 mg tartılarak BSA Stok hazırlayın. Kullanılana kadar -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> Mitokondriyal İzolasyon (Şekil 1) <ol><li> Izolasyon hemen önce, homojenizasyon tampon maddesi içinde 1 ml subtilisin A çözülür. </li><li> Izolasyon hemen önce, homojenizasyon tampon maddesi içinde 1 ml BSA çözülür. </li><li> Buz üzerinde bir 50 ml konik santrifüj tüpüne 1x PBS içinde 6 mm biyopsi örneği yumruk ve mağaza kullanarak iki taze doku örneklerini toplar. </li><li> Homojenleştirme tamponu buz gibi soğuk 5 ml ihtiva eden bir ayırma tüpüne C dokusunun iki adet 6 mm delikler aktarın. </li><li> Doku dissociator üzerindeki ayrışma C tüpü takarak doku homojenize ve önceden ayarlanmış mitokondriyal izolasyon döngüsü (60 sn homojenizasyon) seçin. </li><li> Bir buz kovası ayrışma C tüpü çıkarın. </li><li> Subtilisin için bir stok çözeltisi 250 ulHomojenat, çevirerek karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe Homojenat. </li><li> Homojenleştirme Tamponu ile buz ve önceden nemli filtre üzerinde bir 50 mL konik santrifüj tüpü üzerine 40 mikron gözenekli bir filtre yerleştirilmesi ve buz üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpüne Homojenat filtre. </li><li> Filtrata taze hazırlanmış BSA Stok Çözüm 250 ul ekleyin ve çevirerek karıştırın. Not: mitokondriyal protein tayini gerekli ise, bu adımı atlayın. </li><li> Homojenleştirme Tamponu ile buz ve önceden nemli filtre üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpü üzerine bir 40 mikron filtre yerleştirin ve buz üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpüne Homojenat filtre. </li><li> Homojenleştirme Tamponu ile buz ve önceden nemli filtre üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpü üzerine bir 10 mikron filtre yerleştirin ve buz üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpüne Homojenat filtre. </li><li> 10 dk boyunca 9000 x g&#39;de iki önceden soğutulmuş 1.5 ml mikrofüj tüplerine ve santrifüj filtrat aktarın4 ºC. </li><li> Süpernatantı ve yeniden askıya ve buz soğuk Solunum Tampon 1 ml pelet birleştirir. </li></ol> ATP Deneyi Not: bir ATP parlaklık deney ATP deney kiti kullanılarak gerçekleştirilebilir izole mitokondri metabolik aktivitesini belirlemek. Protokol, reaktifler ve standartlar deney kiti içinde temin edilmiştir. Yöntemin özeti, aşağıda tarif edilmiştir. <ol><li> Oda sıcaklığına kiti reaktifler dengelenmesi. </li><li> Çifte damıtılmış su, 1.170 ul ATP liyofilize pelet eritilmesi ile, 10 mM ATP stok çözelti hazırlayın. ATP buz üzerinde standart Stok Çözüm ve hazırlanan mitokondriyal örnekleri saklamak. </li><li> Liyofilize edilmiş alt-tabaka çözeltisinin bir şişeye Yüzey Tampon çözelti 5 ml. İyice karıştırın ve karanlıkta yerleştirin. </li><li> Siyah, ışık geçirmeyen alt, 96 gözlü bir levhanın tüm oyuklara Solunum tampon 100 ul ilave edin. </li><li> Her hazırlanmış örneklerinden o iyi mitokondri 10 ul eklefa Siyah, ışık geçirmeyen alt, 96 çukurlu levha. Not: Numuneler üç kopya halinde plakalanır. Standartları ve negatif kontrol (Solunum Tampon) için üç kuyu için bir satır içerir. </li><li> Standartlar ve kontroller de dahil olmak üzere, tüm oyuklara memeli hücre lizis çözeltisinin 50 ul ekle. </li><li> 125 rpm&#39;de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyon sırasında, 10 mM ATP stok çözeltisinden 0.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM, 0.005 mM, 0.001 mM ve 0.0001 mM ATP konsantrasyonlarda ATP standartlar hazırlandı. Buz üzerinde saklayın standartları. </li><li> İnkübasyondan sonra, plaka haritada gösterildiği gibi karşılık gelen kuyu ATP standartların 10 ul ekle. Not: standartlar iki kopya halinde gerçekleştirilir. </li><li> Her bir oyuğa substrat çözeltisinin sulandırılmış 50 ul ekle. </li><li> 125 rpm&#39;de 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Spektrofotometre ile bağlantılı bir bilgisayarda açık Gen5 1.11 yazılımı. </li><li> &quot;AltındaYeni Öğe Oluştur Experiment &quot;&quot;, &quot;tıklayın. </li><li> &quot;Varsayılan Protokolü&quot; üzerine tıklayın. &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> Sol sütunda, daha sonra, &quot;Prosedür&quot; &quot;Protocol&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Gecikme&quot; seçeneğini seçin. 00:10:00 ayarlayın. &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> Seç &quot;Oku&quot;. Açılan menüden gelen &quot;Lüminesans&quot; seçeneğini seçin. Aşağıdaki diğer ayarları yapın: tipi Endpoint, Entegrasyon Zaman 0 okuyun: 01.00 MM: SS.ss, Filtre 1 Takımları, Emisyon Hole, Optik Pozisyonu Top, Hassasiyet 100, En Sonda Dikey 1.00 mm Ofset. </li><li> Plaka analiz hazır olduğunda, üst satırda &quot;Plakasını oku&quot; simgesini tıklatın. &quot;Oku&quot; tıklayın. Spektrofotometre açıldığında, sol üst köşede de A1 ile tepsiye tabak yerleştirin. Sıcaklığına sahip bir kutu açılacaktır. &quot;Oku&quot; tıklayın. Not: Daha yüksek değerler artmış ATP seviyeleri ve daha yüksek metabolik aktivite ile ilişkilidir. </li></ol>

<ol>
	<li>van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+factors+in+apoptosis:+a+Russian+roulette+with+more+than+one+bullet.">The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet.</a> Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+hub+of+cellular+Ca2++signaling.">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).</li><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+Dynamic+Organelles+in+Disease,+Aging,+and+Development.">Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development.</a> Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+Isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods.</a> PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Bensley, R. R., Hoerr, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+cell+structure+by+freeze-drying+method;+preparation+and+properties+of+mitochondria.">Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria.</a> Anat Rec. 60, 449-455 (1934).</li><li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation+II.+Experimental+procedures+and+results.">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li><li>Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li><li>Ernster, L., Schtaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+a+historical+Review.">Mitochondria: a historical Review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies.">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).</li><li>Fern&#225;ndez-Vizarra, E., Ferr&#237;n, G., P&#233;rez-Martos, A., Fern&#225;ndez-Silva, P., Zeviani, M., Enr&#237;quez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li><li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3.3,+Isolation+of+mitochondria+from+tissues+and+cells+by+differential+centrifugation.">Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2001).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Gostimskaya, I., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+highly+coupled+rat+heart+mitochondria.">Preparation of highly coupled rat heart mitochondria.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Masuzawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+autologously+derived+mitochondria+protects+the+heart+from+ischemia-reperfusion+injury.">Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).</li><li>McCully, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+isolated+mitochondria+during+early+reperfusion+for+cardioprotection.">Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).</li><li>Olson, M. S., Von Korff, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+endogenous+substrates+of+isolated+rabbit+heart+mitochondria+during+storage.">Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage.</a> J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).</li><li>Diepart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+measuring+oxygen+consumption+in+tumor+cells+in+vitro.">Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro.</a> Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).</li><li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro.">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li></ol>

Tüm hayvanlar mevcut kurumsal kurallarına uygun olarak tedavi edildi. Biz ifşa rakip mali çıkarlarını hiçbir var.

Başarıyla mitokondriyal canlılığını korumak için buz üzerinde tüm çözümleri ve doku örnekleri tutmak için önemli olan bu protokolü kullanarak mitokondri izole etmek için. Buz üzerinde muhafaza bile, izole mitokondri zaman 19 vasıtasıyla işlevsel aktivitesinde bir azalma sergiler. Hepimiz çözümleri ve eklemeler önceden hazırlanmış öneririz. Biz önceden tartılır ve 1.5 ml mikrofüj tüpler 4 mg parçalar halinde saklayın ve subtilisin A -20 ° C&#39;de saklayın. Benzer şekild...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51682">Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.</a> An optional step was added to step 7 of the &#39;Mitochondrial Isolation&#39; section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.

Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Mitokondri kırmızı kan hücreleri hariç, vücuttaki her hücrede mevcuttur ve önemli hücresel ve metabolik süreçleri 1-4 arasında bir sayıda katılmaktadırlar. Çünkü bu birçok fonksiyonun, mitokondriyal hasar zararlı etkileri 3 olabilir. Mitokondriyal fonksiyon ve disfonksiyonu birkaç mitokondriyal izolasyon yöntemleri araştırmak amacıyla tarif edilmiştir. 1940&#39;larda 5-8 mitokondriyal izolasyon tarihten erken yayınlanmış hesaplar. Ilk belgelenmiş girişim düşük hızda 5,8 bir tuz çözeltisi içinde ve ardından merkezkaçlama uygulanarak, bir havan içinde karaciğer doku öğüterek mitokondriyal izolasyonu gösterdi. Daha sonra, diğer gruplar orijinal prosedürü üzerine genişletilmiş ve diferansiyel santrifüj 6-8 dayalı doku ayrımlaştığını gösterdi. Bu ilk yöntemlerin sık sık homojenizasyon ve / veya diferansiyel santrifüj 9-15 dahil güncel tekniklerin temelini oluşturmuştur. Homogenizati sayısıadımlar ve santrifüj protokolleri arasında değişir. Bu tekrarlı adımlar mitokondriyal izolasyon süresini artırmak ve sonuçta canlılığını azaltır. Düzgün 10,16 kontrollü değilse Ayrıca, manuel homojenizasyon mitokondriyal hasar ve tutarsız sonuçlara neden olabilir. Son zamanlarda, biz miyokard dokusu 17,18 içine nakli için mitokondri izole etmek için homojenizasyon ve diferansiyel santrifüj kullanılır. Bu izolasyon prosedürü, uzun, yaklaşık 90 dakika gerekli ve bu yöntemin klinik uygulanabilirliği dolayısıyla sınırlı kalmıştır. Klinik ve cerrahi tedavi akut terapötik kullanım için izin vermek için daha az bir süre, 30 dakika içinde yapılabilir hızlı bir mitokondriyal izolasyon işlemi geliştirdik. Bu protokolün büyük faydalar standart doku ayrışma üniforma ve kolayca manuel homojenizasyon ile elde edilmez doku tutarlı homojenizasyon için izin verdiğini vardır. Additiyon, diferansiyel santrifüj yerine diferansiyel filtrasyon kullanımı zaman alıcı ve son derece saflaştırılmış yaşayabilir ve solunum yetkili mitokondri daha hızlı izolasyonu için izin tekrarlayan santrifüj adımları ortadan kaldırır. 30 dakikadan az yaşayabilen ve solunum yetkili mitokondri izole yeteneği klinik uygulanabilirlik sağlar. Bu izolasyon protokol koroner arter bypass cerrahisi (KABG) ve diğer tedavi işlemlerinde kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Substilsin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5380</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P2173</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite Luminescence Assay System,&lt;br/&gt; 1,000 Assay Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>BD</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m Nylon Filters</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C tube</td><td>Miltenyl Biotech</td><td>120-005-331</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6 mm biopsy punch</td><td>Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;m Pluristrainer</td><td>Pluriselect</td><td>43-500-10-03</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5415C</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5415C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Dissociator&amp;nbsp;</td><td>Miltenyl Biotech</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, tissue culture treated</td><td>VWR</td><td>82050-732</td><td></td></tr><tr><td>Rotomax 120 orbital shaker</td><td>Heidolph</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Hybrid Multi-Mode&lt;br/&gt; &amp;nbsp;Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multisizer 4 Coulter Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63076</td><td></td></tr><tr><td>Oxytherm System</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration

Diferansiyel santrifüjleme ve / veya, Ficoll gradyan santrifüj kullanılarak daha önce anlatıldığı mitokondriyal izolasyon yöntemleri tamamlamak için 60-100 dakika gerektirir. Bir ticari doku Dissociator ve ayırıcı filtrasyon kullanılarak memeli biyopsilerinden mitokondri hızlı izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu protokol, el homojenleştirme doku ayrıştırıcı, en standart homojenizasyon döngüsü ile değiştirilir. Bu düzgün ve kolay bir manuel homojenizasyon ile elde edilemez doku tutarlı bir homojenizasyon işleminin uygulanmasına izin verir. Doku ayrışma sonra, homojenat tekrarlanan santrifüj adımları ortadan naylon örgü filtreler aracılığıyla filtre edilir. Bunun bir sonucu olarak, yalıtım mitokondriyal az 30 dk içinde gerçekleştirilebilir. Bu izolasyon protokol 0.18 ± 0.04 g (ıslak ağırlık) ya da doku numunesinden yaklaşık 2 10 x 10 uygulanabilir ve solunum yetkili mitokondri verir.

Doku Ayrışma ve diferansiyel filtrasyon kullanılarak mitokondri izolasyonu ile işlem adımları özetleyen bir şekil, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Toplam işlem süresi 30 dakikadan daha azdır. Doku örnekleri 6 mm biyopsi zımbası kullanılarak elde edilmiştir. Doku ağırlığı 0.18 ± 0.04 g (ıslak ağırlık). Parçacık boyutu sayımı ile belirlenmiştir olarak izole mitokondri sayısı 2.4 oldu 10 x 10 x 10 ± 0.1, iskelet kası boyunca <sup...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration at JoVE.com

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Memeli Doku biyopsilerinden mitokondri hızlı izole edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Sıçan karaciğer, iskelet kası ya da preparat, ticari ayrıştırıcı doku homojenize edildi ve mitokondri naylon gözenekli filtrelerden geçerek, süzme ile izole edilmiştir. Seçenek yöntemler kullanılarak da 100 dakika - Mitokondriyal izolasyon süresi 60 kıyasla &lt;30 dk.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

rapid-isolation-purification-mitochondria-for-transplantation-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

38.0K Görüntüleme.  Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School.  Memeli Doku biyopsilerinden mitokondri hızlı izole edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Sıçan karaciğer, iskelet kası ya da preparat, ticari ayrıştırıcı doku homojenize edildi ve mitokondri naylon gözenekli filtrelerden geçerek, süzme ile izole edilmiştir. Seçenek yöntemler kullanılarak da 100 dakika - Mitokondriyal izolasyon süresi 60 kıyasla 

Video: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative phosphorylation complexes encoded by the mitochondrial genome. Since all proteins synthesized by human mitoribosomes are integral membrane proteins, human mitoribosomes are tethered to the mitochondrial inner membrane during translation. Compared to the cytosolic ribosome the mitoribosome has a sedimentation coefficient of 55S, half the rRNA content, no 5S rRNA and 36 additional proteins. Therefore, a higher protein-to-RNA ratio and an atypical structure make the human mitoribosome substantially distinct from its cytosolic counterpart.
Despite the central importance of the mitoribosome to life, no protocols were available to purify the intact complex from human cell lines. Traditionally, mitoribosomes were isolated from mitochondria-rich animal tissues that required kilograms of starting material. We reasoned that mitochondria in dividing HEK293-derived human cells grown in nutrient-rich expression medium would have an active mitochondrial translation, and, therefore, could be a suitable source of material for the structural and biochemical studies of the mitoribosome. To investigate its structure, we developed a protocol for large-scale purification of intact mitoribosomes from HEK cells. Herein, we introduce nitrogen cavitation method as a faster, less labor-intensive and more efficient alternative to traditional mechanical shear-based methods for cell lysis. This resulted in preparations of the mitoribosome that allowed for its structural determination to high resolution, revealing the composition of the intact human mitoribosome and its assembly intermediates. Here, we follow up on this work and present an optimized and more cost-effective method requiring only ~1010 cultured HEK cells. The method can be employed to purify human mitoribosomal translating complexes, mutants, quality control assemblies and mitoribosomal subunits intermediates. The purification can be linearly scaled up tenfold if needed, and also applied to other types of cells.

Mitochondria have specialized ribosomes that diverged from their bacterial and cytoplasmic counterparts. Here we show how mitoribosomes can be obtained from their native compartment in HEK cells. The method involves isolation of mitochondria from suspension cells and consequent purification of mitoribosomes.

Hızlı izole edilmesi HEK hücrelerden Mitoribosome

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Biyokimya

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Tıp

Mitokondriyal Temas Bölgelerinin İzolasyonu

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Yazar Spotlight: Mitokondriyal İletişim Sitelerinin ve Mimari İçgörülerin Ortaya Çıkarılması 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Mitokondri Yüksek Coupled Sıçan Kalp hazırlanması

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Biyoloji

Süper Kompleks Analiz için Küçük Doku Örneklerinde Mitokondriyal Fraksiyonlama

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial electron transport chain organization, giving rise to the proposal of the "plasticity model." This model postulates the coexistence of different proportions of SCs and complexes depending on the tissue or the cellular metabolic status. The dynamic nature of the assembly in SCs would allow cells to optimize the use of available fuels and the efficiency of electron transfer, minimizing reactive oxygen species generation and favoring the ability of cells to adapt to environmental changes. 
More recently, abnormalities in SC assembly have been reported in different diseases such as neurodegenerative disorders (Alzheimer's and Parkinson's disease), Barth Syndrome, Leigh syndrome, or cancer. The role of SC assembly alterations in disease progression still needs to be confirmed. Nevertheless, the availability of enough amounts of samples to determine the SC assembly status is often a challenge. This happens with biopsy or tissue samples that are small or have to be divided for multiple analyses, with cell cultures that have slow growth or come from microfluidic devices, with some primary cultures or rare cells, or when the effect of particular costly treatments has to be analyzed (with nanoparticles, very expensive compounds, etc.). In these cases, an efficient and easy-to-apply method is required. This paper presents a method adapted to obtain enriched mitochondrial fractions from small amounts of cells or tissues to analyze the structure and function of mitochondrial SCs by native electrophoresis followed by in-gel activity assays or western blot.

Yazar Gündemi: Sağlık ve Hastalıkta Oksidatif Fosforilasyon Sistem Dinamiklerini ve Mitokondriyal Rolleri Ortaya Çıkarmak

This protocol describes a technique for the analysis of respiratory supercomplexes when only small amounts of samples are available.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

<meta charset="utf8"></head><body>Yüksek Kaliteli Biyoenerjetik Çalışmalar için Kemirgenlerden Mitokondriyal İzolasyon

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry to study metabolic impairments and disease. Consistent mitochondrial quality is necessary to properly investigate mitochondrial physiology and bioenergetics; however, many different published isolation methods are available for researchers. Although different experimental strategies require different isolation methods, the basic principles and procedures are similar. This protocol details a method capable of extracting well-coupled mitochondria from a variety of tissue sources, including small animals and cells. The steps outlined include organ dissection, mitochondrial purification, protein quantification, and various quality control checks. The primary quality control metric used to identify high-quality mitochondria is the respiratory control ratio (RCR). The RCR is the ratio of the respiratory rate during oxidative phosphorylation to the rate in the absence of ADP. Alternative metrics are discussed. While high RCR values relative to their tissue source are obtained using this protocol, several steps can be optimized to suit the individual needs of researchers. This procedure is robust and has consistently resulted in isolated mitochondria with above-average RCR values across animal models and tissue sources.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: Mitokondriyal Kalsiyum Fosfatın Kalp Yetmezliği ve Biyoenerjetik Üzerindeki Rolünü Ortaya Çıkarmak

Bioenergetic and metabolomic studies on mitochondria have revealed their multifaceted role in many diseases, but the isolation methods for these organelles vary. The method detailed here is capable of purifying high-quality mitochondria from multiple tissue sources. Quality is determined by respiratory control ratios and other metrics assessed with high-resolution respirometry.

Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon 

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hızlı izole edilmesi HEK hücrelerden Mitoribosome

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Mitokondri Yüksek Coupled Sıçan Kalp hazırlanması

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu

Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon