Biz yazarların tanıtımı için bu yordamı mitokondriyal biyoloji ve birçok yararlı açılımlar ve öneriler alanına Prof A. Vinogradov ve Dr. Vera Grivennikova teşekkür ederim. Yazarlar video hazırlanması için Queens Üniversitesi medya ofisi Bayan Amanda McKintock minnettar.

Giriş Sıçan kalp Mitokondri hücresel metabolizma geçmiş ve güncel çalışmalar için en yaygın hazırlıkları biridir. Onlar vahşi tip veya knock-dışarı hayvanların büyük miktarda hızlı ve güvenilir bir şekilde elde edilebilir. Genel prosedür tripsin, bölme ve diferansiyel santrifüj doku sindirim oluşur. (Şekil 1) kalp de dahil olmak üzere, çeşitli dokulardan mitokondri izolasyonu sırasında tutulması gereken bazı koşullar vardır. <ul><li> Doku, elde edilen mitokondri verim doğrudan etkilediği için iyice kıyılmış vardır. Kalp dokusu küçük kavisli makas ile kıyma iyi olur ve bir doku değirmeni, yaklaşık 1.0 mm çapında çıkış delik çapı ile sarımsak basın mevcut değilse, bir Latapie doku değirmeni kullanımı ile takip edilebilir. </li><li> Bu çözümler her adımda sıcaklığını korumak için gereklidir. Bu nedenle soğuk oda ve tüm enstrümanlar bütün prosedür yürütülecek ve çözümleri, önceden hazırlanmış ve soğutulması gerekiyor. Sıcaklık koşullarında tutulması değilse hazırlık istikrarlı çeşitli özelliklerini kaybetmiş olabilir. Mitokondrial yapısı, aktif taşıma çalışmaları önemlidir, özellikle de izin verilmez (örneğin santrifüj sırasında) süspansiyon overfreezing donmaya karşı çok hassastır. </li><li> Önemli bir parametre prosedürün zaman uzunluğu, izolasyon mümkün olduğunca çabuk ve elde edilen hazırlık hemen kullanılmak üzere olmalıdır. Bu nedenle, cerrahi aletler, çözümleri ve cihazlar, önceden hazırlıklı olmamız gerekiyor. </li></ul> Malzeme ve araçlar Enstrümanlar <ol><li> Düz işletim makas, sivri </li><li> Eğri makas </li><li> Forseps </li><li> Petri kabı </li><li> Küçük huni + parça naylon filtre (prewashed) </li><li> 6 bardak 50 ml </li><li> İki manyetik karıştırıcı ve iki buz banyoları </li><li> Bir büyük buz banyosunda </li><li> 2 küçük manyetik çubuklar </li><li> Pelet kazıma için spatula </li><li> Santrifüj tüpleri </li><li> Latapie doku basın (sarımsak basın ile ikame edilebilir) </li><li> 20ml teflon cam homogenisers ve 1-2ml </li><li> Atık beher </li><li> Protein tayini için son mitokondriyal süspansiyon ve örnekler için Eppendorf tüpleri </li><li> Buz banyosu </li></ol> Çözümler (2 sıçanlarda başına hesaplanan): <ol><li> Yıkama tamponu: 0.3 M Sakkaroz, 10 mM HEPES (pH = 7.2), 0.2 mM EDTA (1000 ml) </li><li> İzolasyon tamponu: 0.3 M Sakkaroz, 10 mM Hepes (pH = 7.4), 0.2 mM EDTA, 1 mg / ml BSA (Sigma A6003) (Çamaşır tampon hazırlanmış 100ml). Sığır serum albümin daha az pahalı yağ asit analogları ile ikame edilebilir. Aynı tampon ya da izotonik varyasyonlar, tampon Resuspending olarak kullanılır. </li><li> Tripsin (Sigma T8003) çözüm: 2.5mg/ml 1mm HCl (0.5 ml) </li><li> Soya fasulyesi tripsin inhibitörü (Sigma T9128) İzolasyon tamponu 6.5 mg/10 ml </li></ol> Protokol Prosedürün genel şeması Şekil gösterilir. 1. Kalpler soğutmalı ve tampon, ventriküler doku eksize kıyılmış ve tripsin ile fotolitik tedavi sırasında homojenize Çamaşır yıkanmalıdır. Süspansiyon, düşük hızda santrifüj edilir ve elde edilen süpernatant mitokondri toplamak için yüksek hızda tekrar santrifüj edilir. Resuspending tampon planlanan deneyler bağlı diğer herhangi bir izotonik solusyon tarafından değiştirilebilir. Hayvanlar uygun olarak İngiltere ile sonlandırıldı &quot;Animals (Scientific Procedures) Yasası.&quot; dekapitasyon takip servikal dislokasyon. Hayvan dekapitasyon hemen sonra kalp ayıklamak için gereklidir, bu nedenle hayvan fesih ve kalp çıkarma arasında herhangi bir gecikme olduğunu. Mitokondri karaciğer paralel izolasyon bekleniyor sıçanlar deney öncesinde gece aç olmalıdır. <ol><li> Yıkama Tampon 40 ml içeren üç bardak hazırlayın. Onları bir sonraki adıma geçmeden önce 3 ila 5 dakika süreyle buz-tuz banyosu soğutun. Overfreeze ve buz kristalleri bulutları hemen sonra görünmeye başlar hemen kullanmak için değil emin olun. </li><li> Dekapite sıçan toraks açın ve kalp ayıklayın. Küçük kesiler olun ve hemen ardından ilk beher buz gibi bir çözüm kalp transfer. Kalp, kan kaldırmak ve ikinci behere koyun sıkın. Her kalp için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Kuru filtre kağıdı kalpleri. Tüm yağ, pıhtılaşmış kan, auricles ve fasya ve havuz ventriküler doku çıkarın. </li><li> Parçacıkların büyüklüğü 1-2 mm kadar yaklaşık 5 dakika buz üzerinde Petri kabı küçük kavisli makas ile toplanmış doku Kıyma. </li><li> Doku basın içine kıyılmış doku koyun ve passüzerinden. Önemli bir miktarda malzeme basın basın duvarları ve alttan tüm kalp dokusu toplamak kalır ki farkında olun. </li><li> 50 ml Yıkama Tampon behere aktarın ve karıştırın. Sonra bir naylon filtre aracılığıyla süspansiyon filtre. Çamaşır Tampon filtre 3 kez kıyılmış doku yıkayın ve süzüntü atın. </li><li> Yıkama Tampon 20 ml içine yıkanmış doku transferi ve manyetik karıştırıcı buz banyosu içine koyun. 0,5 ml tripsin sürekli karıştırma altında çözüm ekleyin ve Sayacı başlatmak. Başka bir manyetik karıştırıcı, buz banyosu ve ikinci bir 50 ml beher hazırlayın. </li><li> 4. dakikada kısaca süspansiyon dağıtmak için yukarı ve aşağı birkaç vuruş ile gevşek takılmış küçük bir cam-teflon Homojenizatörler (10-15ml) bölümünü kullanarak süspansiyon kısmı homojenleştirme. Süspansiyon homojenleştirme sonra ikinci bir behere aktarın. 9. dakikada, toplam süspansiyon iki kez homojenleştirme gerçekleştirmek o kadar aynı işlemi tekrarlayın. Inkübasyon 15 dakika sonra, 10 ml tripsin inhibitörü içeren tampon izole ekleyin ve 1 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Naylon filtre ile tekrar süspansiyon ve süzülen kaydetmek. Çamaşır Buffer 15-20 ml 1 dakika için bir filtre ve homojenize sol partikül fraksiyonu toplayın. </li><li> Homojenat süzüntü ve 600g az 15 dakika süreyle santrifüj ile birleştirin. </li><li> Meydana gelen supernatant, yeni bir santrifüj tüpü içine dikkatlice filtre. Pelet kirletil ve 8500g az 15 dakika tekrar santrifüj. </li><li> Süpernatantı yüksek hızda santrifüj sonra atmak ve 1 ml tampon atarak kabarık beyaz dış kenarı katmanı pelet 2-3 kez yıkayın. Spatula ile pelet kadar Break ama altta kırmızı nokta eritrositlerin önlemek. Kan hücreleri Loos geldiyseniz, homojenleştirme önce süspansiyon kırmızı bit kaldırın. </li><li> Nazik pipetleme, küçük bir Homojenizatörler veya alternatif pelletini tekrar. Daha Isolationbuffer süspansiyon seyreltilir ve 8500g az 15 dakika tekrar santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın Buffer (seçim izotonik tampon) Resuspending, pelet tekrar süspansiyon haline getirin ve tekrar santrifüj. </li><li> Çıkan kahverengi pelet yıkanmış sağlam mitokondri içerir. Seçtiğiniz izotonik tampon çok küçük bir hacim içinde pelletini tekrar. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 mitokondri sıçan kalp izolasyonu adım prosedürü adım gösteren Programı. Üst kısmı, Aşamaları 1-9: doku bozulması, tripsin tedavi homojenleştirme ve alt kısmı, aşamaları 10-15: diferansiyel santrifüj.

<ol>
	<li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+heart+mitochondria:+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation.">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li><li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes:+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria.">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li></ol>

Kaplin yüksek derecede sağlam mitokondri izolasyonu için Ayrıntılı hızlı protokol açıklanmıştır. Elde edilen preparat hücresel biyoenerjetik, proteomik çalışmaları veya mitokondriyal DNA analizi ve lipid içeriği fonksiyonel veya yapısal araştırma için kullanılabilir. Iyonları ve metabolik ara aktif taşıma Biyofiziksel çalışmalar da yapılabilir. Submitochondrial parçacıklar, dış membran veya oksidatif fosforilasyon arındırır ayrı bileşenden izole etmek için daha mitokondriyal hazırlık süreci mümkündür. Açıklanan yöntem Jacobus ve Saks 1 izolasyon standart bir protokoldür bir değişiklik. Hazırlanan mitokondri beklenen verim başına mitokondriyal protein ve kalp böyle bir hazırlık malat / glutamat arasında değişmektedir solunum kontrol oranı yaklaşık olarak 10-15 mg 0.12 etrafında mol O 2 xmin -1 xmg protein Devlet IV solunum ile 8 ila 12 23 -1 ° C 0,25 M sukroz, 10 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 150 mcM başlatma Devlet III solunum ADP (tam deneysel koşullar ve eklemeler için, bkz. ref ile 5 mM potasyum fosfat (pH 8.0) oluşan orta 2). Özel dikkat izolasyon prosedürü başlamadan önce birkaç teknik detayları verilmelidir. Temiz polikarbonat veya polipropilen santrifüj tüplerine kullanılması çok önemlidir, bu nedenle tüpler temiz bir fırça ve sıcak su, deterjan Ancak tedavinin en az tutulmalıdır ile iyice yıkanmalıdır. Ayrıca, soğuk oda izolasyonu bir gün önce gerekli tüm cam ve aletleri toplamak için daha iyidir. Izolasyon sırasında bardak için matara tamponlar aktarırken, а özel dikkat çözümler buzlu su damlaları önlemek için verilen olmalıdır. Dokuların işleme zaman kalp çıkarma hayvanın baş kesme ve soğutma doku arasında kısa süreli bir gecikme bile kısmen Kuplajsız mitokondri neden, çünkü mümkün olan en kısa sürede yapılacaktır gerektiği vurgulanmalıdır. Hızlı soğutma ve kaldırılır kalpleri iyice yıkama standart hazırlama, hemoglobin ve eritrosit NADase ücretsiz elde etmek için esastır. Tripsin, doku duyarlılık homojenleştirme sırasında kesme kuvveti artırmak için bağlayıcı proteinlerin bozulması için kullanılır. Proteaz dokusunun uzun süreli maruz kalma, düşük kaliteli mitokondri sonuçları kaçınılmalıdır. Yüksek hızda santrüfüj sonra santrifüj tüplerine duvarlar duvarlar üzerinde biriken yağ malzemenin herhangi bir mevduat kaldırmak için kağıt mendil ile silinmelidir. Son tabanda için depolama (150-200 ul kalp başına tampon) sırasında, mitokondriyal fonksiyonların kaybını en aza indirmek için son tampon düşük hacimli kullanmak daha iyidir. Kalsiyum katyonların ulaşım çalışmaları için herhangi bir şelat ajanları EGTA ücretsiz orta ile birkaç kez yıkanır ve izolasyon sonrası ilk saat içinde kullanılmalıdır, böylece mitokondri son hazırlık mevcut olmalıdır.

preparation of highly coupled rat heart mitochondria

Oksidatif fosforilasyon sürecinde hücresel ATP nesil mitokondri fonksiyonu yaygın olarak kabul edilmektedir. Geçtiğimiz yıllarda enerji üretimi daha mitokondri diğer fonksiyonları anlayışımızda önemli gelişmeler olmuştur. Bunlar, organelleri, memeli geliştirme sinyalizasyon ve hücre metabolizması ve hücre çoğalması arasındaki koordinasyonu katkıları yanı sıra yaşlanma gibi davranan, apoptozis rollerini içerir. Mitokondri tarafından modüle biyolojik süreçlerin anlayışımız sağlam dokulardan laboratuvar hayvanları mitokondri izolasyon ve taşıma için sağlam bir yöntem dayanmaktadır. Sıçan kalp Mitokondri knock-out hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar da dahil olmak üzere hücresel metabolizma geçmiş ve şimdiki çalışmaları için en yaygın hazırlıkları biridir. Burada bozulmamış bir yüksek derecesi ile kaplin mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir hızlı yöntemi açıklanmaktadır. Böyle bir hazırlık mitokondri rat kalp, fonksiyonel ve yapısal araştırma hücresel biyoenerjetik, mitokondriyal DNA, proteinler ve lipidler biyomoleküllerin, proteomik çalışmalar ve analizler taşınması için mükemmel bir nesnedir.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria at JoVE.com

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Biz а hücresel biyoenerjetik, biyofiziksel ölçümleri, proteomik veya mitokondriyal DNA ve lipidler analizi fonksiyonel veya yapısal çalışmalar mitokondri saf, çok birleştiğinde sıçan kalp izolasyonu için protokol açıklar.

Mitokondri Yüksek Coupled Sıçan Kalp hazırlanması

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

preparation-of-highly-coupled-rat-heart-mitochondria

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Görüntüleme.  University of Manchester. Biz а hücresel biyoenerjetik, biyofiziksel ölçümleri, proteomik veya mitokondriyal DNA ve lipidler analizi fonksiyonel veya yapısal çalışmalar mitokondri saf, çok birleştiğinde sıçan kalp izolasyonu için protokol açıklar.

Video: Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Sıçan Kalp Engineered Doku implantasyonu

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Biyoloji

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Biyomekanik ve Mechanobiological Araştırmalar Rat Kuyruk Tendonlar hazırlanması

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Memeli Tüm Embriyo Kültürü için uygun Rat Serum hazırlanması

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

İzole Çalışma Sıçan Kalp Glukoz ve Yağ Asidi Oksidasyonu Oranlarının Belirlenmesine Yöntemleri

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...