Yazarların laboratuvar İş Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (GM41628) bir hibe ile ve Büyükşehir Kansas City Community Vakfı Helen Nelson Tıbbi Araştırma Fonundan Tıp Araştırma Enstitüsü Stowers bir hibe ile desteklenmektedir.

1. Üretim ve tam uzunluktaki veya FLAG işareti Mutant sürümleri ifade eden HEK293 Sabit bir Hücre Soylarının Kültür epitop Ino80 ya da diğer alt-birimleri INO80 Kompleks <ol><li> Tam uzunlukta ya da mutant insan Ino80 ATPaz ya da in-frame, N-terminal FLAG epitop etiketi olan memeli ifade vektörü pcDNA5 / FRT içine bir INO80 alt birimini kodlayan cDNA klonu. </li><li> Devam etmeden önce, DNA dizilimi yolu ile eklenen cDNA dizisini doğrulamak. </li><li> Transfeksiyon gerçekleştirmek için, DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı),% 5 glutamin ihtiva eden bir ortam içinde 10 cm doku kültür tabaklarında HEK293 hücrelerinde FLP-büyür ve% 10 FBS (fetal inek serumu). </li><li> Hücreler,% 70 ortak akışkanlığa ulaştığında, toplam hacim içinde, her bir doku kültür tabağına FuGene ™ 6 Transfeksiyon ayıracı 40 ul, uygun pcDNA5 / FRT ekspresyon plazmidi, 0.5 ug, ve Flp rekombinaz kodlayan pOG44, 9.5 ug oluşan bir karışım eklemek 800 ul. </li><li> 48 saat sonra, trypsinize ve s01:30 plit 10 cm çanaklara doğru bir oranda hücre ve% 5 glutamin,% 10 FCS içeren DMEM içinde onları büyümeye ve 3 için 100 ug / ml higromisin B - 4 hafta. (- 5 gün genellikle her 3) o sararmaya başlar her kültür ortamı değiştirin. </li><li> FLAG-etiketli proteinin en yüksek seviyede ifade eden pozitif klonların belirlenmesi için, tek tek higromisin B-dirençli koloniler seçmek ve bir 24-çukurlu plaka tek bir kuyusuna transfer edin. <ol><li> Hücreler 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile ~ 1 ml PBS ve pelet içinde, her bir oyuktan% 80 ortak akışkanlığa, hasat hücrelere ulaşır. </li><li> Süpernatanın ayrılmasından sonra, SDS-PAGE numune tampon maddesi, 60 ul hücre pelletini. </li><li> SDS sayfa ve FLAG ifadesini izlemek için blot için yeniden süspanse hücre pelet Konusu yarısı yem proteini etiketlendi; gelecek analizleri için diğer yarısını kaydedin. </li></ol></li><li> Herhangi bir FLAG-etiketli insan Ino80 protein hücre lizatlarında tespit edilirse, başlangıç ​​klonal hücre popu genişletmek15 cm doku kültür kaplarına bir 24-çukurlu plaka tek kuyulardan hücreler kaplanarak daha da lasyon. <ol><li> 15 cm&#39;lik kaplar, 50 ml&#39;lik bir konik tüp buz gibi soğuk PBS ile kaynaşık hücrelerin yakınındaki tekrar süspansiyon ve transferi hücreleri hasat etmek. </li><li> Ek PBS eklenerek 50 ml&#39;lik bir son hacme getirmek. </li><li> Pelet 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de hücreleri ve süpernatan mümkün olduğu kadar çıkarın. </li><li> Lys450, 1 ml tampon içinde hücre pelletini (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.9, 450 mM NaCI tekrar süspansiyon,% 0.5 Triton X-100, 10 mM KCI, 4 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA,% 10 gliserol, 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli). NOT: Burada ve başka yerlerde, her zaman hemen bir deney başlamadan önce tamponlar DTT, PMSF ve proteaz inhibitörü kokteyl ekleyin. </li><li> İmmüno-çökelti, anti-Flag agaroz jeli 20 ul kullanılarak elde edilen bütün hücre lizatı proteinleri FLAG-etiketli ve Western lekeleme yolu ile FLAG sıvı kısımlar analiz eder. [Immun ayrıntıları içinoprecipitation prosedürü, adım 5. bakınız] </li></ol></li><li> İstediğiniz klonal hücre hatları 12 dondurulmuş stokları hazırlayın ve kullanılıncaya kadar sıvı azot içinde saklayın. </li></ol> Rulo şişeler 2. Büyüyen HEK293 Hücre Hatları INO80 komplekslerin büyük ölçekli hazırlanması için, hücreler kültür içinde 10 - 20 silindir şişeler; her yuvarlanır şişeye tipik bir verim paketlenmiş hücre ~ 1 ml&#39;dir. <ol><li> Her bir silindir için bir şişe, higromisin B olmadan 200 mi DMEM,% 5 glutamin, ve% 10 dana serumu, ekleme </li><li> Her silindir bir şişe içine tek Yakın-konfluen 15 cm&#39;lik tabağı alınan hücrelerin tüm aktarma </li><li> Yer rulo 37 ° C inkübatör içine silindir şişe şişeler, 0.2 rpm&#39;de döndürün. </li><li> Hücreler ~% 70 confluency ulaştığınızda, kapalı dökün ve orta atın. </li><li> Her şişeye ~ buz 50 ml soğuk PBS ilave edin. Şişe Holding yatay, yavaşça hücre tek tabaka gevşetmek için girdap. </li><li> 250 mi plast üzere yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarınic konik şişeleri ve buz üzerinde yer. </li><li> Ek PBS ile silindir şişe durulayın biberon şişesi sırayla aktarma. Çalkalama solüsyonu, artık kesin (tipik olarak yaklaşık 5 şişe yıkamak için kullanılan sonra değil), hücre süspansiyonu ekleyin. </li><li> 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Yavaşça, PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon tek bir 250 ml&#39;lik konik şişe içine bunları birleştirmek ve daha fazla işlem kadar buz üzerinde tutmak. </li></ol> Başka bir FLAG-etiketli INO80 alt birimini ifade eden hücrelerde INO80 Altbirimlerin 3. siRNA aracılı Nakavt Tek bir alt birimini eksik INO80 subcomplexes elde etmek için, kullanım FLAG immünolojik stabil bir şekilde eksprese eden shRNA, siRNA ile muamele edilmiş hücreler ya da hücrelerden INO80 kompleksleri arıtılması kolaydır. (Küçük müdahale RNA) transfeksiyon protokolü burada açıklanan &quot;ters&quot; SiRNA 15 cm yemekleri büyüyen HEK293 hücreler için optimize edilmiştir. Protokol hücreler ve sho tek bir 15 cm çanak içinULD gereken hücre sayısına bağlı olarak buna göre ölçeklendirilebilir. SiRNA ile muamele edilmiş hücrelerden INO80 kompleks biyokimyasal olarak faydalı miktarlarda hazırlanması için, tek bir 40 15 cm tabaklarda büyüyen kültürlerden kadar büyütülebilir edilmelidir; paketlenmiş hücre peleti 4 ml - yaklaşık 2, bu verecektir. <ol><li> Stabil 15 cm yemekleri yakın confluency INO80 kompleksinin istenen alt birimi ifade HEK293 hücreleri büyümek. </li><li> SiRNA yeniden süspansiyon tamponu hacmi ekleme (20 mM KCI, 6 mM HEPES pH 7.5, ve 0.2 mM MgCI2), yeterli liyofilize siRNA içeren bir tüpe siRNA bir 50 uM stok solüsyonu hazırlanır. Çözelti pipetle yukarı ve aşağı birkaç kez ve siRNA tamamen eritilir sağlamak için, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe nutator. </li><li> SiRNA&#39;ları ve transfeksiyon ayıracı içeren bir transfeksiyon kokteyl hazırlayın. Çok hafif bir karıştırma ile İndirgenmiş Serum Ortamı 32 ul Lipofektamin RNAiMAX ile 50 uM siRNA stok çözeltisi 10 ul karıştırın ve Opti-MEM, 4 ml eklemek; alDüşük bütün maddeler kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini. </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> Stabil olarak transfeksiyon için, istenen alt-birimini eksprese INO80 Flp olarak HEK293 hücrelerinin hazırlayın. <ol><li> Aşama 3.4 İnkübasyon sırasında, RT kez PBS ile 15 cm tabaklarda hücreleri yıkayın. </li><li> Onlar plakayı kaldırarak başlar sadece kadar PBS çıkardıktan sonra, 1 ml tripsin hücreleri davranın. </li><li> Hemen hücreler tripsinize edildi ve hafifçe karıştırmak için, tam bir ortamda (DMEM +% 5 glutamin +% 10 FBS), 10 ml ilave ediniz. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplanır. </li><li> ~ 4 mi, tam bir ortamda hücre pelletini ve bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı yeniden süspanse. </li><li> ~ 5.4 x 10 6 / ml &#39;lik bir konsantrasyonda komple ortam hücreleri seyreltin. </li></ol></li><li> Her 15 cm çanak, 4 ml transfeksiyon kokteyl ardından 15 ml tam bir kültür ortamı ekleyin. Thoro olan orta ve transfeksiyon kokteyl sağlamak için yavaşça karıştırınızughly karıştırılır. Son olarak, eşit hücrelerini dağıtmak için hafifçe girdap tekrar hücre süspansiyonu ekleyin ve bir ml. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde kültür 60 saat sonra, yavaşça ortam, buz gibi soğuk PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak ve çekirdek özütleri hazırlamak için hemen devam edin. </li></ol> Nükleer özler 4. hazırlanması Bu prosedür, Dignam 13&#39;teki protokole göre modifiye edilmiş ve hücre pelletleri başlangıç ​​boyutuna bağlı olarak da aşağı yukarı ölçekli edilebilir. Tipik haliyle, paketlenmiş hücre topağı verimi nihai nükleer ekstre 1 ml 1 ml. Tüm tamponlar buz soğuk olması ve uygun bir soğuk oda mevcut değilse, bütün aşamalar, soğuk bir odada veya buz üzerinde yapılmalıdır. <ol><li> Çekirdekler izole edilmesi: <ol><li> Yavaşça 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de (15 veya 50 mi) uygun boyutlu bir hücrelerin konik bir tüp içinde ve spin mezun aktarın. </li><li> Süpernatantı ve paketlenmiş hücre pel hacmini ölçmeklet. Paketlenmiş hücre 1 mi, 3 x 10 ~ 8 HEK293 hücrelerine karşılık gelir. </li><li> 5 paketlenmiş hücre Tampon A hacimleri (: 1.000 proteaz inhibitör kokteyl, 10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI ve taze 1 mM DTT, 200 uM PMSF ilave edildi ve 1) ekleyin. Nazik pipetleme hücre pelletini. </li><li> Tam 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de, hücreleri topaklamak ve supernatant çıkarın. </li><li> Hücre topağı büyüklüğü Tampon A&#39;da inkübasyon sırasında 2 katı kadar artmalıdır </li><li> Tampon A&#39;nın iki paketlenmiş hücre hacimleri hücrelerin tekrar ve uygun büyüklükte bir Dounce doku homojenleştirici için hücre süspansiyonu aktarın. Paketlenmiş hücre az 2 ml ile başlanırsa, bir 7 ml homojenleştirici kullanılması; 2 - 4 ml dolu hücreler, 15 ml homojenleştirici kullanın; ve paketlenmiş hücreler 10 veya daha fazla ml, 40 ml homojenleştirici kullanılır. </li><li> Dounce homojenleştirici un SERBEST cam havan eli ile hücre süspansiyonu homojenizeHücrelerin% 90 til% 1 tripan mavisi ile pozitif leke. </li><li> JA-17 rotor içinde ya da benzer, 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 25,000 xg&#39;de 45 mi, yüksek hızlı santrifüj tüpüne ve spin süspansiyonu aktarın (Malzeme / donatım arasında Tablo). </li><li> Nükleer pelet kaynaktan, sitosolik proteinler veya parçalama sırasında çekirdek dışarı sızmasını protein içeren süpernatant, kaldırın. </li></ol></li><li> Tuz ile çekirdekleri ayıklanıyor: <ol><li> Ekleme Tampon C (20 mM HEPES, pH 7.9,% 25 gliserol, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA ve taze eklenmiş 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli), nükleer pelet; paketlenmiş hücre hacmi (~ 1 x 10 9 hücre) başlayan her 3 ml 2.5 ml Tampon C kullanın. </li><li> Bir cam çubuk ya da bir pipet kullanarak, borunun çeperinden nükleer pelet çıkarmak ve bir uygun büyüklükte bir Dounce homojenleştirici Karışımın tamamını aktarın. </li><li> TH homojenleştirilmesiyle çekirdekleri yeniden süspanseBir SERBEST havan eli, iki vuruş ile e karışımıdır. </li><li> Soğutulmuş bir behere yeniden süspansiyon haline getirilmiş çekirdek fraksiyonu aktarın. Süspansiyon derin en az 0.5 cm kabı dolduracak şekilde bir beher seçin. </li><li> Yavaşça buz üzerinde, bir pipet veya cam çubuk ile süspansiyon karıştırılırken kromatin veya diğer bir çözünür yapıları nükleer proteinlerini ekstre etmek için, kademeli olarak 5 M NaCl damla damla 0.42 M NaCI süspansiyonun tuz konsantrasyonunu arttırmak; 5 M NaCl her eklendikten sonra, çözelti, çok zor akışlı ya da jel benzeri bir hale gelmelidir. M NaCI, aşağıdaki formüle göre, 0.42 M NaCI nihai konsantrasyon elde edilecek şekilde bir çözüm getirmek için gerekli 5 hacim hesaplanır: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" /></li><li> Dikkatle Tip 45 Ti o bir Tipi 70.1 Ti rotor için 10 ml&#39;lik polikarbonat tüp içine viskoz süspansiyon aktarın (veya eşdeğeri) veya 70 ml polikarbonat şişelerbenzer rotor (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) r. 70 ml şişe kullanıyorsanız 10 ml tüpler kullanarak veya kapak takımı ile eğer parafilmle sıkıca kapatılmalıdır. </li><li> Yavaş yavaş Nutator ile 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de kapalı tüpler sallayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 120,000 x g&#39;de, Tip 45 Ti veya 30 dakika boyunca 70.1 Ti rotor içinde örnekleri dönerler. </li><li> Tek bir plastik tüp veya şişe süpernatant aktarın. Bu yüzer madde çekirdek ekstraktı, ve topak kromatin ve diğer nükleer artıkları içerir. </li><li> , Elverişli ölçülü kısma bölün nükleer ekstre sıvı azot içinde dondurularak ve -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> İnsan ya da INO80 INO80 subcomplexes 5. immün afinite temizliği <ol><li> Dondurulmuş nükleer ekstre çözülme için, donmuş madde kadar el arasında tezgah üstü ya da hareket borular üzerindeki özü içeren bir yer tüpleri, bir bulamaç haline gelir. Özü tamamen t kadar Sonra buz üzerinde veya soğuk odada tüplerihawed. </li><li> Donma-çözülme devresi sırasında oluşabilen çökeltinin ayrılması için bir Tip 70.1 Ti rotor veya eşdeğeri, 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 100,000 x g&#39;de 10 mi çözülmüş nükleer polikarbonat ultra santrifüj tüplerine çıkarma ve döndürme aktarın. </li><li> 15 ml konik tüp süpernatant aktarın. 1000 Proteaz İnhibitörü Kokteyli: 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1 nihai konsantrasyonlarda taze DTT PMSF ve protease inhibitör karışımı ekleyin. </li><li> , Immün-anti-FLAG agaroz hazırlamak uç temiz bir bisturi ile kesilip edilmiş olan bir ucu olan bir P200 ya da benzer bir pipet kullanılarak bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne anti FLAG agaroz taneleri% 50 bulamaç 200 ul aktarmak veya jilet. </li><li> 30 saniye için 8000 x g hızında çalışan tezgah üstü bir mikrosantrifüj içinde santrifüjleme ile boncuk Pelet. Süpernatantı, Lys450 ve 1 ml tampon içinde süspansiyon haline getirilerek boncuk boncuk yıkayın ve 30 saniye boyunca 8000 x g&#39;de boncuk pelet. B yıkayıniki kez daha EADS. </li><li> Uç temiz bir bisturi ya jilet ve aynı ucu kullanılarak transfer ile kesilmiş olan başka bir ucu ile bir P200 ya da benzer bir ayarlanabilir hacimli bir pipet kullanarak nükleer ekstre yaklaşık 100 ul yıkanmış anti FLAG agaroz boncuk tekrar Ekstraktı içeren 15 ml&#39;lik konik tüpe yeniden süspansiyon haline boncuk. Boncuklar her 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer edilmiştir kadar birkaç kez tekrarlanır. </li><li> Laboratuar rotator yavaş dönme ile, 4 ° C de 4 saat boyunca özü / boncuk karışımı inkübe edin. İSTEĞE BAĞLI: DNA safsızlığı uzaklaştırmak için 25 ünite / ml arasında bir konsantrasyonda Benzonase Dahil. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile FLAG agaroz toplayın. </li><li> 10 mi Lys450 içinde süspanse yıkama, nazik bir nutator sallanarak 4 ° C&#39;de 5 dakika inkübe etmek. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de boncuk Pelet. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Lys450 ve transfer boncuk 150 ul - 100 süspanse edin. Coher boncuk mikrosantrifüj tüpüne aktarılmış kadar Lys450 150 ul - ntinue 100 ile 15 ml konik tüp durulayın. </li><li> Bir mikrosantrifüj içinde 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 8000 x g&#39;de boncuk aşağı dönerler. 1ml EB100 tamponu (10 mM HEPES pH 7.9,% 10 gliserol, 100 mM NaCl, 1.5 mM MgCI2,% 0.05 Triton X-100 ve taze eklenmiş 1 mM DTT, 200 uM PMSF ile bir defa 1 mi Lys450 ile üç kat daha fazla yıkayın ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli). </li><li> , Bağlı proteinleri elüte 0.25 mg / ml 1 x FLAG peptidi içeren 200 ul tampon EB100 ekleyin. Bir nutator 4 ° C&#39;de her biri 30 dakika inkübe edin. </li><li> Bir mikrosantrifüj içinde 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 8000 x g&#39;de boncuk Pelet. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne, taşınan INO80 kompleksini içeren süpernatant aktarın. </li><li> Elüsyon, dört kez daha tekrarlayın, ve tek bir tüpün içine tüm süpernatantlar bir araya getirirler. </li><li> Ayrıştırılan protein fraksiyonundan kalan FLAG agaroz taneleri uzaklaştırmak için,Boş bir dönüşlü kolonu eluatının geçmektedir. </li><li> Yıkanan protein fraksiyonu konsantre ~ 10 kat, ultra santrifüj filtre tertibatı (50,000 molekül ağırlıklı akış kesici) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. </li><li> FLAG peptidi uzaklaştırmak için, iki tuz giderme kolonlarından konsantre edilmiş protein fraksiyonu, sırasıyla geçer. </li><li> Sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C&#39;de saklanır, 20 ul alikotları saflaştırılmış, tuzdan arındırılmış protein parçasının bölün. </li><li> Gümüş lekeli jeller üzerinde veya western blotting ile INO80 veya INO80 subcomplexes altbirim kompozisyon analiz ve standartlar gibi bilinen konsantrasyonda rekombinant INO80 alt birimlerinden preparatlar kullanılarak yarı-niceliksel Western blotting ile bunların konsantrasyonlarını tahmin ediyoruz. </li></ol>

<ol>
	<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes,+Annual+Review+of+Biochemistry.">The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry.</a> 78, 273-304 (2009).</li><li>Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSA+domain+binds+nuclear+actin-related+proteins+to+regulate+chromatin-remodeling+ATPases.">The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases.</a> Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).</li><li>Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+remodelling+complex+involved+in+transcription+and+DNA+processing.">A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing.</a> Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).</li><li>Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+actin-related+proteins+in+ATP-dependent+chromatin+remodelling.">Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling.</a> Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex:+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling.">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li><li>Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombination:+developments+and+applications.">Site-specific recombination: developments and applications.</a> 5 (5), 521-527 (1994).</li><li>Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase-mediated+gene+activation+and+site-specific+integration+in+mammalian+cells.">Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells.</a> Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex.">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YY1+functions+with+INO80+to+activate+transcription.">YY1 functions with INO80 to activate transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).</li><li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Modes+of+Regulation+of+the+Uch37+Deubiquitinating+Enzyme+in+the+Proteasome+and+in+the+Ino80+Chromatin-Remodeling+Complex.">Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex.</a> Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).</li><li>Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+purification+of+FLAG+epitope-tagged+bacterial+alkaline+phosphatase+using+a+novel+monoclonal+antibody+and+peptide+elution,+Biotechniques.">Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques.</a> 16 (4), 730-735 (1994).</li><li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+cell+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei.</a> Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Yüksek Ökaryotlardaki çok altbirimli memeli kromatin remodeling komplekslerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar mutant birimlerini içeren veya tamamen belli altbirimden yoksun bu tür komplekslerin biyokimyasal yararlı miktarlarda hazırlanması zorluk tarafından engellenmiştir. İlk olarak, memeli hücrelerinde genetik manipülasyon teknik zorlu ve zaman alıcı olmuştur: teknik engellerin vardır. Genomu kolaylıkla Recombineering teknikler kullanılarak düzenlenebilir ve hedef olabilir, maya hücreleri...

Evrimsel olarak korunmuş SnF2 aile kromatin remodeling kompleksleri kromatin organizasyonu ve DNA erişilebilirlik 1 anahtar regülatörler. Bu kompleksler, remodeling, her zaman, bazı durumlarda, çeşitli yardımcı proteinleri ile toplanır ve çoklu alt birim makro-molekül yığınları oluşturan, merkezi bir SnF2 gibi ATPaz alt-birimi bulunmaktadır. ATP&#39;ye bağımlı kromatin yeniden modelleme süreci molekül ayrıntılarını incelemek için, bu komplekslerin faaliyetlerine alt birimlerde ve / veya alan yapı belirli alt-katkılarını anlamak önemlidir. Bu tür analizler, belirli bir protein alt birimleri veya alan yapı yoksun yüksek düzeyde saflaştırılmış mutan kompleksler üretmek üzere yeteneğini gerektirir. ATP-bağımlı kromatin yeniden şekillenme komplekslerinin mi yapı-fonksiyon çalışmalarını yaygın (ref 1-4, örneğin, bakınız) bağlı olarak maya genomuna üstün uygulanabılirliği için maya model sistem üzerine odaklanmıştır. Koruma verilmişortolog biçimlenme kompleksleri arasında birim bileşimi ve işlevsellik, yapısı ve maya yeniden şekillenme komplekslerinin işlevi çalışmalar yüksek ökaryotlar meslektaşlarıyla önemli bilgiler sağladı. Bununla birlikte, takdir türe özgü biçimlenme kompleksler arasında fark kazancı ya da korunmuş alt-birimlerinin korunmuş bölgeler içinde yer alan türe özel alt ünitesi, kazanç ya da korunmuş alt-birimlerinin türe spesifik etki kaybı ve dizi değişkenliğine kaybından kaynaklanan, mevcut. Bu tür farklılıklar prensipte yüksek ökaryotik hücreler yeni moleküler ve hücresel ortamlara uyum için ihtiyaç tarafından tahrik edilebilir. Değil, sadece mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir aynı zamanda ATP-bağımlı kromatin yeniden şekillenme sürecinin temel mekanizmalarına ışık tutuyor, ama çünkü Böylece, daha yüksek ökaryotik yeniden şekillenme komplekslerinin alt birimleri nucleosome yeniden şekillenme sürecine nasıl katkıda anlamak, değerli olan kromatin yapısı tarafından HIG ve gen ekspresyonuOnun ökaryotlar düzenlenir. Bugüne kadar, sadece biyokimyasal tanımlanan kromatin remodeling kompleksleri ve subcomplexes elde zorluklar nedeniyle kısmen çoklu alt birim memeli kromatin remodeling komplekslerinin yapısal ve işlevsel çalışmalar, orada sınırlı kalmıştır. Bu kısmen immün afinite temizliği kararlı bir şekilde N-terminal FLAG epitopu yabani tip ya da mutant Ino80 5-7 sürümlerini etiketli ifade eden insan hücrelerinden sağlam INO80 veya INO80 subcomplexes hazırlamak için kullanıldığı aşağıda tarif edilen prosedürler ile, bu zorlukların şekilde alt (Şekil 1) . Insan hücrelerinden gelen sağlam INO80 kompleksleri elde etmek için, Flp aracılı rekombinasyon kararlı biçimde INO80 kompleksinin alt-birimleri kodlayan 8-10 FLAG epitopu etiketli cDNA&#39;larını ifade eden transgenik HEK293 hücre soyları meydana getirmek için kullanılır. INO80 alt birimlerinin aşırı ifadesi biraz toksik olduğundan, izole ve seçici kılıfı altında klonal hücre hatları korumak için gerekli olanşulları büyük ölçekli hücre kültürleri genişlemesi için gerekli olan bir çok geçitler boyunca sabit transgen ekspresyonunu sağlamak. Alt birimlerin yalnızca bir alt kümesini içeren küçük INO80 subcomplexes elde etmek için, biz başarılı iki yaklaşım kullanılmıştır (Şekil 2A, B). İlk olarak, belirli bir stably alt birimden 5 ile etkileşim için gereken etki eksikliği Ino80 mutant sürümlerini ifade eden HEK293 Flp olarak hücre hatları oluşturmak. Seçenek olarak ise, siRNA aracılı yok etme, uygun bir FLAG-etiketli INO80 alt birimini (yayınlanmamış veriler) ifade eden hücrelerden istenen alt birimi tüketmek için kullanılır. Son olarak, insan INO80 kompleksleri arıtmak için BAYRAK agaroz kromatografisi göre 11 etkili bir şekilde saflaştırılmış INO80 veya INO80 subcomplexes içeren son fraksiyon sitosolik proteinler kirletici varlığının azaltılması, nükleer ekstreler bir INO80 içeren fraksiyonun zenginleştirmek için kullanılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax-I (stablized glutamine)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">35050-079</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12176C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FuGENE6 transfection reagent&#160;&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">E2312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin B, sterile in PBS</td>
			<td>AG Scientific</td>
			<td style="width:147px;">H-1012-PBS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA5/FRT vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V6010-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flp-In HEK293 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">R780-07</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V600520</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZview&#160; Red ANTI-FLAG&#160; M2 Affinity Gel&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F2426</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12138C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TARGETplus SMARTsiRNA pool</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5x siRNA resuspension buffer&#160;</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">#B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine RNAiMAX&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">13778</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">51985-091</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">45000</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TrypLE (trypsin)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">12604</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x FLAG Peptide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3290</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Bio-Spin Chromatography Column</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">737-5021</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td>
			<td style="width:212px;">Amicon</td>
			<td style="width:147px;">UFC805024&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Desalting Columns&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">89882</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3165</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F7425</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">70664</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td style="width:147px;">06-435C&#160;</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339080</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-17 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">369691</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml polycarbonate tubes&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355630</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 ml polycarbonate bottles&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355655</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339160</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 70.1 Ti rotor&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">342184</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Clay Adams Nutator Mixer</td>
			<td style="width:212px;">BD Diagnostics</td>
			<td style="width:147px;">15172-203&#160;</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glas-Col Tube/Vial Rotator</td>
			<td style="width:212px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:147px;">099A RD4512</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">roller bottle incubator</td>
			<td style="width:212px;">Bellco biotechnology</td>
			<td style="width:147px;">353348</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

INO80 kromatin remodeling kompleksleri ATP-bağımlı nucleosome biçimlenme katalize ederek nucleosome dinamikleri ve DNA erişilebilirlik düzenler. İnsan INO80 kompleksleri Ino80, katalitik alt birim ve oluşan komplekslerin montajı için yapı iskelesi olarak hizmet, çok SnF2 gibi ATPaz&#39;ın 14 de dahil olmak üzere protein alt birimlerinin oluşur. Diğer alt birimlerin İşlevleri ve INO80 Kompleksin kromatin remodeling etkinliğine katkıda hangi mekanizmalar kötü nedeniyle insan hücreleri veya heterolog ifade sistemlerinde INO80 altparçadan üretme meydan kısmen anlaşılamamaktadır. Bu protokol, JOVE alt birimi ya da alt üniteler bir alt eksik insan INO80 kromatin yeniden şekillenme subcomplexes saflaştırılmasını sağlayan bir prosedür tarif etmektedir. N-terminal FLAG epitopu Ino80 cDNA, kararlı bir şekilde insan embriyonik böbrek (HEK) Flp aracılı rekombinasyon kullanılarak 293 hücre hatları içine yerleştirilen etiketlendi. INO80 kompleksinin alt-birimden oluşan bir alt grup b olduğu takdirdeE olanların bir alt birimlerinin montajı için gerekli platformu eksikliği yerine mutant Ino80 proteinleri ifade, silindi. Durumunda bağımsız bir alt-birimi tükeneceği için, kararlı bir şekilde ifade eden bir FLAG HEK 293 hücre hattı, bu alt-birimini hedef bir transfects siRNA&#39;lar Ino80 ATPaz etiketlendi. Nüklear özütler hazırlandı edilir ve FLAG immüno Ino80 türevlerini ihtiva eden protein fraksiyonları zenginleştirmek için gerçekleştirilir. Saflaştınldı INO80 subcomplexes bileşimleri daha sonra, immüno-lekeleme, gümüş boyama ve kütle spektrometrisi gibi yöntemler kullanılarak analiz edilebilir. Bu protokole uygun olarak elde edilen ve INO80 INO80 subcomplexes buradan sonra, ekteki JOVE protokolde tarif edildiği çeşitli biyokimyasal tahlilleri kullanılarak analiz edilebilir. Burada açıklanan yöntemler herhangi bir memeli çoklu alt birim kromatin yeniden yapısal ve fonksiyonel özellikleri ve değiştirme çalışmaları kompleksleri için adapte edilebilir.

Şekil 1 oluşturmak arındırmak ve insan INO80 ATP&#39;ye bağımlı kromatin yeniden şekillenme kompleksleri karakterize etmek için kullanılan prosedürleri özetleyen bir akış şemasını göstermektedir. Şekil 2 ve 3&#39;te gösterildiği gibi, bu işlemler böylece INO80 ait enzimatik aktivite için bu alt-birimlerin eksik katkı müteakip biyokimyasal analizler sağlayan çeşitli altbirimleri taşımayan vahşi tip INO80 ve INO...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes at JoVE.com

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Bu protokol oluşturulması ve vahşi tip ve insan INO80 kromatin yeniden şekillenme kompleks mutant versiyon saflaştırılması için bir yöntem tarif etmektedir. Epitop INO80 alt birimlerinin versiyonları kararlı biçimde HEK293 hücrelerinde ifade edilir ve alt birimlerinin kümelerini yoksun tam kompleksleri kompleksleri ve bağışıklık yakınlık kromatografisi ile etiketlenmiş.

Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

generation-purification-human-ino80-chromatin-remodeling-complexes

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Görüntüleme.  Stowers Institute for Medical Research.  Bu protokol oluşturulması ve vahşi tip ve insan INO80 kromatin yeniden şekillenme kompleks mutant versiyon saflaştırılması için bir yöntem tarif etmektedir. Epitop INO80 alt birimlerinin versiyonları kararlı biçimde HEK293 hücrelerinde ifade edilir ve alt birimlerinin kümelerini yoksun tam kompleksleri kompleksleri ve bağışıklık yakınlık kromatografisi ile etiketlenmiş. 

Video: Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biyoloji

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Farelerde Cajal (ICC) Ağ İnterstisyel Hücreler Görselleştirme

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). Many commercially available ligands are especially useful because they contain 
functional groups that allow for fast, high-purity, and high-yielding conjugation to macromolecules and biomolecules via amine-reactive 
activated esters and isothiocyanate groups or thiol-reactive maleimides. While metalation of these ligands is considered common 
knowledge in the field of bioconjugation chemistry, subtle differences in metalation procedures must be taken into account when 
selecting metal starting materials. Furthermore, multiple options for purification and characterization exist, and selection of the most 
effective procedure partially depends on the selection of starting materials. These subtle differences are often neglected in published 
protocols. Here, our goal is to demonstrate common methods for metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes 
that can be used as contrast agents for MRI (Figure 1). We expect that this publication will enable biomedical scientists to incorporate 
lanthanide complexation reactions into their repertoire of commonly used reactions by easing the selection of starting materials and 
purification methods.

We demonstrate the metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes. The complexes described here can be conjugated to macromolecules to enable tracking of these molecules using magnetic resonance imaging.

Manyetik Rezonans Görüntüleme için hazırlanması, Saflaştırılması ve lantanide Kompleksleri Kontrast Ajanlar Kullanım Karakterizasyonu

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...