Yazarların laboratuvar İş Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (GM41628) bir hibe ile ve Büyükşehir Kansas City Community Vakfı Helen Nelson Tıbbi Araştırma Fonundan Tıp Araştırma Enstitüsü Stowers bir hibe ile desteklenmektedir.

1. Üretim ve tam uzunluktaki veya FLAG işareti Mutant sürümleri ifade eden HEK293 Sabit bir Hücre Soylarının Kültür epitop Ino80 ya da diğer alt-birimleri INO80 Kompleks <ol><li> Tam uzunlukta ya da mutant insan Ino80 ATPaz ya da in-frame, N-terminal FLAG epitop etiketi olan memeli ifade vektörü pcDNA5 / FRT içine bir INO80 alt birimini kodlayan cDNA klonu. </li><li> Devam etmeden önce, DNA dizilimi yolu ile eklenen cDNA dizisini doğrulamak. </li><li> Transfeksiyon gerçekleştirmek için, DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı),% 5 glutamin ihtiva eden bir ortam içinde 10 cm doku kültür tabaklarında HEK293 hücrelerinde FLP-büyür ve% 10 FBS (fetal inek serumu). </li><li> Hücreler,% 70 ortak akışkanlığa ulaştığında, toplam hacim içinde, her bir doku kültür tabağına FuGene ™ 6 Transfeksiyon ayıracı 40 ul, uygun pcDNA5 / FRT ekspresyon plazmidi, 0.5 ug, ve Flp rekombinaz kodlayan pOG44, 9.5 ug oluşan bir karışım eklemek 800 ul. </li><li> 48 saat sonra, trypsinize ve s01:30 plit 10 cm çanaklara doğru bir oranda hücre ve% 5 glutamin,% 10 FCS içeren DMEM içinde onları büyümeye ve 3 için 100 ug / ml higromisin B - 4 hafta. (- 5 gün genellikle her 3) o sararmaya başlar her kültür ortamı değiştirin. </li><li> FLAG-etiketli proteinin en yüksek seviyede ifade eden pozitif klonların belirlenmesi için, tek tek higromisin B-dirençli koloniler seçmek ve bir 24-çukurlu plaka tek bir kuyusuna transfer edin. <ol><li> Hücreler 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile ~ 1 ml PBS ve pelet içinde, her bir oyuktan% 80 ortak akışkanlığa, hasat hücrelere ulaşır. </li><li> Süpernatanın ayrılmasından sonra, SDS-PAGE numune tampon maddesi, 60 ul hücre pelletini. </li><li> SDS sayfa ve FLAG ifadesini izlemek için blot için yeniden süspanse hücre pelet Konusu yarısı yem proteini etiketlendi; gelecek analizleri için diğer yarısını kaydedin. </li></ol></li><li> Herhangi bir FLAG-etiketli insan Ino80 protein hücre lizatlarında tespit edilirse, başlangıç ​​klonal hücre popu genişletmek15 cm doku kültür kaplarına bir 24-çukurlu plaka tek kuyulardan hücreler kaplanarak daha da lasyon. <ol><li> 15 cm&#39;lik kaplar, 50 ml&#39;lik bir konik tüp buz gibi soğuk PBS ile kaynaşık hücrelerin yakınındaki tekrar süspansiyon ve transferi hücreleri hasat etmek. </li><li> Ek PBS eklenerek 50 ml&#39;lik bir son hacme getirmek. </li><li> Pelet 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de hücreleri ve süpernatan mümkün olduğu kadar çıkarın. </li><li> Lys450, 1 ml tampon içinde hücre pelletini (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.9, 450 mM NaCI tekrar süspansiyon,% 0.5 Triton X-100, 10 mM KCI, 4 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA,% 10 gliserol, 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli). NOT: Burada ve başka yerlerde, her zaman hemen bir deney başlamadan önce tamponlar DTT, PMSF ve proteaz inhibitörü kokteyl ekleyin. </li><li> İmmüno-çökelti, anti-Flag agaroz jeli 20 ul kullanılarak elde edilen bütün hücre lizatı proteinleri FLAG-etiketli ve Western lekeleme yolu ile FLAG sıvı kısımlar analiz eder. [Immun ayrıntıları içinoprecipitation prosedürü, adım 5. bakınız] </li></ol></li><li> İstediğiniz klonal hücre hatları 12 dondurulmuş stokları hazırlayın ve kullanılıncaya kadar sıvı azot içinde saklayın. </li></ol> Rulo şişeler 2. Büyüyen HEK293 Hücre Hatları INO80 komplekslerin büyük ölçekli hazırlanması için, hücreler kültür içinde 10 - 20 silindir şişeler; her yuvarlanır şişeye tipik bir verim paketlenmiş hücre ~ 1 ml&#39;dir. <ol><li> Her bir silindir için bir şişe, higromisin B olmadan 200 mi DMEM,% 5 glutamin, ve% 10 dana serumu, ekleme </li><li> Her silindir bir şişe içine tek Yakın-konfluen 15 cm&#39;lik tabağı alınan hücrelerin tüm aktarma </li><li> Yer rulo 37 ° C inkübatör içine silindir şişe şişeler, 0.2 rpm&#39;de döndürün. </li><li> Hücreler ~% 70 confluency ulaştığınızda, kapalı dökün ve orta atın. </li><li> Her şişeye ~ buz 50 ml soğuk PBS ilave edin. Şişe Holding yatay, yavaşça hücre tek tabaka gevşetmek için girdap. </li><li> 250 mi plast üzere yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarınic konik şişeleri ve buz üzerinde yer. </li><li> Ek PBS ile silindir şişe durulayın biberon şişesi sırayla aktarma. Çalkalama solüsyonu, artık kesin (tipik olarak yaklaşık 5 şişe yıkamak için kullanılan sonra değil), hücre süspansiyonu ekleyin. </li><li> 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Yavaşça, PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon tek bir 250 ml&#39;lik konik şişe içine bunları birleştirmek ve daha fazla işlem kadar buz üzerinde tutmak. </li></ol> Başka bir FLAG-etiketli INO80 alt birimini ifade eden hücrelerde INO80 Altbirimlerin 3. siRNA aracılı Nakavt Tek bir alt birimini eksik INO80 subcomplexes elde etmek için, kullanım FLAG immünolojik stabil bir şekilde eksprese eden shRNA, siRNA ile muamele edilmiş hücreler ya da hücrelerden INO80 kompleksleri arıtılması kolaydır. (Küçük müdahale RNA) transfeksiyon protokolü burada açıklanan &quot;ters&quot; SiRNA 15 cm yemekleri büyüyen HEK293 hücreler için optimize edilmiştir. Protokol hücreler ve sho tek bir 15 cm çanak içinULD gereken hücre sayısına bağlı olarak buna göre ölçeklendirilebilir. SiRNA ile muamele edilmiş hücrelerden INO80 kompleks biyokimyasal olarak faydalı miktarlarda hazırlanması için, tek bir 40 15 cm tabaklarda büyüyen kültürlerden kadar büyütülebilir edilmelidir; paketlenmiş hücre peleti 4 ml - yaklaşık 2, bu verecektir. <ol><li> Stabil 15 cm yemekleri yakın confluency INO80 kompleksinin istenen alt birimi ifade HEK293 hücreleri büyümek. </li><li> SiRNA yeniden süspansiyon tamponu hacmi ekleme (20 mM KCI, 6 mM HEPES pH 7.5, ve 0.2 mM MgCI2), yeterli liyofilize siRNA içeren bir tüpe siRNA bir 50 uM stok solüsyonu hazırlanır. Çözelti pipetle yukarı ve aşağı birkaç kez ve siRNA tamamen eritilir sağlamak için, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe nutator. </li><li> SiRNA&#39;ları ve transfeksiyon ayıracı içeren bir transfeksiyon kokteyl hazırlayın. Çok hafif bir karıştırma ile İndirgenmiş Serum Ortamı 32 ul Lipofektamin RNAiMAX ile 50 uM siRNA stok çözeltisi 10 ul karıştırın ve Opti-MEM, 4 ml eklemek; alDüşük bütün maddeler kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini. </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> Stabil olarak transfeksiyon için, istenen alt-birimini eksprese INO80 Flp olarak HEK293 hücrelerinin hazırlayın. <ol><li> Aşama 3.4 İnkübasyon sırasında, RT kez PBS ile 15 cm tabaklarda hücreleri yıkayın. </li><li> Onlar plakayı kaldırarak başlar sadece kadar PBS çıkardıktan sonra, 1 ml tripsin hücreleri davranın. </li><li> Hemen hücreler tripsinize edildi ve hafifçe karıştırmak için, tam bir ortamda (DMEM +% 5 glutamin +% 10 FBS), 10 ml ilave ediniz. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplanır. </li><li> ~ 4 mi, tam bir ortamda hücre pelletini ve bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı yeniden süspanse. </li><li> ~ 5.4 x 10 6 / ml &#39;lik bir konsantrasyonda komple ortam hücreleri seyreltin. </li></ol></li><li> Her 15 cm çanak, 4 ml transfeksiyon kokteyl ardından 15 ml tam bir kültür ortamı ekleyin. Thoro olan orta ve transfeksiyon kokteyl sağlamak için yavaşça karıştırınızughly karıştırılır. Son olarak, eşit hücrelerini dağıtmak için hafifçe girdap tekrar hücre süspansiyonu ekleyin ve bir ml. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde kültür 60 saat sonra, yavaşça ortam, buz gibi soğuk PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak ve çekirdek özütleri hazırlamak için hemen devam edin. </li></ol> Nükleer özler 4. hazırlanması Bu prosedür, Dignam 13&#39;teki protokole göre modifiye edilmiş ve hücre pelletleri başlangıç ​​boyutuna bağlı olarak da aşağı yukarı ölçekli edilebilir. Tipik haliyle, paketlenmiş hücre topağı verimi nihai nükleer ekstre 1 ml 1 ml. Tüm tamponlar buz soğuk olması ve uygun bir soğuk oda mevcut değilse, bütün aşamalar, soğuk bir odada veya buz üzerinde yapılmalıdır. <ol><li> Çekirdekler izole edilmesi: <ol><li> Yavaşça 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de (15 veya 50 mi) uygun boyutlu bir hücrelerin konik bir tüp içinde ve spin mezun aktarın. </li><li> Süpernatantı ve paketlenmiş hücre pel hacmini ölçmeklet. Paketlenmiş hücre 1 mi, 3 x 10 ~ 8 HEK293 hücrelerine karşılık gelir. </li><li> 5 paketlenmiş hücre Tampon A hacimleri (: 1.000 proteaz inhibitör kokteyl, 10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI ve taze 1 mM DTT, 200 uM PMSF ilave edildi ve 1) ekleyin. Nazik pipetleme hücre pelletini. </li><li> Tam 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de, hücreleri topaklamak ve supernatant çıkarın. </li><li> Hücre topağı büyüklüğü Tampon A&#39;da inkübasyon sırasında 2 katı kadar artmalıdır </li><li> Tampon A&#39;nın iki paketlenmiş hücre hacimleri hücrelerin tekrar ve uygun büyüklükte bir Dounce doku homojenleştirici için hücre süspansiyonu aktarın. Paketlenmiş hücre az 2 ml ile başlanırsa, bir 7 ml homojenleştirici kullanılması; 2 - 4 ml dolu hücreler, 15 ml homojenleştirici kullanın; ve paketlenmiş hücreler 10 veya daha fazla ml, 40 ml homojenleştirici kullanılır. </li><li> Dounce homojenleştirici un SERBEST cam havan eli ile hücre süspansiyonu homojenizeHücrelerin% 90 til% 1 tripan mavisi ile pozitif leke. </li><li> JA-17 rotor içinde ya da benzer, 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 25,000 xg&#39;de 45 mi, yüksek hızlı santrifüj tüpüne ve spin süspansiyonu aktarın (Malzeme / donatım arasında Tablo). </li><li> Nükleer pelet kaynaktan, sitosolik proteinler veya parçalama sırasında çekirdek dışarı sızmasını protein içeren süpernatant, kaldırın. </li></ol></li><li> Tuz ile çekirdekleri ayıklanıyor: <ol><li> Ekleme Tampon C (20 mM HEPES, pH 7.9,% 25 gliserol, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA ve taze eklenmiş 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli), nükleer pelet; paketlenmiş hücre hacmi (~ 1 x 10 9 hücre) başlayan her 3 ml 2.5 ml Tampon C kullanın. </li><li> Bir cam çubuk ya da bir pipet kullanarak, borunun çeperinden nükleer pelet çıkarmak ve bir uygun büyüklükte bir Dounce homojenleştirici Karışımın tamamını aktarın. </li><li> TH homojenleştirilmesiyle çekirdekleri yeniden süspanseBir SERBEST havan eli, iki vuruş ile e karışımıdır. </li><li> Soğutulmuş bir behere yeniden süspansiyon haline getirilmiş çekirdek fraksiyonu aktarın. Süspansiyon derin en az 0.5 cm kabı dolduracak şekilde bir beher seçin. </li><li> Yavaşça buz üzerinde, bir pipet veya cam çubuk ile süspansiyon karıştırılırken kromatin veya diğer bir çözünür yapıları nükleer proteinlerini ekstre etmek için, kademeli olarak 5 M NaCl damla damla 0.42 M NaCI süspansiyonun tuz konsantrasyonunu arttırmak; 5 M NaCl her eklendikten sonra, çözelti, çok zor akışlı ya da jel benzeri bir hale gelmelidir. M NaCI, aşağıdaki formüle göre, 0.42 M NaCI nihai konsantrasyon elde edilecek şekilde bir çözüm getirmek için gerekli 5 hacim hesaplanır: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" /></li><li> Dikkatle Tip 45 Ti o bir Tipi 70.1 Ti rotor için 10 ml&#39;lik polikarbonat tüp içine viskoz süspansiyon aktarın (veya eşdeğeri) veya 70 ml polikarbonat şişelerbenzer rotor (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) r. 70 ml şişe kullanıyorsanız 10 ml tüpler kullanarak veya kapak takımı ile eğer parafilmle sıkıca kapatılmalıdır. </li><li> Yavaş yavaş Nutator ile 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de kapalı tüpler sallayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 120,000 x g&#39;de, Tip 45 Ti veya 30 dakika boyunca 70.1 Ti rotor içinde örnekleri dönerler. </li><li> Tek bir plastik tüp veya şişe süpernatant aktarın. Bu yüzer madde çekirdek ekstraktı, ve topak kromatin ve diğer nükleer artıkları içerir. </li><li> , Elverişli ölçülü kısma bölün nükleer ekstre sıvı azot içinde dondurularak ve -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> İnsan ya da INO80 INO80 subcomplexes 5. immün afinite temizliği <ol><li> Dondurulmuş nükleer ekstre çözülme için, donmuş madde kadar el arasında tezgah üstü ya da hareket borular üzerindeki özü içeren bir yer tüpleri, bir bulamaç haline gelir. Özü tamamen t kadar Sonra buz üzerinde veya soğuk odada tüplerihawed. </li><li> Donma-çözülme devresi sırasında oluşabilen çökeltinin ayrılması için bir Tip 70.1 Ti rotor veya eşdeğeri, 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 100,000 x g&#39;de 10 mi çözülmüş nükleer polikarbonat ultra santrifüj tüplerine çıkarma ve döndürme aktarın. </li><li> 15 ml konik tüp süpernatant aktarın. 1000 Proteaz İnhibitörü Kokteyli: 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1 nihai konsantrasyonlarda taze DTT PMSF ve protease inhibitör karışımı ekleyin. </li><li> , Immün-anti-FLAG agaroz hazırlamak uç temiz bir bisturi ile kesilip edilmiş olan bir ucu olan bir P200 ya da benzer bir pipet kullanılarak bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne anti FLAG agaroz taneleri% 50 bulamaç 200 ul aktarmak veya jilet. </li><li> 30 saniye için 8000 x g hızında çalışan tezgah üstü bir mikrosantrifüj içinde santrifüjleme ile boncuk Pelet. Süpernatantı, Lys450 ve 1 ml tampon içinde süspansiyon haline getirilerek boncuk boncuk yıkayın ve 30 saniye boyunca 8000 x g&#39;de boncuk pelet. B yıkayıniki kez daha EADS. </li><li> Uç temiz bir bisturi ya jilet ve aynı ucu kullanılarak transfer ile kesilmiş olan başka bir ucu ile bir P200 ya da benzer bir ayarlanabilir hacimli bir pipet kullanarak nükleer ekstre yaklaşık 100 ul yıkanmış anti FLAG agaroz boncuk tekrar Ekstraktı içeren 15 ml&#39;lik konik tüpe yeniden süspansiyon haline boncuk. Boncuklar her 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer edilmiştir kadar birkaç kez tekrarlanır. </li><li> Laboratuar rotator yavaş dönme ile, 4 ° C de 4 saat boyunca özü / boncuk karışımı inkübe edin. İSTEĞE BAĞLI: DNA safsızlığı uzaklaştırmak için 25 ünite / ml arasında bir konsantrasyonda Benzonase Dahil. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile FLAG agaroz toplayın. </li><li> 10 mi Lys450 içinde süspanse yıkama, nazik bir nutator sallanarak 4 ° C&#39;de 5 dakika inkübe etmek. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de boncuk Pelet. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Lys450 ve transfer boncuk 150 ul - 100 süspanse edin. Coher boncuk mikrosantrifüj tüpüne aktarılmış kadar Lys450 150 ul - ntinue 100 ile 15 ml konik tüp durulayın. </li><li> Bir mikrosantrifüj içinde 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 8000 x g&#39;de boncuk aşağı dönerler. 1ml EB100 tamponu (10 mM HEPES pH 7.9,% 10 gliserol, 100 mM NaCl, 1.5 mM MgCI2,% 0.05 Triton X-100 ve taze eklenmiş 1 mM DTT, 200 uM PMSF ile bir defa 1 mi Lys450 ile üç kat daha fazla yıkayın ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli). </li><li> , Bağlı proteinleri elüte 0.25 mg / ml 1 x FLAG peptidi içeren 200 ul tampon EB100 ekleyin. Bir nutator 4 ° C&#39;de her biri 30 dakika inkübe edin. </li><li> Bir mikrosantrifüj içinde 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 8000 x g&#39;de boncuk Pelet. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne, taşınan INO80 kompleksini içeren süpernatant aktarın. </li><li> Elüsyon, dört kez daha tekrarlayın, ve tek bir tüpün içine tüm süpernatantlar bir araya getirirler. </li><li> Ayrıştırılan protein fraksiyonundan kalan FLAG agaroz taneleri uzaklaştırmak için,Boş bir dönüşlü kolonu eluatının geçmektedir. </li><li> Yıkanan protein fraksiyonu konsantre ~ 10 kat, ultra santrifüj filtre tertibatı (50,000 molekül ağırlıklı akış kesici) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. </li><li> FLAG peptidi uzaklaştırmak için, iki tuz giderme kolonlarından konsantre edilmiş protein fraksiyonu, sırasıyla geçer. </li><li> Sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C&#39;de saklanır, 20 ul alikotları saflaştırılmış, tuzdan arındırılmış protein parçasının bölün. </li><li> Gümüş lekeli jeller üzerinde veya western blotting ile INO80 veya INO80 subcomplexes altbirim kompozisyon analiz ve standartlar gibi bilinen konsantrasyonda rekombinant INO80 alt birimlerinden preparatlar kullanılarak yarı-niceliksel Western blotting ile bunların konsantrasyonlarını tahmin ediyoruz. </li></ol>

<ol>
	<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes,+Annual+Review+of+Biochemistry.">The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry.</a> 78, 273-304 (2009).</li><li>Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSA+domain+binds+nuclear+actin-related+proteins+to+regulate+chromatin-remodeling+ATPases.">The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases.</a> Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).</li><li>Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+remodelling+complex+involved+in+transcription+and+DNA+processing.">A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing.</a> Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).</li><li>Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+actin-related+proteins+in+ATP-dependent+chromatin+remodelling.">Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling.</a> Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex:+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling.">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li><li>Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombination:+developments+and+applications.">Site-specific recombination: developments and applications.</a> 5 (5), 521-527 (1994).</li><li>Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase-mediated+gene+activation+and+site-specific+integration+in+mammalian+cells.">Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells.</a> Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex.">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YY1+functions+with+INO80+to+activate+transcription.">YY1 functions with INO80 to activate transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).</li><li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Modes+of+Regulation+of+the+Uch37+Deubiquitinating+Enzyme+in+the+Proteasome+and+in+the+Ino80+Chromatin-Remodeling+Complex.">Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex.</a> Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).</li><li>Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+purification+of+FLAG+epitope-tagged+bacterial+alkaline+phosphatase+using+a+novel+monoclonal+antibody+and+peptide+elution,+Biotechniques.">Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques.</a> 16 (4), 730-735 (1994).</li><li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+cell+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei.</a> Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Yüksek Ökaryotlardaki çok altbirimli memeli kromatin remodeling komplekslerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar mutant birimlerini içeren veya tamamen belli altbirimden yoksun bu tür komplekslerin biyokimyasal yararlı miktarlarda hazırlanması zorluk tarafından engellenmiştir. İlk olarak, memeli hücrelerinde genetik manipülasyon teknik zorlu ve zaman alıcı olmuştur: teknik engellerin vardır. Genomu kolaylıkla Recombineering teknikler kullanılarak düzenlenebilir ve hedef olabilir, maya hücreleri...

Evrimsel olarak korunmuş SnF2 aile kromatin remodeling kompleksleri kromatin organizasyonu ve DNA erişilebilirlik 1 anahtar regülatörler. Bu kompleksler, remodeling, her zaman, bazı durumlarda, çeşitli yardımcı proteinleri ile toplanır ve çoklu alt birim makro-molekül yığınları oluşturan, merkezi bir SnF2 gibi ATPaz alt-birimi bulunmaktadır. ATP&#39;ye bağımlı kromatin yeniden modelleme süreci molekül ayrıntılarını incelemek için, bu komplekslerin faaliyetlerine alt birimlerde ve / veya alan yapı belirli alt-katkılarını anlamak önemlidir. Bu tür analizler, belirli bir protein alt birimleri veya alan yapı yoksun yüksek düzeyde saflaştırılmış mutan kompleksler üretmek üzere yeteneğini gerektirir. ATP-bağımlı kromatin yeniden şekillenme komplekslerinin mi yapı-fonksiyon çalışmalarını yaygın (ref 1-4, örneğin, bakınız) bağlı olarak maya genomuna üstün uygulanabılirliği için maya model sistem üzerine odaklanmıştır. Koruma verilmişortolog biçimlenme kompleksleri arasında birim bileşimi ve işlevsellik, yapısı ve maya yeniden şekillenme komplekslerinin işlevi çalışmalar yüksek ökaryotlar meslektaşlarıyla önemli bilgiler sağladı. Bununla birlikte, takdir türe özgü biçimlenme kompleksler arasında fark kazancı ya da korunmuş alt-birimlerinin korunmuş bölgeler içinde yer alan türe özel alt ünitesi, kazanç ya da korunmuş alt-birimlerinin türe spesifik etki kaybı ve dizi değişkenliğine kaybından kaynaklanan, mevcut. Bu tür farklılıklar prensipte yüksek ökaryotik hücreler yeni moleküler ve hücresel ortamlara uyum için ihtiyaç tarafından tahrik edilebilir. Değil, sadece mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir aynı zamanda ATP-bağımlı kromatin yeniden şekillenme sürecinin temel mekanizmalarına ışık tutuyor, ama çünkü Böylece, daha yüksek ökaryotik yeniden şekillenme komplekslerinin alt birimleri nucleosome yeniden şekillenme sürecine nasıl katkıda anlamak, değerli olan kromatin yapısı tarafından HIG ve gen ekspresyonuOnun ökaryotlar düzenlenir. Bugüne kadar, sadece biyokimyasal tanımlanan kromatin remodeling kompleksleri ve subcomplexes elde zorluklar nedeniyle kısmen çoklu alt birim memeli kromatin remodeling komplekslerinin yapısal ve işlevsel çalışmalar, orada sınırlı kalmıştır. Bu kısmen immün afinite temizliği kararlı bir şekilde N-terminal FLAG epitopu yabani tip ya da mutant Ino80 5-7 sürümlerini etiketli ifade eden insan hücrelerinden sağlam INO80 veya INO80 subcomplexes hazırlamak için kullanıldığı aşağıda tarif edilen prosedürler ile, bu zorlukların şekilde alt (Şekil 1) . Insan hücrelerinden gelen sağlam INO80 kompleksleri elde etmek için, Flp aracılı rekombinasyon kararlı biçimde INO80 kompleksinin alt-birimleri kodlayan 8-10 FLAG epitopu etiketli cDNA&#39;larını ifade eden transgenik HEK293 hücre soyları meydana getirmek için kullanılır. INO80 alt birimlerinin aşırı ifadesi biraz toksik olduğundan, izole ve seçici kılıfı altında klonal hücre hatları korumak için gerekli olanşulları büyük ölçekli hücre kültürleri genişlemesi için gerekli olan bir çok geçitler boyunca sabit transgen ekspresyonunu sağlamak. Alt birimlerin yalnızca bir alt kümesini içeren küçük INO80 subcomplexes elde etmek için, biz başarılı iki yaklaşım kullanılmıştır (Şekil 2A, B). İlk olarak, belirli bir stably alt birimden 5 ile etkileşim için gereken etki eksikliği Ino80 mutant sürümlerini ifade eden HEK293 Flp olarak hücre hatları oluşturmak. Seçenek olarak ise, siRNA aracılı yok etme, uygun bir FLAG-etiketli INO80 alt birimini (yayınlanmamış veriler) ifade eden hücrelerden istenen alt birimi tüketmek için kullanılır. Son olarak, insan INO80 kompleksleri arıtmak için BAYRAK agaroz kromatografisi göre 11 etkili bir şekilde saflaştırılmış INO80 veya INO80 subcomplexes içeren son fraksiyon sitosolik proteinler kirletici varlığının azaltılması, nükleer ekstreler bir INO80 içeren fraksiyonun zenginleştirmek için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I (stablized glutamine)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SAFC</td><td>12176C</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE6 transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B, sterile in PBS</td><td>AG Scientific</td><td>H-1012-PBS</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA5/FRT vector</td><td>Life Technologies</td><td>V6010-20</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In HEK293 cells</td><td>Life Technologies</td><td>R780-07</td><td></td></tr><tr><td>pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td><td>Life Technologies</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>calf serum</td><td>SAFC</td><td>12138C</td><td></td></tr><tr><td>TARGETplus SMARTsiRNA pool</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA resuspension buffer</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>#B-002000-UB-100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>51985-091</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>45000</td><td>VWR</td></tr><tr><td>TrypLE (trypsin)</td><td>Life Technologies</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>1x FLAG Peptide</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Chromatography Column</td><td>Bio-Rad</td><td>737-5021</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td><td>Amicon</td><td>UFC805024</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Zeba Desalting Columns</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>benzonase</td><td>Novagen</td><td>70664</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339080</td><td></td></tr><tr><td>JA-17 rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>10 ml polycarbonate tubes</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>70 ml polycarbonate bottles</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355655</td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Type 70.1 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Nutator Mixer</td><td>BD Diagnostics</td><td>15172-203</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Glas-Col Tube/Vial Rotator</td><td>Glas-Col</td><td>099A RD4512</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermal cycler PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>roller bottle incubator</td><td>Bellco biotechnology</td><td>353348</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

INO80 kromatin remodeling kompleksleri ATP-bağımlı nucleosome biçimlenme katalize ederek nucleosome dinamikleri ve DNA erişilebilirlik düzenler. İnsan INO80 kompleksleri Ino80, katalitik alt birim ve oluşan komplekslerin montajı için yapı iskelesi olarak hizmet, çok SnF2 gibi ATPaz&#39;ın 14 de dahil olmak üzere protein alt birimlerinin oluşur. Diğer alt birimlerin İşlevleri ve INO80 Kompleksin kromatin remodeling etkinliğine katkıda hangi mekanizmalar kötü nedeniyle insan hücreleri veya heterolog ifade sistemlerinde INO80 altparçadan üretme meydan kısmen anlaşılamamaktadır. Bu protokol, JOVE alt birimi ya da alt üniteler bir alt eksik insan INO80 kromatin yeniden şekillenme subcomplexes saflaştırılmasını sağlayan bir prosedür tarif etmektedir. N-terminal FLAG epitopu Ino80 cDNA, kararlı bir şekilde insan embriyonik böbrek (HEK) Flp aracılı rekombinasyon kullanılarak 293 hücre hatları içine yerleştirilen etiketlendi. INO80 kompleksinin alt-birimden oluşan bir alt grup b olduğu takdirdeE olanların bir alt birimlerinin montajı için gerekli platformu eksikliği yerine mutant Ino80 proteinleri ifade, silindi. Durumunda bağımsız bir alt-birimi tükeneceği için, kararlı bir şekilde ifade eden bir FLAG HEK 293 hücre hattı, bu alt-birimini hedef bir transfects siRNA&#39;lar Ino80 ATPaz etiketlendi. Nüklear özütler hazırlandı edilir ve FLAG immüno Ino80 türevlerini ihtiva eden protein fraksiyonları zenginleştirmek için gerçekleştirilir. Saflaştınldı INO80 subcomplexes bileşimleri daha sonra, immüno-lekeleme, gümüş boyama ve kütle spektrometrisi gibi yöntemler kullanılarak analiz edilebilir. Bu protokole uygun olarak elde edilen ve INO80 INO80 subcomplexes buradan sonra, ekteki JOVE protokolde tarif edildiği çeşitli biyokimyasal tahlilleri kullanılarak analiz edilebilir. Burada açıklanan yöntemler herhangi bir memeli çoklu alt birim kromatin yeniden yapısal ve fonksiyonel özellikleri ve değiştirme çalışmaları kompleksleri için adapte edilebilir.

Şekil 1 oluşturmak arındırmak ve insan INO80 ATP&#39;ye bağımlı kromatin yeniden şekillenme kompleksleri karakterize etmek için kullanılan prosedürleri özetleyen bir akış şemasını göstermektedir. Şekil 2 ve 3&#39;te gösterildiği gibi, bu işlemler böylece INO80 ait enzimatik aktivite için bu alt-birimlerin eksik katkı müteakip biyokimyasal analizler sağlayan çeşitli altbirimleri taşımayan vahşi tip INO80 ve INO...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes at JoVE.com

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Bu protokol oluşturulması ve vahşi tip ve insan INO80 kromatin yeniden şekillenme kompleks mutant versiyon saflaştırılması için bir yöntem tarif etmektedir. Epitop INO80 alt birimlerinin versiyonları kararlı biçimde HEK293 hücrelerinde ifade edilir ve alt birimlerinin kümelerini yoksun tam kompleksleri kompleksleri ve bağışıklık yakınlık kromatografisi ile etiketlenmiş.

Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

generation-purification-human-ino80-chromatin-remodeling-complexes

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

9.8K Görüntüleme.  Stowers Institute for Medical Research.  Bu protokol oluşturulması ve vahşi tip ve insan INO80 kromatin yeniden şekillenme kompleks mutant versiyon saflaştırılması için bir yöntem tarif etmektedir. Epitop INO80 alt birimlerinin versiyonları kararlı biçimde HEK293 hücrelerinde ifade edilir ve alt birimlerinin kümelerini yoksun tam kompleksleri kompleksleri ve bağışıklık yakınlık kromatografisi ile etiketlenmiş. 

Video: Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Genetik

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Biyokimya

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Biyoloji

Maya Hücrelerinden Locus'a Özgü Kromatin İzolasyonu

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

Yazar Spotlight: Kromatin Araştırmalarını Geliştirme ve Yüksek Zenginleştirme Locus'a Özgü Kromatin İzolasyon Protokolü ile Sınırlamaların Üstesinden Gelme 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir