Name: sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes
Uploaded: 2017-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes at JoVE.com

Bu eser kanser için bir V bilim adamı Ödülü (V2014-004) ve V bilim adamı artı Ödülü (D2016-030) kanser araştırmaları için V Vakfı ve bir Amerikan Kanser Derneği kurumsal araştırma bursu (ACS IRG Grant 58-006-53) Purdue Üniversitesi Merkezi tarafından desteklenmiştir Araştırma. E. G. s. Borch lisansüstü Bağış Ödülü Purdue Üniversitesi tıbbi kimya ve moleküler Farmakoloji bölümü tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlıklar <ol><li>Hipotonik eriyik arabellek A: 0,3 M hazırlamak 100 mL sukroz, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA ve % 0,5 NP-40. 4 ºC mağaza. 
	Not: HEK293T gibi bazı hücre hatları daha az sıkı lysing koşullar gereklidir. Çekirdeği kolayca parçalayıcı, değiştirilme tarihi arabellek A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0.05 mM EDTA, % 0,1 NP-40 ve %10 gliserol kullanın.</li>
	<li>2 x mRIPA çözüm 250 mL stok çözeltisi hazırlamak: 100 mM Tris pH 8.0, % 2 NP-40 ve %0,5 sodyum deoxycholate.</li>
	<li>100 mL stok 5 M NaCl çözeltisi hazırlamak.</li>
	<li>2 x mRIPA ve 5 M NaCl çözümleri, kullanarak hazırlamak 50 mL 1 x mRIPA çözeltisi her altı tuz konsantrasyonu için: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM ve 500 mM NaCl. Denemeyi başlatmadan önce serin buz üzerinde tüm çözümler</li>
	<li>Grow hücre satırları istenen koşullar altında. 
	Not: bir protein vurma etkilerini belirlerken, SSE devirme satırı için wildtype hücrelere kıyasla gerekir. Bu SSE yan yana gerçekleştirilmelidir. Kimyasal inhibitörleri ya da bir çekim gücü kullanan örnekler için 3-5 bölümlerine bakın.</li>
</ol> 2. Temel sıralı tuz çıkarımı her <ol><li>hasat 8 milyon hücre durumu ve yıkama buz soğuk PBS ile iki kez 5 mL. 
	Not: Eşit eşdeğer protein konsantrasyonları için hücre sayısı için önemlidir. Sayısına sahip hücreleri tek hücre satırları veya belirli proteinler için optimize edilmiş olması gerekir. Yok ki çok fazla protein konsantrasyonları artış gözlem denge bağlama üzerinde bağlıdır elüsyon eğrinin engeller gibi. Ancak, çok az hücrelerle olabilir eğri algılamak için yeterli protein ve Kromatin Pelet için zordur yalıtmak ve kesirler arasında kaybolabilir.</li>
	<li>Hücreleri arabelleği A 1 mL + proteaz inhibitörleri yeniden askıya alma, 1,5 mL mikro santrifüj tüpleri ve 10 dakika süreyle 4 ° C'nin altındaki döndürme üstünden içine transfer</li>
	<li>Tarafından Santrifüjü 6000 x g 4 ºC, 5 min için de çekirdeklerin yalıtmak. 
	Not: bu adımdan sonra nükleer zarf hala bozulmamış olması gerekir. Nükleer zarf sağlamsa, pelet tamamen yeniden askıya alacak; Ancak, zaman zarfı lysed ve Kromatin yayımlanır, pelet yeniden askıya alacak değil. Nükleer zarf arabellek A kuluçka sonra sağlam değilse, modifiye tampon A. kullanmak</li>
	Her hücre çekirdeği pelet pelet yeniden askıya almadan önce için <li>eklemek 200 µL mRIPA 0 mM NaCl + proteaz inhibitörleri. Her örnek 1 mL pipet ile 15 kez pipetting tarafından lunaparkçı. Pelet kolayca yeniden askıya, ancak, çekirdekleri gibi bu pipetted ve örnek olacak kalın ve yapışkan ve pipet zor koşullar.
	<ol>Kadar Pelet ucunu çekmek, pipet ucu santrifüj tüpü dibine karşı sonuna dokunun için <li>. Pelet tam olarak bir kez DNA çekirdeklerin serbest, ama pipetting kıracak o yukarıya eriyecektir değil</li>
	</ol></li> <li>Ne zaman tüm örnekleri homojenize, kuluçkaya buz 3 dakika süreyle tüm örnekleri 
	Not: Kuluçka zaman faiz protein bağlı olarak en iyi duruma getirilmiş gerekebilir.</li>
	<li>Örnekleri için 4 ºC de 6500 x g, 3 dk centrifuging tarafından ayrı tut moduyla Kromatin Pelet.</li>
	<li>Transfer süpernatant temiz 1.5 mL santrifüj için tüp. Bu 0 mM kesir olacak. Bu 0 mM mRIPA çözüm çekirdeklerin lizis bir yıkama adım olarak hareket edebilir ve herhangi bir gevşek proteinleri Kromatin ile ilişkili olmayan kaldırmak.</li>
	<li>Eklemek 200 µL mRIPA 100 mM NaCl + proteaz inhibitörleri her Kromatin pelet pelet yeniden askıya almadan önce için. Kromatin pelet pelet yukarı ve aşağı 15 kez pipetting tarafından kırmak. 
	Not: Bu kaç kez Pelet içinde pipetted ile tutarlı olacak şekilde önemlidir.</li>
	<li>Incubate 3 dakika buzda. Bu kuluçka adım ne zaman birden çok örnekleri var özellikle önemli olan bir denge durumu ulaşmak tüm örneklerini sağlar.</li>
	<li>3 dk 4 ºC ve süpernatant temiz 1.5 mL tüp transferi için 6500 x g, santrifüj.</li>
	<li>Tekrar 2.6-2,10 için kalan tuz konsantrasyonları. 
	Not: 400 mM NaCl sonra mRIPA Pelet aptallar ve açık olmalı ve tüp alt kısmında kalmak olmaz. Pelet santrifüj tüpü izole süpernatant süre kapağı yerleştirilebilir.</li>
	<li>4 protein yükleme x 70 eklemek µL boya her bölümü için ve her kesir bir SDS Akrilamid jel western blot analizi için üzerine 30 µL yük. 
	Not: bağlama profil protein belirlemek için bu lysate yerine, yükleme eşit protein konsantrasyonları eşdeğer miktarda yüklemek için önemlidir.</li>
	<li>Standart bir western blot bir membran transfer ederek gerçekleştirmek ve faiz proteinler için birincil antikorlar kullanın.</li>
	Kromatin eluted protein quantitate <li>kuluçkaya kızılötesi floresan IRDye ikincil antikorlar blot ve görüntü leke bir Görüntüleyici ile. Diğer yöntemleri geliştirme kullanılabilir ise, doğada daha nicel olarak floresan veya kızılötesi görüntüleme öneririz.</li>
	<li>Kullanım ImageJ veya benzer yazılım yoğunluğu her tuz konsantrasyonu eluted protein için hesaplamak için. Grup yoğunluğu tuz konsantrasyonu karşı grafiklerini çizerek, elüsyon desen senin protein ilgi belirlenebilir.</li>
</ol> 3. Sıralı tuz çıkarımı varlığı bir &#34; okuyucu &#34; inhibitörü <ol><li>iki hücre (4 milyon) hasat ve çekirdeklerin olduğu gibi standart bir SSE yalıtmak.</li>
	<li>Her iki mRIPA 0 mM NaCl 200 µL içinde yeniden askıya alma ve kuluçkaya 3 dakikadır. Bu çekirdeklerin ücretsiz herhangi bir protein kaldırılması için sağlayacaktır.</li>
	<li>Eklemek 200 µL mRIPA 0 mM NaCl her Pelet için. İnhibitörü (1 mm (+) JQ1 2 µL) bir örnek ve DMSO denetim kümesine ekleme.</li>
	<li>Propaganda pelet tarafından 15 kez pipetting ve 5 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya</li>
	<li>3 dk 4 ºC ve süpernatant temiz 1.5 mL tüp transferi için 6500 x g, santrifüj.</li>
	<li>3.3-4 için tuz konsantrasyonları tekrarlayın ve standart Batı leke gerçekleştirmek.</li>
</ol> 4. Sıralı tuz çıkarımı varlığı bir &#34; yazar &#34; inhibitörü <ol><li>tedavi inhibitörü (10 µM SAHA) içeren hücreleri veya DMSO 3 h. için</li>
	<li>Her tedavi için 4 milyon hücre hasat.</li>
	<li>İçin tüm arabellekleri eklendi inhibitörü ile örnekleri için standart bir SSE gerçekleştirmek.</li>
</ol> 5. Sıralı tuz ayıklama aşağıdaki DNA hasar <ol><li>1 µM doksorubisin 1 h. için hücrelerle tedavi</li>
	<li>Hücreleri medyada değiştirmek ve onları için 3 h. kurtarmak izin</li>
	<li>8 milyon hücre hasat ve temel SSE gerçekleştirmek.</li>
</ol> 6. Sigara sıralı tuz çıkarma <ol><li>12 milyon hücre hasat ve yıkama PBS ile.</li>
	<li>Bölmek hücreleri böylece mikro santrifüj tüpü başına 2 milyon hücre.</li>
	<li>Arabellek A 500 µL içinde yeniden askıya alma ve 10 dk. için kuluçkaya</li>
	<li>Çekirdeklerin Santrifüjü 6000 x g. adlı tarafından izole</li>
	<li>Yeniden askıya 200 bir µL her mRIPA arabellekleri + NaCl unsurlardandır.</li>
	<li>1 mL pipet ucu ile 15 kez pipetting tarafından her örnek lunaparkçı.</li>
	<li>Incubate on Ice 3 dakika süreyle</li>
	<li>Tarafından Santrifüjü 6500 x g, Kromatin yalıtmak ve tüpler temizlemek için süpernatant aktarın. Boya yükleme 70 µL ekleyin ve western blot analizi için SDS-sayfa jel 30 µL çalıştırın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome.">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., C&#244;t&#233;, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho+switch+triggers+brd4+chromatin+binding+and+activator+recruitment+for+gene-specific+targeting.">Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting.</a> Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).</li><li>Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+bromodomains+of+Polybromo-1+contribute+to+chromatin+association+and+tumor+suppression+in+clear+cell+renal+carcinoma.">Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma.</a> J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+complexes--many+combinations,+many+functions.">Polycomb group complexes--many combinations, many functions.</a> Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+BET+bromodomains.">Selective inhibition of BET bromodomains.</a> Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+recognition+and+large-scale+structural+analysis+of+the+human+bromodomain+family.">Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family.</a> Cell. 149 (1), 214-231 (2012).</li><li>Sanchez, R., Zhou, M. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+bromodomains+in+chromatin+biology+and+gene+transcription.">The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription.</a> Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).</li><li>Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+DNA+torsion,+and+chromatin+dynamics.">Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).</li><li>Kakarougkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+PBAF+in+Transcriptional+Repression+and+Repair+at+DNA+Breaks+in+Actively+Transcribed+Regions+of+Chromatin.">Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin.</a> Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1/C2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin.">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Protein ve Kromatin etkileşimleri aracılığıyla tuz çekimi karakterizasyonu istihdam edilmiş bir ortak için onlarca yıl14,15yöntemidir; Ancak, bu sistematik olarak daha önce nedeniyle ortaya çıkarmak için optimize edilmiştir değil. Biz göstermek ne kadar hızlı ve ucuz bir şekilde protein veya çevre değiştirildiğinde Kromatin bağlama değişiklikleri ayırt etmek için sıralı bu yöntemi sağlar. Son derece uyumlu ve en iyi hale getirileb...

DNA düzenlemesi ökaryotik hücrelerde hücre içi ve hücre dışı uyaranlara yanıt koordine proteinler bir ürün yelpazesine tarafından sıkı bir şekilde kontrol karmaşık ve sofistike bir sistemdir. DNA Histon octamers gevşek DNA dağıtılmış veya sıkı bobinleri1sıkıştırılmış form oluşturarlar için etrafında sarılır. Bu Yapısal düzenleme DNA ve Histon okumanıza, yazmanıza ve sonrası translasyonel modifikasyonlar (PTM) Histon2silmek proteinlerin bir ağ tarafından düzenlenen Kromatin olarak bilinir. Asetilasyon gibi bazı Histon PTMs, amino asit onlar, Histon ve DNA2arasındaki etkileşim değiştiren yatırılan ücret değiştirin. Histon PTMs aynı zamanda transkripsiyon regülatör, Kromatin remodelers, DNA hasar onarım makineleri ve DNA çoğaltma makineleri genom3özel bölgeler için recruit hizmet.
Kromatin etkileşimleri çalışmak için pek çok yöntem küçük ölçekli etkileşimleri soruşturma veya büyük genom çapında analizleri dahil. Vitro bağlama çalışmalar genellikle bireysel rekombinant etki alanlarında Histon peptidler veya DNA deneyleri Elektroforez hareketlilik shift deneyleri (EMSAN), izotermal titrasyon Kalorimetre, Floresans polarizasyon ve peptid pulldowns gibi kullanmak. Bu deneyleri genellikle bir bireysel protein etki alanında odaklanmak çünkü onlar bulmaca küçük bir parça anlayış kolaylaştırmak, ama çok protein rollerini bırak, birden çok etki alanı proteinler kooperatif doğasını anlamak için bize izin verme kompleksleri. Başka tabaka-in karışıklık en memeli Kromatin değiştirme kompleksleri heterojen bileşimi tarafından eklenir. Bu protein heterojenite Kromatin peyzaj dinamik yapısı ile birlikte bu etkileşimleri Kromatin proteinleri Kromatin içinde vitroiçin bağlama vivo özetlemek için zor yapar.
Vivo yöntemler önemli gelişmeler yaptık; Ancak, pahalı, zaman alıcı ve teknik olarak zor çoğu zaman. Önemli optimizasyon4gerektirir ancak Kromatin immunoprecipitation (ChIP-seq) sıralama tarafından takip çok arasında soykırım, proteinler ve Histon değişiklikleri yerelleştirilmesini belirlemek için kullanışlıdır. Proteinler çoğu kez çapraz Kromatin etkileşimleri korumak için; Ancak, bu yapay etkileşimler oluşturabilir ve5maskeleme epitope neden olabilir. Ayrıca, immunoprecipitations (IP) çok özel antikorlar ve DNA kesme ve ChIP-qPCR genellikle kullanılabilir bir temanındeğildir bilinen bağlama sitesini kullanarak IP koşulları geniş optimizasyonu gerektirir. Optimizasyon çip koşullardan sonra işleme örnekleri maliyetlidir ve ay sıra ve analiz için birkaç hafta gerektirir. Bu yöntem çok değerli olmasına rağmen Kromatin lokalizasyonu tanımlamak için proteinler bağlı genom maliyet ve süre taahhüdü engelleyici küçük değişiklikler küresel bağlama özellikleri etkilemesi hakkında hipotezler oluşturmak için bu yöntemi kullanmak için yapmak .
Bu yazıda, sıralı tuz ayıklama (SSE) tahlil küresel bağlama profilleri Kromatin bağlı proteinlerin incelemek ve bir protein, karmaşık veya genel PTM profil değişiklikleri etkileşimleri nasıl değiştirebilir ayırt etmek için nasıl kullanılabileceği açıklanmaktadır. Tuz çekimi geniş ve yaygın olarak kullanılan bir teknik olmasına rağmen nasıl sıralı bu yöntem son derece tekrarlanabilir ve çok yönlü olduğunu göstermektedir. SSE için toplu Kromatin kompleksi'nın genel ilgi nasıl bir kompleks veya hatta tek bir etki alanında tek bir alt birim katkıda karakterize için bize izin verir. SSE bağlama bir protein Kromatin ortamındaki değişikliklerden ChIP-seq ve diğer genom geniş çalışmaları kullanarak doğruladı Histon işareti hedefleme için ilginç hipotezler sağlayan etkilenir eğer belirlemek için de kullanılabilir.
Aslında bu yöntem--dan Wu Polybromo1 işlevinin incelemek için vd., uyarlanmış (PBRM1) bağlama PBAF Kromatin remodeler6,7. Bu tekniği kullanarak, biz PBRM1 rolü için karmaşık remodeling PBAF Kromatin içinde Kromatin bağlamasını belirlenir ve bu işlev7altı bireysel bromodomains göreli katkısını belirledi.
Burada nasıl bir protein Kromatin çıkarılması bir kimyasal inhibitörü incelemek için benzer Kromatin kompleksleri, değiştirme göreli bağlama benzeşme değerlendirmek için farklı hücre tipleri bağlamasında Kromatin keşfetmek için bu yöntem en iyi duruma getirmek için açıklamak ve Kromatin bağlama Kromatin manzara için değişiklik sonra etkilerini belirlemek için.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, Crystal 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>8360-04</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &gt;=99.9% (titration), crystalline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>4931-02</td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td><td>Amresco</td><td>E109-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>GLYCEROL, 1L</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-690-032</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td><td>Cell Signaling</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>BMI-1 antibody</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBRM1 antibody</td><td>Bethyl</td><td>A301-591A</td><td></td></tr><tr><td>ARID1a antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32761</td><td></td></tr><tr><td>BRD4 antibody</td><td>Bethyl</td><td>A301-9852a</td><td></td></tr><tr><td>(+) JQ1</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>11187</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10009929</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>AK Scientific</td><td>25316-40-9</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Macron</td><td>4948-02</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini Gel Tank</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, Bovine (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100g</td><td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td></tr><tr><td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0001</td><td></td></tr><tr><td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td><td>Macron</td><td>3041-10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin kEDTA, 1X</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td><td>Amresco</td><td>0639-250G</td><td></td></tr><tr><td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td><td>Amresco</td><td>0227-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine,for electrophoresis, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898-1kg</td><td></td></tr><tr><td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L Pipet Tips</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125BOX</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>22035-0.005</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>APROTININ, 10 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>20550-0.01</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>PEPSTATIN A, 5 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>30100-0.005</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>OVCA429 cells</td><td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>McCoy&#039;s 5A media</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td><td>Corning Mediatech</td><td>50-011-PC</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>VWR Power Source</td><td>VWR</td><td>13-690-032</td><td></td></tr></tbody></table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

Aydınlatma proteinleri Kromatin hedefleme bağlama özellikleri Kromatin karmaşık doğası ve en memeli Kromatin değiştirme kompleksleri türdeş olmayan doğası nedeniyle çok zor olabilir. Bu engelleri aşmak için Kromatin-bağlı kompleksleri göreli bağlama benzeşim değerlendirmek için bir sıralı tuz ayıklama (SSE) tahlil adapte olması. Bu kolay ve basit tahlil sigara-uzmanlar tarafından benzeşme iki ilgili kompleksleri, benzeşim bir kompleks bir alt birim kaybolur veya bir etki alanı denetleyicisindeki inaktive değişimler ve değişikliği bağlama göreli farkı değerlendirmek için kullanılabilir bağlama benzeşme Kromatin manzara için değişiklik sonra. Sırayla tuz miktarda artan toplu Kromatin yeniden askıya tarafından biz Kromatin belirli bir protein elüsyon profil edebiliyoruz. Bu profilleri kullanarak, biz değişiklikler Kromatin değiştirme karmaşık veya değişiklikler Kromatin ortamına bağlama etkileşimleri etkilemesi tespit edebiliyoruz. SSE diğer içinde in vitro ve in vivo deneyleri ile kaplin, biz bireysel etki alanları ve proteinleri Kromatin ortamlarda çeşitli bir kompleks işlevselliğinin rolleri belirleyebilirsiniz.

Bu yazıda, avantajları ve uygulamaları edebiyat6adapte olması sık kullanılan sıralı tuz ayıklama (SSE) yöntemi göstermektedir. Şekil 1' de, biz proteinler ardışık olarak sigara ARID1a ve PBRM1 elüsyon şekillerinin algılayarak ayıklama SSE tekrarlanabilirlik karşılaştırın. Biz sürekli olarak ARID1a, BAF alt birimi, öncelikle 200 mM NaCl ve PBRM1, bir özel PBAF alt birim elutes, öncelikle 300 mM NaCl elutes g?...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes at JoVE.com

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

sequential-salt-extractions-for-analysis-bulk-chromatin-binding

Research

JoVE Journal

Genetics

8.3K Görüntüleme.  Purdue University. Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.

Video: Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetik

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Tıp

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Kanser Araştırmaları

Maya Hücrelerinden Locus'a Özgü Kromatin İzolasyonu

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

Yazar Spotlight: Kromatin Araştırmalarını Geliştirme ve Yüksek Zenginleştirme Locus'a Özgü Kromatin İzolasyon Protokolü ile Sınırlamaların Üstesinden Gelme 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Biyokimya

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Biyoloji

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde