Tümör ilişkili makrofajlar tümör mikroortamında önemli rol oynar. Tümör hücrelerindeki farklı genetik mutasyonların makrofaj alımını nasıl etkilediğini anlamak kanser hastaları için kişiselleştirilmiş tedavi nin tasarlanması için çok önemlidir. Bu tetki, tümör hücreleri ve makrofajlar in vitro arasındaki etkileşimi değerlendirmek için kolay ve sağlam bir yol sağlar.
Bu tsay in vitro tümör hücreleri ve diğer bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri değerlendirmek için değiştirilebilir. Bu işlem başlamak için, 20 dakika boyunca 37 santigrat derece bir su banyosu içine yerleştirerek serum içermeyen kök hücre orta ısınmak. Sprey doku kültürü başlık yüzeyi ile 70% etanol ve kağıt havlu ile püskürtülür yüzey aşağı silin.
Sonraki sprey% 70 etanol ile orta ve hücre ayırma çözeltisi şişeleri ve kağıt havlu ile silin. Temizlenen şişeleri doku kültürüne aktarın. Tümör hücresini alın ve doku kültürü başlığına aktarın.
Orta aspire ve PBS 10 mililitre ile hücreleri yıkayın. Sonra şişeye iki mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Şişeyi kaputa indirin, tümör hücrelerinin toplayıp yuvarlanmamasını kontrol edin.
Tümör hücreleri toplandıktan sonra, hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için şişenin yan tarafına hafifçe dokunun. Bundan sonra, pipet sekiz mililitre serumsuz hücreli orta şişeiçine ve pipet yukarı ve aşağı üç kez karıştırmak için. Bu hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne ve santrifüje 200 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika aktarın.
Süpernatant aspire. Daha sonra hücreleri 10 mililitre PBS'de yıkayın ve karıştırmak için 3-5 kez pipetle inip çıkarın. Hücreleri 200 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Supernatant aspire, ve serum içermeyen orta 10 mililitre hücreleri resuspend. Pipet yukarı ve aşağı 3-5 kez karıştırmak için. Bu hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini 10 mikrolitre Trypan Blue çözeltisi ile karıştırın.
Sonraki pipet Trypan Mavi ve hücre karışımı bir sayma slayt içine 10 mikrolitre ve canlı hücre numarasını ölçmek için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Hücre yoğunluğunu mililitrebaşına beşinci hücrelere 2,5 kat 10'a ayarlamak için serumsuz hücre ortamını kullanın. Sonra altı kuyulu bir kültür plakasının her kuyunun içine iki mililitre hücre tohumu.
Aynı zamanda, serumiçermeyen kök hücre li orta sadece iki mililitre ile altı kuyu hazırlayın. Bundan sonra, 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece altı kuyu plakaları kuluçka. İlk sprey doku kültürü başlık yüzeyi ile 70% etanol ve kağıt havlu ile püskürtülür yüzey aşağı silin.
Sonraki sprey% 70 etanol ile orta ve hücre ayırma çözeltisi şişeleri ve kağıt havlu ile silin. Temizlenen şişeleri doku kültürüne aktarın. Bundan sonra, kuvözden altı kuyulu tabakları alın.
Şartlı ortamı 15 mililitrelik steril santrifüj tüplerine dikkatlice pipetlendirin ve tüpleri buza yerleştirin. Altı kuyulu plakaların her bir kuyuya 0,5 mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve tümör hücrelerinin yuvarlanıp yuvarlanmadın her dakikakontrol edin. Tümör hücreleri toplandıktan sonra, hücreleri ayırmak için yavaşça plakanın kenarına dokunun.
Sonraki pipet 2.5 tümör hücresi bakım aracı kuyu içine mililitre ve pipet yukarı ve aşağı üç kez karıştırmak için. Hücreleri 15 mililitrelik steril santrifüj tüpüne aktarın. 10 mikrolitre hücreyi 10 mikrolitre Trypan Blue çözeltisi ile karıştırın ve bu karışımın 10 mikrolitresini sayma slaytına aktarın.
Canlı hücre sayısını ölçmek için otomatik hücre sayacı kullanın ve şartlandırılmış ortamın hacmini hücre sayısına göre ayarlamak için bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatan serumsuz kök hücre ortamını kullanın. Koşullu ortamı 0,45 mikrometre filtrelerden geçirin ve koşullu ortamı buzüzerine yerleştirin. Başlamak için, 20 dakika boyunca 37 santigrat derece bir su banyosunda IMDM orta ısınmak.
% 70 etanol ile doku kültürü başlık temizleyin ve orta şişe temiz ve daha önce açıklandığı gibi kaput içine taşıyın. Daha sonra MV-4-11 hücrelerinin şişesini kaputa aktarın. Pipet 10 mililitre hücre15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne.
Daha önce açıklandığı gibi canlı hücrelerin sayısını ölçmek için Trypan Blue ve otomatik hücre sayacı kullanın. Sonra hücreleri 200 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant aspire ve PBS 10 mililitre ile hücreleri yıkayın.
Santrifüj tekrar 200 kez g ve dört derece santigrat beş dakika için. Süpernatant aspire, ve mililitre başına bir milyon hücrenin son hücre yoğunluğu nda IMDM orta hücreleri resuspend. Önce gerekli malzemeleri oda sıcaklığına getirin.
Her kesici uça hazırlanan MV-4-11 hücrelerinin 250 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra sadece 24 kuyulu plakanın alt odalarına şartlı orta veya orta 400 mikrolitre ekleyin ve numunelerin üç kat daha eklenmesini sağlar. 4 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat.
Daha sonra aynı kuyunun iç duvarındaki kesici ucu hafifçe dokunun ve kesici ucu atın. Yavaşça kuyularda hücreleri pipet yukarı ve aşağı üç kez karıştırmak için. Bu hücre süspansiyonunun 225 mikrolitresini floresan ölçümü için uygun olan siyah duvarlı 96 kuyulu plakanın kuyularına aktarın.
Bundan sonra, CyQUANT boyayı 1'den 75'e kadar olan bir oranda 4x lizis tamponu ile seyreltin. Girdap kısaca ve çözüm aşağı spin. Bu çözeltinin 75 mikrolitresini 96 kuyulu plakanın her kuyusuna aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Floresan levha okuyucu kullanarak, floresan okuyun ve metin protokolünde özetlenen verileri analiz. Bu çalışmada tümör makrofaj etkileşimini incelemek için in vitro bir tetki kullanılmıştır. Floresan değerleri yüksek olan örnekler, koşullu ortamın makrofajları işe alma kapasitesinin yüksek olduğunu gösterir.
Deneysel ihtiyaca bağlı olarak ek kontroller eklenebilir. Örneğin, makrofaj kemotaksisi ortadan kaldırmak ve aynı şekilde gerçekleştirmek için koşullu medya tedavi etmek için nötralize antikorlar kullanabilirsiniz. Bir de şartlı ortama ekstra kemokinler ekleyebilirsiniz, hangi olumlu bir kontrol olarak hizmet vermektedir.
Farklı hücre türleri farklı hızlarda büyüyebilir, çünkü bu tsuriçin hücre numarası farklılıklarını kontrol etmek önemlidir. In vitro sonuçların in vivo onayı çok önemlidir. Bir fareler içine tümör hücreleri enjekte edebilir ve akış sitometri ile tümörleri analiz, immünboyama, ve CyTOF sonuçları onaylamak için.
