Biz tartışma için Mathias S. Dick, Roland F. Dreier ve Sebastian Ruhl kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, bir SNSF Profesörlük PP00P3_139120 / 1 ve PB Bir Üniversite Basel proje hibe ID2153162 tarafından desteklenmiştir

Salmonella MCherry-ifade ile 1. Digitonin Deneyi (Analiz FACS tabanlı) <ol><li> Hazırlama bakteriler Not: bir plazmid (pFPV rpsM destekleyicisi altında mCherry kodlayan) için mCherry eksprese Salmonella, vahşi tip SL1344 (Streptomisin dirençli) bu deneyde kullanılır. MCherry konstitütif ekspresyonu ile değişmediğini Bakteriyel fagositoz ve proliferasyon 16 (veriler gösterilmemiştir). <ol><li> 37 ° CO / N bir çalkalayıcıda streptomisin (90 ug / ml) ve ampisilin (100 ug / ml, MCherry ifade vektörü) ile desteklenmiş LB aracı maddesi içinde 3 ml enfeksiyondan önce soyu 1 gün inoküle. </li></ol></li><li> Enfeksiyon hücreleri Kaplama. <ol><li> 1.25 x 10 5 hücre yoğunluğunda 24 oyuklu bir plaka içerisinde tohum vahşi tip BMDMs / göz birincil makrofaj ortamı, 1 ml (DMEM,% 10 fetal buzağı serumu (FCS, ısı ile inaktive edilmiş, 56 ° C&#39;de, 30 dakika ile desteklenmiş ),% 1 HEPES,% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),% 1 L-glutamin ve% 10 L929 süpernatan (makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF şartlanmış ortam) L929 hücrelerini üreten). Tablo 1&#39;e göre Tohum kuyuları tek tek koşullara hesaba. Kontrol (Tablo 1) olarak kullanılan oyuklara lamelleri ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde gece boyunca inkübe hücreleri ve% 5 CO2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Permeabilizasyon </td><td colspan="3"> Boyanma </td></tr><tr><td></td><td> Cam lamel </td><td> Salmonella </td><td> Digitonin </td><td> Saponin </td><td> anti-Salmonella </td><td> Anti-calnexin </td><td> Anti-PDI </td></tr><tr><td> A1 (örnek) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (örnek) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (örnek) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (hayır permeabilization kontrol) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (tam permeabilization kontrol) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (calnexin lekeli) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (calnexin lekeli) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (calnexin lekeli) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (lekeli) PDI için </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (PDI için lekeli) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (PDI için lekeli) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Salmonella, geçirgenliği ve boyama daha sonra, enfeksiyon için 24 oyuklu bir formatta, kemik iliği türevli makrofajlar (BMDMs) için kaplama şeması * Protokol 1 ya da protokol 2 yapılır olup olmamasına bağlı olarak değişir.. <ol start="3"><li> Enfeksiyonu bakteriyi hazırlanması. <ol><li> Sonraki gün, PBS içinde kültür 1:10 seyreltilmesiyle ve yalnızca PBS kontrolüne karşı OD 600 ölçülerek, gece boyunca kültürdeki Salmonella konsantrasyonunu belirler. Bu OD 600 l ölçülür sağlarspektrofotometrenin inear aralığı. </li><li> Ml başına Salmonella konsantrasyonu hesaplanır. 1 OD600 1 x 10 9 bakteri karşılık gelir. </li><li> 1.25 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyona ulaşmak için Salmonella makrofaj ortam içinde bakteri ile seyreltilir. </li></ol></li><li> Salmonella ile hücrelerin enfeksiyonu. <ol><li> BMDMs orta çıkarın. Enfekte edilmemiş kontrol çukurları (B1-B3, C1-C3) makrofaj ortamın 1 ml ilave edilir. Kuyu A1 Salmonella süspansiyonu 1 ml ilave edilir - A5, hücre başına 10 bakteri enfeksiyonu (moi) &#39;in bir çokluğu ulaşmak için. </li><li> Enfeksiyonu senkronize etmek için 37 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 15 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Gentamisin ile hücre dışı Salmonella Killing. <ol><li> 1 saat sonrası enfeksiyon, inkübatör plaka kaldırmak ve 0.1 mg / ml gentamisin ihtiva eden makrofaj ortamın 0.1 ml ilaveekstrasellüler bakterileri öldürmek için. Tüm hücreler aynı şekilde muamele olmasını sağlamak için, daha da enfekte olmamış kontrollere göre, tüm oyuklara gentamisin ekleyin. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Hücreleri Yıkama. <ol><li> 2 saat sonra enfeksiyondan, inkübatör plaka kaldırmak ve kuyular düz DMEM 1 ml 2x yıkama (önceden ısıtılmış 37 ° C) ve makrofaj ortam ile yerine 10 ug / ml içeren (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış) &#160; Gentamisin kalan dışı bakterilerin gelişimini önlemek için. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Deterjan ve antikorlar ile taze tamponlar hazırlanması. <ol><li> Sadece analiz istenilen zaman noktasından önce, 1 mg / KHM Tamponu içinde ml (110 mM potasyum asetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.3) ile digitonin taze bir stok çözelti hazırlayın. Bir çalışma konsantrasyonu tampon stok Filtre ve KHM sulandırmakdigitonin 50 ug / ml. Buna ek olarak, KHM Tamponu, KHM içinde 1/100 1/100 ya da anti-PDI ile 1/500 anti-calnexin de FITC (CSA-1-FITC) bağlı anti-Salmonella antikorda% 0.1 saponin içeren bir çözelti hazırlanması Tampon% 3 BSA ile takviye edilmiştir. </li></ol></li><li> Hücre permeabilizasyon. <ol><li> Inkübatörden plaka çıkarın ve yıkama kuyu KHM Tamponu, 0.5 ml (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış) 3x. A3 ve kuyular A5 ve B3 saponin ile B2 / C2 veya KHM Tampon / C3 (Tablo 1&#39;e göre) - KHM Buffer çıkarın ve kuyu A1 digitonin kuyu A4 ve B1 / C1, KHM Tampon 0.25 ml düz KHM Tampon ekleyin. Tüm oyuklar KHM Tamponu, 0.5 ml ile 3 kez yıkama hemen oda sıcaklığında tam olarak 1 dakika boyunca inkübe ve (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış). </li></ol></li><li> Birincil antikor boyama. <ol><li> Uygun oyuklara primer antikor çözeltileri (keçi anti-Salmonella -FITC, 250 ul / göz, 0.1 ug / ml) KHM tamponunu çıkarın ve ekleme (Şekil 1 </strong&gt;, Tablo 1). 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca plaka inkübe ve% 5 CO2. </li><li> 1 ml PBS ile 1x hücreleri yıkayın. </li></ol></li><li> Enfekte edilen hücreler, (kuyular A1 - A5): FACS analizi <ol><li> Yıkama hücreler PBS ile 3 kez yıkandı ve% 0.1 Triton içeren buz soğukluğunda PBS, 0.5 ml. Hücre agrega kırmak için hücre süzgecinden kapağı ile 5 ml FACS tüp aktarın. Buz üzerinde örnekleri tutun. </li><li> Bir FACS örnekleri analiz edin. Tam geçirgen denetimleri kullanarak, toplam ileriye dayalı bakteri ve birinci yan dağılım (FSC / SSC) için kapısı ayarlayın ve mCherry sinyali (610 nm ± 20 nm filtre). </li><li> Sonraki, sitozolik bakteriler için kapıları (FITC + mCherry +) ve vakuolar bakterileri (FITC-, mCherry +) (Şekil 3) ayarlamak için tam geçirgen ve geçirgen olmayan kontrollerini kullanarak toplam bakteri popülasyonunda FITC sinyali analiz. </li><li> Kapıları set sayesinde, örnekleri analiz ve sitozolik vs yüzdesini belirlemeküreticinin protokolüne uygun olarak FlowJo yazılımı kullanılarak vakuolar bakteri. </li></ol></li><li> Bulaşmamış permeabilization denetimleri (kuyular B1 - B3, C1 - C3): mikroskopi <ol><li> Tespit <ol><li> PBS çıkarın ve PBS içinde% 4 PFA 250 ul ekleyin. 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Kuyular PBS içinde 1 ml 2x yıkayıp fiksatif sönmesi için 10 dakika boyunca PBS içinde 0.1 M glisin 250 ul ilave edin. Yıkama kuyu 1 ml PBS ile 2x. </li></ol></li><li> İkincil antikor boyama. <ol><li> PBS içinde florofor bağlanmış uygun bir ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat için leke permeabilizasyon kontrol,% 0.1 saponin ve% 3 BSA tam Permeabilize hücreleri ile takviye edilmiştir. </li><li> Yıkama 1 ml PBS ile 3 kez lamelleri ve DAPI (1.5 ug / ml) ile orta montaj analiz için lamelleri monte edin. </li></ol></li><li> Mikroskopi analizi. <ol><li> Konfokal FLUO kullanarak 40X veya 63X büyütmede kontroller ile lamelleri analizrescence mikroskop. Permeabilizasyon çalıştığı takdirde, digitonin- ve saponin permeabilize hücrelerin ve PDI saponin permeabilize hücrelerin (Şekil 4) yalnızca boyanma için olmayan permeabilize hücreler için boyama, boyama calnexin olmalıdır. </li></ol></li></ol></li></ol> Etiketsiz Salmonella (Mikroskopi tabanlı Analizi) 2. Digitonin Deneyi <ol><li> O / N kültürler için bakteri hazırlanması. <ol><li> Etiketlenmemiş Salmonella, vahşi tip SL1344 inoküle (Streptomisin dirençli) 37 ° CO / N bir çalkalayıcıda streptomisin (90 ug / ml) ile desteklenmiş LB aracı maddesi içinde 3 ml enfeksiyondan önce 1 gün. </li><li> Enfeksiyon hücreleri Kaplama. <ol><li> 1.25 x 10 5 hücre yoğunluğunda steril cam lamelleri içeren bir 24 oyuklu bir plaka içerisinde tohum BMDMs / oyuk makrofaj ortam 1 ​​ml (DMEM,% 10 fetal buzağı serumu (FCS ile de-tamamlanmaktadır, 56 ° C ilave olarak,30 dakika),% 1 HEPES,% 1 L-olmayan amino asitleri (NEAA),% 1 L-glutamin ve% 10 L929 süpernatant). Tablo 1&#39;e göre Tohum kuyuları tek tek koşullara hesaba. </li><li> 37 ° C&#39;de bir kuluçka hücreleri O / N inkübe ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Enfeksiyonu bakteriyi hazırlanması. <ol><li> Sonraki gün, PBS içinde kültür 1:10 seyreltilmesiyle ve yalnızca PBS kontrolüne karşı OD 600 ölçülerek O / N kültüründe Salmonella konsantrasyonunu belirler. Bu OD 600 spektrofotometre doğrusal aralığı içinde ölçülür sağlar. </li><li> Mililitrede Salmonella konsantrasyonunu belirlemek. 1 bir OD 600, 1 x 10 9 bakteri karşılık gelir. </li><li> 1.25 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyona ulaşmak için Salmonella makrofaj ortam içinde bakteri ile seyreltilir. </li></ol></li><li> Salmonella ile hücrelerin enfeksiyonu. <ol&gt; <li> Tüm kuyulardan orta çıkarın. Enfekte edilmemiş kontrol çukurları düz makrofaj ortamın 1 ml ilave edilir (B1 - B3, C1 - C3 alkil). Kuyu A1 Salmonella süspansiyonu 1 ml ilave edilir - A5, hücre başına 10 bakteri enfeksiyonu (moi) &#39;in bir çokluğu ulaşmak için. </li><li> Enfeksiyonu senkronize etmek için 37 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 15 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Gentamycin ile hücre dışı Salmonella Killing. <ol><li> 1 saat sonrası enfeksiyon, inkübatör plaka kaldırmak ve tüm oyuklara hücre dışı bakterileri öldürmek için, 1 mg / ml gentamisin ihtiva eden makrofaj ortamın 0.1 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Hücreleri Yıkama. <ol><li> 2 saat sonrası enfeksiyon, inkübatör plaka kaldırmak ve 10 ug / ml içeren taze makrofaj ortam 1 ml her bir kuyucuğa 3x yıkama Önlemek için gentamisinKalan dışı bakterilerin büyümesi. 37 ° C&#39;de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Deterjan ve antikorlar ile taze tamponlar hazırlanması. <ol><li> Sadece analiz istenilen zaman noktasından önce, 1 mg / KHM Tamponu içinde ml (110 mM potasyum asetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.3) ile digitonin taze bir stok çözelti hazırlayın. Stok filtre edin ve 50 ug / ml &#39;lik bir çalışma konsantrasyonu KHM Tamponu içinde seyreltin digitonin evi. </li><li> Buna ek olarak, KHM Tamponu içinde% 0.1 saponin içeren bir çözelti hazırlanması, anti-Salmonella -FITC (CSA-1, 0.1 ug / ml), KHM Tamponu içinde 1/100 1/100 ya da anti-PDI anti-calnexin ile desteklenmiş % 3 BSA (antikor konsantrasyonu için malzeme tabloya bakınız). </li></ol></li><li> Hücre permeabilizasyon. <ol><li> Inkübatörden plaka çıkarın ve yıkama kuyu KHM Tamponu, 0.5 ml (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış) 3x. KHM Buffer çıkarın ve 0.25 ml düz KHM Tampon ekleyinkuyu A1 digitonin kuyu A4 ve B1 / C1, KHM Tampon için - A3 ve B2 / saponin ile C2 veya KHM Tampon kuyu A5 ve B3 / C3 (Tablo 1&#39;e göre). Tüm oyuklar KHM Tamponu, 0.5 ml ile 3 kez yıkama hemen oda sıcaklığında tam olarak 1 dakika boyunca inkübe ve (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış). </li></ol></li><li> Birincil antikor boyama. <ol><li> KHM tamponunu çıkarın ve uygun kuyulara (Şekil 2, Tablo 1), birincil antikor çözeltileri (keçi anti Salmonella CSA1-FITC, 250 ul / göz, 0.1 ug / ml) ekleyin. 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca plaka inkübe ve% 5 CO2. 1 ml PBS ile yıkayın 3x. </li></ol></li><li> Fixation. <ol><li> PBS çıkarın ve PBS içinde% 4 PFA 250 ul ekleyin. 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Kuyular PBS içinde 1 ml 2x yıkayıp fiksatif sönmesi için 10 dakika boyunca PBS içinde 0.1 M glisin 250 ul ilave edin. Yıkama kuyu 1 ml PBS ile 2x. </li></ol></li><li> ToplamEnfekte örneklerin Salmonella boyama. <ol><li> Yıkama,% 0.1 saponin /% 3 BSA içeren PBS ile 3 kez lamelleri ve bir anti-CSA1 antikoru ile inkübe örnekleri 1 saat süre ile (keçi anti-CSA1, 0.1 ug / ml fare anti-LPS, 0.1 ug / ml olarak iyi çalışır) % 0.1 saponin /% 3 BSA ile PBS içinde oda sıcaklığında karıştırıldı. </li><li> % 0.1 saponin /% 3 BSA ile PBS içinde yıkayın 3x. Karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.1 saponin /% 3 BSA ile PBS içinde tercih edilen flüorofora bağlı ikinci bir anti-keçi antikoru ile inkübe edin. </li><li> Yıkama 1 ml PBS ile 3 kez lamelleri ve DAPI (1.5 ug / ml) ile orta montaj analiz için lamelleri monte edin. </li></ol></li><li> Mikroskopi analizi. <ol><li> Sitozolik Salmonella (pozitif anti Salmonella -FITC) ve total Salmonella (çift pozitif) (Şekil 5) sayarak bir konfokal mikroskop ile veri elde. Permeabilizasyon kontrolleri göstermelidir: non-permeabilize hücrelerin, calnexin s hiçbir boyamaDigitonin permeabilize hücrelerin ve saponin permeabilize hücrelerin için PDI, boyama için taining (Şekil 4). Wells A4 ve A5 Salmonella boyama için iç denetimler görev yapacak. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kumar, Y., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leading+a+sheltered+life:+intracellular+pathogens+and+maintenance+of+vacuolar+compartments.">Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments.</a> Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).</li><li>Chong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+phagosomal+stage+of+Francisella+tularensis+determines+optimal+phagosomal+escape+and+Francisella+pathogenicity+island+protein+expression.">The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression.</a> Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).</li><li>Mellouk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+subverts+the+host+recycling+compartment+to+rupture+its+vacuole.">Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole.</a> Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).</li><li>Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-mediated+reentry+of+Francisella+tularensis+into+the+endocytic+compartment+after+cytoplasmic+replication.">Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).</li><li>Broz, P., Monack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+described+pattern+recognition+receptors+team+up+against+intracellular+pathogens.">Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens.</a> Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).</li><li>Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+LPS+activates+caspase-11:+implications+in+TLR4-independent+endotoxic+shock.">Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock.</a> Science. 341, 1250-1253 (2013).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+of+intracellular+Shigella+from+autophagy.">Escape of intracellular Shigella from autophagy.</a> Science. 307, 727-731 (2005).</li><li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole.">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li><li>Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bimodal+lifestyle+of+intracellular+Salmonella+in+epithelial+cells:+replication+in+the+cytosol+obscures+defects+in+vacuolar+replication.">The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication.</a> PLoS One. 7, e38732 (2012).</li><li>Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Toxoplasma+gondii+parasitophorous+vacuole+by+IFNgamma-inducible+immunity-related+GTPases+(IRG+proteins)+triggers+necrotic+cell+death.">Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death.</a> PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).</li><li>Meunier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-11+activation+requires+lysis+of+pathogen-containing+vacuoles+by+IFN-induced+GTPases.">Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases.</a> Nature. 509, 366-370 (2014).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+interferon-gamma-inducible+p65+GTPases+plays+a+critical+role+in+host+defense+against+Toxoplasma+gondii.">A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii.</a> Immunity. 37, 302-313 (2012).</li><li>Degrandi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+guanylate+binding+protein+2+(mGBP2)+controls+Toxoplasma+gondii+replication.">Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).</li><li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+the+inflammasome+by+caspase-1+adaptors+ASC+and+Ipaf.">Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf.</a> Nature. 430, 213-218 (2004).</li><li>Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+cytosolic+Salmonella+in+epithelial+cells.">Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells.</a> PLoS One. 9, e84681 (2014).</li><li>Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+determine+differential+redistribution+of+cytochrome+c+and+Smac/DIABLO+from+mitochondria+during+cell+death+signaling.">Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling.</a> PLoS One. 7, e42298 (2012).</li><li>Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+orientation+of+the+human+papillomavirus+type+16+E5+oncoprotein.">Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein.</a> J Virol. 84, 1696-1703 (2010).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+measurements+of+vacuolar+rupture+caused+by+intracellular+pathogens.">Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens.</a> J Vis Exp. , e50116 (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Diferansiyel permeabilization analiz ve vakuolar bölmeleri ve sitoplazmada arasındaki bakteriyel patojenlerin hücre içi dağıtım ölçmek için kolay ve sağlam bir yöntemdir. Aynı deney gibi Francisella novicida 2,4 ve Shigella flexneri 12 olarak bakteri başarıyla kullanılmaktadır. Birçok hücre içi patojen değiştirebilir veya ana bilgisayar hücreiçi yapılarını değiştirmek olduğundan Ancak, digitonin permeabilization sağlamlığı bireysel olarak belirlen...

Hücre içi bakteriyel patojenler doğrudan konak hücre sitoplazmada veya uzman vakuoler bölmelerde 1 ya çoğaltmak. Enfeksiyonun başlangıç ​​aşamasında en patojenler (örneğin histiositler gibi) ya da aktif bir fagositik olmayan hücrelere kendi alımını teşvik ederek özel hücreler tarafından fagositoz yoluyla internalize olsun. Fagositik hücrelerde, fagosom normalde fagosite parçacıklar sindirilir bir parçalayıcı bölme oluşturmak için lizozomlar ile sigortalar. Böyle Francisella novicida veya Shigella flexneri gibi özel sitozolik bakteriler, fagozomun rüptürü uyararak phagosomal bozulmasını kaçmak ve daha sonra sitozol 2,3 kaçmasına. Bu tür vakuoler rüptürü 2-4 teşvik efektör proteinleri enjekte Francisella Patojenite Adası (FPI) ya da Shigella flexneri T3SS gibi virülans ilişkili mekanizması gerektirir. konakçı hücre sitosol özellikleriNormalde patojenlerin varlığı tanımak ve 5 sinyal doğuştan gelen bağışıklık neden korunmuş örüntü tanıma reseptörleri bir dizi. Buna ek olarak, xenophagy, otofaji bir anti-mikrobiyal formu sitoplazmada girmek bakteri düşürebilir. Sitozolik bakteriler normalde iyi künt veya farklı stratejiler kullanarak bu yanıtları aşmak için uyarlanmıştır. Örneğin, Francisella konak tanıma önlemek için kendi LPS değiştirir ve Shigella salgılanan proteinler efektör 6,7 kullanarak otofaji işe engeller. Lizozomal bozulması kaçmak için bir başka strateji modeli vaküoler patojen Salmonella serovar Typhimurium&#39;da tarafından istihdam edilmektedir, bundan sonra Salmonella typhimurium olarak anılacaktır. Salmonella hücre içi niş içine ilk phagosome pişmanlık efektörleri enjekte etmek için bir T3SS kullanır Salmonella vakuol (SCV) içeren 8,9. Ev sahibi yollarının sürekli manipülasyon olduğunuGerekli vaküole lipidler ve diğer besin alımı yoluyla bu çarpıtma korumak için. Gerçekten de, Salmonella şifa mutant vakuolar stabilitesini korumak için başarısız olur ve doğuştan gelen bağışıklık yolları ve Otofaji işe 8 aktivasyonu ile sonuçlanır enfeksiyondan sonra birkaç saat içinde konakçı hücrelerin sitosol girer. Salmonella koful çıkış çalışmaları olduğu hücre tipine bağlı olarak değişir, ve çeşitli epitelial hücrelerinde daha WT Salmonella sitozol 10 SCV ve hyperreplicate kaçabilir göstermiştir. Son raporlar vakuoler patojenlerin doğuştan gelen bağışıklık tespiti de tanımak ve patojen içeren vakuoller (PCVS) 11-14 istikrarsızlaştırmak için konağın yeteneğine bağlıdır göstermektedir. Ev sahibi ya da bakteri hem genotip vaküoler ve sitozolik bölme arasındaki hücre içi bakteri dağılımını etkileyebilir göz önüne alındığında, bu vaküoler vs sayısını ölçmek için gerekli olansitosolik bakteri. Bu yana, en deney düzeneğinde konakçı hücreler, farklı hücre içi bölmelerde bir çok bakteri barındırabilir, daha sonra fazla bir bakteri ile enfekte edildi ve edilmektedir, bir teknik, tek bakteri seviyesine ölçümü sağlar ihtiyaç vardır. (Ayrıca phagosomal koruma deneyi olarak da bilinir) Diferansiyel permeabilization bu çözünürlük 2,4,10,12 sağlar. deney sağlam vakuolar membranlar bırakır deterjan digitonin ile konakçı hücre, plazma zarının seçici geçirgenliği göre ve böylece antikorlar ile sitosolik bakteri seçici boyanmasını izin verir. Burada diferansiyel permeabilization kullanarak sitozolik ve vakuolar Salmonella typhimurium ölçümü için iki protokol sağlar. Bu yöntemin prensibi, Şekil 1 &#39;de tarif edilmektedir: Kemik iliği türevli makrofajlar (BMDMs) durağan faz Salmonella MCherry-ifade ile enfekte edilir. Sabit faz Salmonella t gerekOnlar faaliyet aksi NLRC4 inflammasome tarafından tanınan ve BMDMs 15 hızlı hücre ölümünü (pyroptosis) neden olacağını SPI-1 T3SS, ifade downregulate çünkü o kullanılır. Hücreler yıkandı ve 1 dakika için digitonin 50 ug / ml ile muamele edilir enfeksiyonu takiben. Hücreler hemen tekrar yıkandı ve sitoplazmada erişimi olan bakteri işaretlemek için FITC bağlanmış anti-Salmonella antikorlar ile inkübe edilir. Adım hücreler parçalanır ek yıkama ve MCherry + (vakuolar) ve FITC + / MCherry + (sitosolik) bakteri yüzdesi sonra FACS ile tespit edilir. Ayrıca herhangi bir floresan proteini eksprese eden suşlar mevcuttur (Şekil 2) ise kullanılabilecek bu yöntemin bir uyarlamasını sunulmuştur. Ek adımlar hücreler, sabit ve tamamıyla geçirgen olan FITC etiketleme sonra katılır. Bundan sonra, tüm bakteriler anti-Salmonella antikorlar ve buna tekabül eden ikincil antikor ile boyandı. Detection daha sonra yerine FACS analizinin mikroskobu ile yapılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td>50ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>219998380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>791733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td>
			<td>KPL</td>
			<td>01-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1</td>
			<td>KPL</td>
			<td>02-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calnexin</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-860D</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PDI</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-890</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit antibody-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11070</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15710-49</td>
			<td>100ug/mL and 10ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Amimed</td>
			<td>5-13K00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>imaging done at 63x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection mCherry 610 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection FITC 530 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cytosolic vs. vacuolar salmonella in primary macrophages by differential permeabilization

Hücre içi bakteriyel patojenler sitosolde veya özel patojen içeren vakuol (PCVS) &#39;de çoğaltabilirsiniz. Sitoplazmada ulaşmak için, Shigella flexneri&#39;ye ve Francisella novicida gibi bakteriler fagozomun rüptürü ikna etmek gerekir. Bunun aksine, Salmonella typhimurium, Salmonella-ihtiva-eden vakuol (SCV) olarak bilinen bir vakuolar bölmesi içinde çoğaltılır. Salmonella Ancak bazı mutantlar SCV bütünlüğünü korumak için başarısız ve böylece sitozolüne salınır. Tek bir bakteri seviyesine vakuolar bakteri genel sitosolik yüzdesi da fagosom-koruma deneyi olarak bilinen, ayırıcı permeabilization ile ölçülebilir. yaklaşım deterjan digitonin mülkiyet kullanımı seçici kolesterol bağlamak için yapar. Plazma membranı diğer hücre membranları daha fazla kolesterol içerdiği, Digitonin hücre içi zarlar bırakırken seçici plazma membran geçirgenliği kullanılabilirbozulmamış. Floresan markör proteinin (diğerleri arasında, örneğin MCherry) ifade patojen ile kısa süreli, enfeksiyona, konakçı hücrelerin plazma membran tampon içeren digitonin kısa bir kuluçkalama permeabilize edilmiştir. Hücreler daha sonra yıkandı ve inkübe tercih bakteriye karşı yönlendirilmiş (seçim bir flüorofora bağlı), bir primer antikor ile (örneğin, anti-Salmonella -FITC) ile tekrar yıkanır. İşaretlenmemiş bakteriler kullanıldığı takdirde, ilave bir aşama olduğu tüm zarlar geçirgen ve tüm bakteri karşılık gelen bir antikor ile boyandı, yapılabilir. Boyama işleminin ardından, vakuolar ve sitosolik bakteri oranı, tek veya çift-pozitif olaylar sayarak, FACS ya da mikroskop ile tayin edilebilir. Burada bakteri Salmonella typhimurium, bu tekniğin kullanımı için deneysel ayrıntıları sunmaktadır. Bu testin bir avantajı, diğer deneyde tersine, tekli bacte düzeyinde bir ölçümü sağlar, kiRia, mikroskopi ile analiz edildi ve eğer belirli bir hücrede sitosolik ve vakuolar bakterilerin tam sayısını içerir.

Şekil 1 ve Şekil 2, bir protokol 1 ve protokol 2 protokolde önemli adımlar ve elde edilen sonuçları gösteren tarif digitonin tahlilinin şemaları göstermektedir. 3 tipik bir FACS sonuçları göstermektedir. Pozitif ve negatif kontroller mCherry + / FITC- bakteriler (Salmonella vakuolar) ve mCherry + / FITC + bakteri (Salmonella sitozolik) için kapılarını ayarlamak için kullanılır. Bu kapılar göre sitosolik ve vakuolar bakteri yüzdesi de...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization at JoVE.com

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

10.8K Görüntüleme.  University of Basel. We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Video: Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

Sitosolik Ca ölçümü 2 + İzole Kontraktil Lenfatikler

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...