Biz JPK orijinal hayali disk diseksiyonu işlemini öğretirken Donald hazır ve Kevin Musa&#39;yı teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, Şekil 1B genital disk ve Şekil 3 Şekil 2A Brandon Weasner, göz diski Bonnie Weasner ederiz, sinek lekelere Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve antikor Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası. CMS Sağlık (NIH) GCMS Eğitim Grant National Institutes (T32-GM007757), Frank W. Putnam Araştırma Bursu ve Robert Briggs Araştırma Bursu bir nakit tarafından desteklenmiştir. JPK Ulusal Göz Enstitüsü bir hibe ile desteklenen (R01 EY014863)

Larva 1. Hazırlık <ol><li> Diseksiyon tamponu ile, bir 35 mm Petri kabı doldurun. </li><li> Petri kabındaki larva yerleştirin ve onları bir kaç dakika (kendi kendini temizleme adım) için etrafında yüzmek için izin verir. </li><li> Bir silikon bazlı diseksiyon plaka üzerinde diseksiyon tampon bir havuza larva transferi. Bu havuz, levhanın bir kenarına olmalıdır. Diseksiyon levha, cam bir Petri kabı içinde dökülmüş ve sertleştirilmiş olan bir silikon çözelti oluşur. </li><li> Bir pastör pipeti kullanılarak-, diseksiyon plaka ortasında tahlil tamponuna büyük bir havuz yerleştirin. </li><li> 5. forseps kullanarak, diseksiyon tampon büyük havuza küçük havuzda tek temizlenmiş larva transferi. </li></ol> Larva 2. Kaba Diseksiyon <ol><li> Larva diseksiyonu tampon büyük havuzun içinde hala ise forseps ile larva toka. Forseps ve diğer çift Anim tutmak için kullanılır ise forseps bir çift ağız kanca kapmak için kullanılmalıdırdiğerleri hala (1/3 vücut uzunlukta hafifçe larva kapmak). </li><li> Hızla forseps ikinci çifti ile uzak vücudun geri kalanını çekerken ağız kanca yakın manikür içeren forseps çifti sakinleştirmeye tutun. </li><li> Larva parçalıyorlar başlar zaman gerginlik hafif bir serbest hissedeceksiniz. Forseps larva bırakın ve dışarı dökmek için larva &quot;cesaret&quot; için izin verir. Bu, normal konformasyonda kalması için hayali diskler sağlar ve deforme edilmesini engeller. </li><li> Forseps bir çift ile yerde larva ön ucunu tutmak için tekrar ağız kanca kavramak. Forseps kullanılarak diğer çift de dahil olmak üzere, iç bağırsakta larvaların 2/3 alt çıkarın. Not: ağız kancaları, göz antennal diskleri, beyin hemisfer, ventral ganglion, tükürük bezleri, bazı bacak diskler içeren karmaşık ve örten manikür kalacaktır. </li><li> Forseps bir çift ile hafifçe örten manikür, tükürük bezleri, bacak diskleri ve kaldırmakdiğer doku. Not: Yalnızca ağız kancalar, göz antennal diskler, beyin hemisfer ise kalmalıdır doku ve ventral ganglion (Şekil 3). </li><li> Tekrar 15-20 dakika için ek larva ile 2,1-2,5 adımları. Not: uzun süre için diseksiyon tampon kalır hayali diskler aşağılamak eğilimindedir ve sonuçta çektirmek için ideal bir numunelere göre daha az gibi görünecektir. Böylece, tüm kesilmiş dokuları PLP sabitleyici aktarılması gerekmektedir 20 dakika sonrasında en (aşağıya bakınız). </li></ol> Antikorlar ile 3. Fiksasyon ve Doku Boyama <ol><li> P-200 Pipetman kullanarak, soğuk Paraformaldehit-Lizin-Periyodat (HUA) fiksatif içeren bir saat cam disseke dokuların aktarın. 50 ul transfer diseksiyon tampon sınırı hacmi PLP&#39;nin seyreltme en aza indirmek için. Ucu açılma disseke dokuları barındıracak kadar büyük olduğunu böylece bir jilet ile ucu kesmek için emin olun. Bir çift forseps kullanılması veyatungsten iğne disseke dokuların tamamen doğru tespit gerçekleşmesi için batık emin olun. 45 dakika boyunca soğuk HUA sabitleyici disseke dokuları inkübe edin. Bu inkübasyon ajitasyon olmadan oda ısısında gerçekleşebilir. </li><li> P-200 Pipetman kullanarak, 45 dakika boyunca bir kesim sarı ucu kullanılarak yıkama tamponu (RT) kesilmiş dokuları aktarın. 50 ul transfer PLP sınırı hacim yıkama tamponu ile seyreltme en aza indirir. Not: Tüm disseke dokuların tamamen sular altında olmalıdır. </li><li> 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp disseke doku 20-30 setleri aktarın. Not: Göz antennal disk kompleksleri daha çok sayıda boru içinde karıştırılması durumunda, borunun altındaki doku antikorlara uygun maruz kalmayacak bir olasılığı vardır. Optimal sonuçlar için fazla 20-30 göz antennal disk kompleksleri tek bir tüp içinde mevcut olmalıdır. Disseke doku mikrofuge&#39;ye tüpün dibine çökecektir. Bu yüzden, daha sonraki adımlar uçıkarın ve yıkama tamponu engelleme çözeltisi ve antikor yerine bir Pipetman se. </li><li> Yıkama tamponunu çıkarın ve bloklama çözeltisi 100 ul ile değiştirin: yıkama tamponu içinde% 10 normal keçi serumu. 10 dakika boyunca masa üstü bir karıştırıcı üzerine hafif bir döndürme ile oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Bloke çözeltisini çıkarın ve uygun bir şekilde,% 10 normal keçi serumu içinde seyreltilmiş olan birincil antikor 100 ul ile değiştirin. 16 saat süre ile hafif bir dönme ile oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Primer antikor çıkarın ve yıkama tamponu 750 ul ile değiştirin. Bir nutator tüpleri ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında nutate sağlar. Not: primer antikor (4 ° C&#39;de mağaza) kaydedilir ve daha sonra yeniden kullanılabilir. Antikorlardır birden çok kez yeniden kullanma spesifik olmayan bağlanma azaltılmasında yardımcı olabilir. </li><li> Kafaları, daha sonra borunun dibe yıkama tamponunu çıkarın ve uygun bir şekilde,% 10 normal serum içinde seyreltilmiş olan ikincil antikor, 100 ul ilave izin verin. Yumuşak devir için RT&#39;de inkübe 2̵1, 4 sa. </li><li> Dokudan ikincil antikor çözüm çıkarın ve yıkama tamponu ile 500 ul ile değiştirin. Doku tüpün dibine çökme eğilimi göstermesine izin verin. </li><li> P-200 ve bir kesme sarı ucu kullanarak, kesme tabağına yerleştirilmiş olan yıkama tamponu ile bir havuza tüm parçalara dokuları aktarın. Ince diseksiyon sonraki adıma geçmeden ederken, doku yıkama tamponunda inkübe olacak. Bu aşırı ikincil antikorlar kaldırmak için yardımcı olur. </li></ol> 4. Göz-Antennal Disk Kompleksleri Güzel Diseksiyon ve Slaytlar üzerine Montaj <ol><li> Aşağı bakacak kompleksinin ventral yüzü ile ağız kanca tarafından manikür kavrayabilirdim için forseps bir çift kullanın. Forseps ikinci bir çift göz ve beyin diskler arasındaki boşlukta (Şekil 3, kırmızı ok) ikinci forseps kapanış ve hızla ağzına kanca uzak beyin çekerek iki beyin lobu çıkarın. </li><li> Ağız kanca tutunmaya devam ederken, çimdikgöz antennal diskin antennal bölümü ile ağız kanca (Şekil 3, mavi ok) arasındaki bağlantının mümkün olduğu kadar yakın bir doku. Not: göz antennal disk kompleksleri tüm doku (Şekil 1A) ücretsiz olmalıdır. Slaytlar üzerine yerleştirilebilir istenen istenen tüm doku disseke olmuştur kadar devam edin. Bu protokol, kanat, haltere, bacak ve genital hayali diskleri (Şekil 1B-D) izole etmek için adapte edilebilir. </li><li> Kağıt mendil iki küçük parça (lamelleri boyut) yaklaşık 3 ekleyin. Ayrı diseksiyon çanak. Kabı üzerine bir cam slayt yerleştirin - ince kağıdın iki adet sürgünün uçları altında olmalıdır. Bu kesme çanak silikon tabanına yapışmasını slayt önleyecektir. </li><li> Kesilmemiş bir ucu olan bir P-20 kullanılarak cam mikroskop slayt ortasına da bir ağartma karşıtı maddenin 9 ul ekleyin. Floresan ile bakıldığında bu dokunun ağartma önlerışık. </li><li> Aynı kesilmemiş ucu kullanarak, tüm göz-antennal diskleri toplamak ve anti-ağartma reaktif damla ekleyebilirsiniz. Işlemine tabi tutulan, yıkama tampon miktarını en aza indirir. 10 ul veya daha az yıkama tampon miktarını sınırlamaya çalışın. </li><li> Ayırmak ve anti-ağartma reaktif damla içindeki göz antennal diskleri yaymak için bir çift forseps kullanın. Diskler birçok dakika için ağartma karşıtı ayraç inkübe izin verin. Not: doku ağartma karşıtı ayraç emdiğinde diskler berrak dönecek. </li><li> Ince bir fırça kullanarak hafifçe numune üzerine bir lamel indirin. Bu hava kabarcıklarının oluşumunu engeller. </li><li> Mağaza ışık veya floresan mikroskopi kullanılarak göz antennal veya başka bir hayali diskleri görüntülemek için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de kayar. </li></ol>

<ol>
	<li>Weismann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+nachembryonale+entwicklung+der+Musciden+nach+beobachtungen+an+Musca+vomitoria+und+Sarcophaga+carnaria.">Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria.</a> Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 .</li><li>Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaginal disc development. , 747-841 (1993).</li><li>Held, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+Discs:+The+Genetic+and+Cellular+Logic+of+Pattern+Formation.">Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation.</a> Developmental and Cell Biology Series. 39, 460 (2002).</li><li>Miall, L. C., Hammond, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+head+of+the+imago+of+Chironomus.">The development of the head of the imago of Chironomus.</a> Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 .</li><li>Kellog, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+homologies+of+the+mouth+parts+of+insects.">The development and homologies of the mouth parts of insects.</a> Am. Nat. 36, 683-706 (1902).</li><li>Eassa, Y. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+imaginal+buds+in+the+head+of+Pieris+brassicae+Linn.+(Lepidoptera).">The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera).</a> Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).</li><li>Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage,+growth,+and+determination+in+the+imaginal+leg+discs+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 20, 263-290 (1969).</li><li>Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+analysis+of+development+in+Drosophila+melanogaster:+morphogenesis,+determination+and+growth+in+the+wild+type+antenna.">A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna.</a> Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).</li><li>Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+hemimetabolous+insects.">The development of hemimetabolous insects.</a> Developmental Systems. , 165-242 (1972).</li><li>Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+hemimetabolous+insects.">The development of hemimetabolous insects.</a> Developmental Systems. , 96-163 (1972).</li><li>Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+polyclones+in+insect+development.">Compartments and polyclones in insect development.</a> Science. 189, 340-347 (1975).</li><li>Wieschaus, E., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+primordial+disc+cells+in+the+early+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).</li><li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+development+of+mesothoracic+compartments+in+Drosophila.+An+analysis+of+cell+lineage+and+fate+mapping+and+an+assessment+of+methods.">The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods.</a> Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).</li><li>Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+determination+the+beginning+of+eye+development.">Retinal determination the beginning of eye development.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=My+what+big+eyes+you+have:+how+the+Drosophila+retina+grows.">My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows.</a> Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+loci+required+for+follicular+patterning+using+directed+mosaics.">Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics.</a> Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells.">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li><li>Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TGF+beta+homolog+dpp+and+the+segment+polarity+gene+hedgehog+are+required+for+propagation+of+a+morphogenetic+wave+in+the+Drosophila+retina.">The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina.</a> Cell. 75, 913-926 (1993).</li><li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+segment+polarity+gene+hedgehog+is+required+for+progression+of+the+morphogenetic+furrow+in+the+developing+Drosophila+eye.">The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye.</a> Cell. 75, 927-938 (1993).</li><li>Heberlein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+in+the+Drosophila+eye+coordinated+by+hedgehog.">Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog.</a> Nature. 373, 709-711 (1995).</li><li>Dominguez, M., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+directly+controls+initiation+and+propagation+of+retinal+differentiation+in+the+Drosophila+eye.">Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye.</a> Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+Decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Borod, E. R., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+regulation+of+decapentaplegic+and+hedgehog+during+the+initiation+of+differentiation+in+the+Drosophila+retina.">Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina.</a> Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).</li><li>Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern-specific+expression+of+the+Drosophila+decapentaplegic+gene+in+imaginal+disks+is+regulated+by+3'+cis-regulatory+elements.">Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements.</a> Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).</li><li>Blackman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-b+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila.</a> Development. 111, 657-665 (1991).</li><li>Campos, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+the+locus+elav+in+Drosophila+melanogaster:+a+gene+whose+embryonic+expression+is+neural+specific.">Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific.</a> Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).</li><li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages.">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).</li><li>Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeo+domain+protein+rough+is+expressed+in+a+subset+of+cells+in+the+developing+Drosophila+eye+where+it+can+specify+photoreceptor+cell+subtype.">The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype.</a> Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).</li><li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atonal,+rough+and+the+resolution+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina.">Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).</li><li>Kumar, J. P., Moses, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+Receptor+and+Notch+signaling+act+upstream+of+Eyeless/Pax6+to+control+eye+specification.">EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification.</a> Cell. 104, 687-697 (2001).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu prosedür, büyük ölçüde izole edilmesi ve göz antennal diskler daha ilerideki muamelesi odaklanmış olmakla beraber, bu izole etmek ve kanat, haltere, bacak ve genital diskleri (Şekil 4) analiz etmek için kullanılan elverişlidir. (Göz antennal diske karşı), bu diskleri izole edilmesi için protokol tek gerekli modifikasyon kaba Diseksiyon (protokol, Bölüm 2) &#39;nin bir yöntemdir. İlk göğüs ayağı (T1), bir çift larva anterior bulunur ve göz antennal disk izolasyonu için pro...

Yüzyılı aşkın bir meyve sineği Drosophila melanogaster için, geliştirme, davranış ve fizyolojisini incelemek için önde gelen bir sistem olmuştur. Ikincisi alma yere kadar olan embriyonik ve post-embriyonik tek tabaka epitellerinden içinde hayali diskler 1-3 seslendi: sinek Kalkınma iki geniş aşamadan ayrılabilir. Hayali diskler çizimleri ilk böcek gelişimine 1 onun geniş monografi parçası olarak Ağustos Weismann tarafından 1864 yılında yayımlandı. Bu diskler 1-14 yetişkin sinek içinde bulunan ergin yapılara yüksek bir yüzdesine yol açan nihai olarak ilk pupa safhalarının yoğun doku çözülmesi hayatta ve larva aşamalarında desenli embriyojenez sırasında gelişme başlar. Larva gelişimi sırasında her bir disk kaderi, şekli ve büyüklüğü ile ilgili pek çok kritik kararlar alır. Birinci ve ikinci larva instars içinde, diskler, birincil kaderi benimseyerek establis görevliDoğru şekli alarak ve hücrelerin 15-16 arasında gerekli sayıda üretilmesi, bölme sınırları hing. Üçüncü larva ve erken pre-pupa aşamasında, hayali diskler bölünmeye devam ve hücreleri terminali kaderlerini 16 evlat gibi desenli. Drosophila gelişimsel biyoloji erken tarih boyunca, hayali diskler normal gelişim bağlamında ve bir kazanç ya da kayıp fonksiyon-mutant canlı olduğu hangi sınırlı durumlarda neredeyse sadece çalışıldı. X-ışınlarının kullanımı ölümcül mutasyonlar izin mitotik rekombinasyon larva ve yetişkin dokularda hücre klonlarının analiz edilecek ikna etmek. Bu yöntem larva ve yetişkin dokularda hem de mutasyonlar kaybını analiz etmek ve kazanç fonksiyon-transgenik yöntemler giriş tarafından geliştirilmiştir. Vahşi tipli ve mutant Dokuların moleküller manzara tanımlamak için antikorlar, transkripsiyonel raportörler, ve protein tuzaklar sayısı da const &#39;tırantly büyüyen. Mutant hücre klonları kaybını analiz etmek ve kazanç fonksiyon-bu moleküler işaretlerini kullanarak giderek mümkün mutant hücreler gelişim sırasında, kendi vahşi tip kuzenleri sapan nasıl bir gerçek zamanlı anlayış kazanmak için yaptı. Doğru bu araçları ve reaktiflerin yararlanmak için bu inceledi fotoğraflandı ve analiz edilebilir hayali diskler yüksek kaliteli hazırlıklarını kritik öneme sahiptir. Bu yazının amacı göz antennal diski kompleksinin (Şekil 1A) &#39;nin izolasyonu ve hazırlanması için optimize edilmiş bir protokol sağlamaktır. Ayrıca, başarılı bir şekilde kanatlar, halteres, T1-T3 bacak ve cinsel organların (Şekil 1B-D) yol da dahil olmak üzere ek disklerin çok çeşitli izole etmek için kullanılabilir. Minör modifikasyonlarla bu prosedür, yaklaşık seksen yıldır Drosophila &#39;dan gelen hayali diskleri izole etmek için kullanılmıştır. En genler mu sırasında ifade edildiği gibi, yukarıda tarif edilengelişme ve dokuların çok sayıda aşamaları ltiple, bu hayvan Üçüncü dönem larva aşamasından önce ölür null mutantlar tüm göz olması etkilerini incelemek imkansızdır. Dört yöntemler, önemli ölçüde daha uysal retina gibi daha gelişmiş dokuların çalışma yaptık. Birinci bir başka vahşi tip doku 17-19 olan mutant hücre klonları jenere arasında Flippase (FLP) / Flippase rekombinasyonu hedeflemek (STT) yöntemidir. Bu durumda, mutasyona uğramış doku, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi bir görsel işaretin olmaması ile tanımlanır ve GFP mevcut olduğu çevre vahşi tip doku (Şekil 2B) mukayese edilebilir. İkinci bir transgen hücrelerinin 20 bir popülasyonunda ifade edildiği &quot;Flp üzerinden&quot; yöntemidir. Bu durumda, hücre klonları, GFP raportör yoksun çevresindeki yabani tip doku (Şekil GFP varlığı ile tanımlanan ve karşılaştırılmıştır2E). Üçüncü FLP / FRT mutant klon ve bdp-dışarı ekspresyon sistemleri 21 unsurlarını birleştiren bir Baskılanabilir Hücre Marker (MARCM) tekniği ile Mozaik Analizi&#39;dir. Bu yöntem ile, bir transgen, aynı anda tek bir genetik lokus için mutant bir hücre popülasyonu içinde ifade edilebilir. Flp üzerinden klonları gibi, klonlar MARCM GFP varlığı ile tanımlanan ve GFP işaretleyici (Şekil 2F) yoksun çevreleyen vahşi tip doku ile karşılaştırılır. Ve son olarak, genler ve RNAi yapıları, GAL4 spesifik promotör-yapılarının kontrol altında hayali dokularda ifade edilebilir. Mutant veya aşırı ifadesi ya da klonlar desenler doğrudan bitişik vahşi tip dokuya göre olabilir çünkü Bu dört yöntem hayali diskleri okuyan ilgiyi artırmıştır. Bu prosedürde açıklanan gibi bir yöntem geliştirilmiştir ve böylece Drosophila yetişkin dokuların sonrası embriyo gelişimini çalışan araştırmacılar,Özellikle göz-antennal diskten türetilenler, analiz için yüksek kaliteli doku elde etmek mümkün olacaktır. Bireysel araştırmacılar küçük değişiklikler yapmış olsa da, bu prosedüre (biz burada açıklamak olan) çekirdek büyük ölçüde değişmeden kalmıştır. Yüksek kaliteli dokusu elde biz bu yazılı bir protokol ve beraberindeki görüntü değerli bir öğretim kaynağı olarak hizmet umuyoruz hayali disklerin çalışmaya kritik olduğundan.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="915">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:360px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Used to create base for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pryex Glass Petri Dish 150x20mm</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3160-152CO</td>
			<td>Use the cover for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5 Dissecting Forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>525</td>
			<td>Forceps must be kept very sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">9 well watch glass</td>
			<td>Vairous Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for fixation of imaginal disc complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Stir Bar</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Small enough to fit into Erlenmeyer Flask</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Conical Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5ml Microfuge Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clear or Dark depending upon application</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge Rack</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop Rotator</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>100ul volume should not splatter at low setting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Macron Chemicals</td>
			<td>2-26555-1</td>
			<td>Serves as fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-3139</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>71636</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125221000</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Periodate</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-1878</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MTX1568-1</td>
			<td>Used to perforate imaginal discs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>SX0593-3</td>
			<td>Used to dissolve paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Normal Goat Serum`</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>Serves as a blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seondary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Prevents bleaching of samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>48312-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Cover Slips 18x18mm</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe Tissue</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Prevents Glass slides from adhering to silicone base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Panit Brush 000</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use to gently lower coverslip on to samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster

Post-embriyonik meyve sineğinin gelişimi, Drosophila melanogaster önemli bir kısmı, hayali olarak adlandırılan diskler kese gibi yapıların bir dizi içinde yer alır. Bu diskler, yetişkin sinek içinde bulunan ergin yapılara yüksek bir yüzdesine yol açar. Burada bu diskleri kurtarmak ve antikorlar, transkripsiyon gazetecilere ve protein tuzakları ile analiz için onları hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol açıklar. Bu işlem en iyi hayali diskler gibi ince dokular için uygundur, ancak kolay gibi, larva ve yetişkin beyin yumurtalık kalın dokuları ile kullanılmak üzere modifiye edilebilir. Yazılı bir protokol ve beraberindeki Video üçüncü larva, doku fiksasyonu ve antikorlar ile hayali diskler tedavisi diseksiyon ile okuyucu / izleyiciye rehberlik edecektir. Protokol da daha küçük olan, birinci ve ikinci instar larvalarından hayali diskleri incelemek için kullanılabilir. Bu protokolün avantajı nispeten kısa olduğunu ve olması vardırdisseke doku yüksek kalite korunması için optimize tr. Diğer bir avantaj kullanıldığı sabitleme işlemi, Drosophila proteinleri tanıyan antikorların ezici sayı ile çalışır. Bizim tecrübelerimize göre, bu prosedürü ile iyi çalışmaz duyarlı antikorların çok küçük bir sayı vardır. Bu durumlarda, çare biz diseksiyon adımlar ve antikor inkübasyonlarının için belirlenen adres yönergeleri takip devam ederken alternatif bir sabitleme kokteyl kullanmak gibi görünüyor.

Güvenilir bir şekilde yukarıda tarif edildiği gibi bir yöntem, in situ probları, transkripsiyonel raportörler, protein tuzakları ve antikorlarda analiz için yüksek kaliteli malzeme üretmektedir. Şekil 1 de rutin olarak bu yöntemle iyileşti göz anteni, genital, kanat, haltere ve bacak diskleri görüntüler. Bu diskler, F-aktine bağlanan ve bu nedenle de her bir hücreyi ortaya koyan bir falloidin-konjüge edilmiş fluorophore ile tedavi edilmiştir. Doku daha sonra düz...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

26.3K Görüntüleme.  Indiana University. The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Video: Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

3. Instar Drosophila Larva hayali Disklerin Diseksiyon

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Diseksiyon ve boyanması Drosophila Larvaların Yumurtalıkların

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

İzolasyonu Drosophila melanogaster Testisler

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

In ömrü ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Diseksiyon ve montajı<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz Diskler

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...