Bu protokol, Paul Martin ve Antonio Jacinto laboratuvarları ile işbirliği içinde ve çalışma ile geliştirilmiştir. Biz Bloomington Menkul Kıymetler Merkezi sinek satırları paylaşmak için devam etmek için mükemmel servis ve Drosophila topluluk için teşekkür ederiz . BS BBSRC bir proje hibe ile finanse edilmektedir. WW, Wellcome Trust Kariyer Geliştirme Bursu tarafından finanse edilmektedir.

Hazırlık <ol><li> Hemocyte özel bir Gal4 sürücüsü (örneğin srp-Gal4 2) ve genetik olarak kodlanmış UAS kontrol (örneğin UAS-GFP) altında bir floresan muhabiri içeren uygun Drosophila hatları alın. Srp-Gal4 UAS-GMA 3 veya CRQ-Gal4 UAS-GFP 4, 5, homozigot Sinekler görüntüleme amaçlı (nb GMA moesin aktin bağlayıcı etki alanı için erimiş GFP) yararlıdır; bir tartışma için aşağıya bakınız Gal4 sürücüleri ve UAS aralığı (Bloomington Menkul Kıymetler Merkezi, geniş bir çeşitlilik içerir) oluşturur. </li><li> Genelde genetik haçlar, mutant allel Gal4 sürücüleri ve alternatif kromozomlar üzerinde taşınan UAS yapıları ile, floresan dengeleyici CTG veya TTG 6 kullanarak dengeli yürütülmektedir. Bu CTG / TTG ilişkili GFP floresan (bu aşamada 2.11 yapılır) yokluğu temelinde homozigot mutantlar seçmek mümkün kılar. </li><li> Bir elma suyu agar plaka 7 ile döşeme kafes, hisse senetleri ve yer sinekler artırın . Sinekler yeterli embriyolar döşenecek başlamadan önce döşeme kafes iklime alıştırmak için en az iki gün gerekir. Genel olarak her seks yirmi sinekler görüntüleme için yeterli embriyolar üretmek için yeterli olmalıdır, ancak farklı çizgiler, bereket derece farklı olduğunu belirtmek gerekir. Biz hava akımına izin tabanı delinmiş, plastik bir kabın alt içine sığacak 55mm Petri kapları kullanın. Tam embriyo toplama aracı önemsiz, ancak zamanlamaları embriyolar sahnelenen doğru toplamak için kritik öneme sahiptir. </li><li> 25 ° C&#39;de veya zamanlanmış bir plaka tutulan bir gecede elma suyu agar plaka embriyolar toplayın. Ikincisi için biz genellikle sinekler plaka kaldırma ve embriyo montaj önce 15-16 saat 18 ° C&#39;de yerleştirmeden önce, 4 saat önceden ısıtılmış bir plaka üzerinde bırakmaya izin verir ve bu geç dönem 12 ile embriyolar sağlar gelişme 15 sahne. Bir gecede plaka aşamaları büyük bir çeşitlilik içerir, ancak 25 kez daha uzun bir süre nedeniyle hemocytes floresan muhabir ifade daha yüksek düzeyde avantaj sunuyor ° C Gal4 UAS sistemi olarak ısıya duyarlı. </li></ol> Prosedür <ol><li> Küçük bir miktar su ve yumuşak uçlu bir fırça kullanarak elma suyu agar plaka embriyolar yerinden oynatın. Yerinden çıkar embriyolar çıplak gözle kolayca görülebilir. </li><li> Bir hücre süzgeç (Balıkçı) ya da ev yapımı elma suyu agar plaka, atık su toplamak için bir beher üzerinde yapılan sepetin içine su dökerek sepeti 7 embriyo transfer </li><li> Eğer elma suyu agar plaka transfer yeterli embriyolar memnun olana kadar 2.2 adımı tekrarlayın. </li><li> Su kullanarak hücre süzgecinden / sepeti embriyolar yıkayın. </li><li> Yer hücre süzgecinden / sepet elma suyu agar plaka Petri kabı kapağı ve hücre süzgecinden / sepete embriyolar askıya almaya yetecek kadar düzgün çamaşır suyu ekleyin. </li><li> Aydınlık altında diseksiyon mikroskobu embriyoların dechorionation izleyin: dechorionation iki dakika içinde gerçekleşmesi gereken, tamamlandığında dorsal uzantıları çözünmüş. </li><li> Çamaşır suyu hücre süzgecinden / sepet içeren embriyolar çıkarın ve kalan çamaşır suyu su kullanarak yıkayın. Çamaşır suyu tüm izlerini 2.8 adıma geçmeden önce çıkarılmalıdır. Artık çamaşır suyu mavi renk pembe / beyaz ağartılmış varsa çamaşır suyu kaldırıldı olup olmadığını değerlendirmek için bir hile, mavi renkli laboratuvar dokular üzerinde kalan su örtecek. </li><li> Kalan su hücre süzgecinden / sepeti alt uygulanan laboratuar doku / mediwipes kullanarak kurutun. </li><li> Petri kabı kapağı bir damlacık su koyun. Ince bir fırça ile tüm dechorionated embriyolar, embriyo sepeti toplamak ve damlacık onları tekrar süspansiyon haline getirin. Sonraki mikropipet kullanarak su aspire veya dikkatli bir laboratuvar doku / mediwipes emici embriyolar kurulayın. </li><li> Embriyoların kurutulduktan sonra, tüm embriyoların voltalef petrol bir damla ekleyin. Embriyoları içeren damlacık bitişik ikinci bir küçük bir damla yağ koyun. NB biz İngiltere&#39;de bir voltalef petrol tabanlı ticaret bulamadı; Halokarbon petrol 700 (Sigma) yerine kullanılıyor olabilir. </li><li> Uygun bir floresan diseksiyon mikroskobu altında yağ damlacığı saatçiler forseps bir çift (sayı 5) kullanarak istenilen genotip embriyolar sahnelenen seçin. Bu forseps kendi vitellin membran delinmesiyle embriyolar kepçe için içe doğru kıvrıktır (Şekil 1) olmalıdır. Ikinci petrol damlacığı seçilen embriyolar transfer. Konfokal mikroskop (Şekil 2) iyi görüntüler toplamak mümkün olması için diseksiyon mikroskobu floresan hemocytes görmek mümkün olduğu önemlidir. Biz genellikle ventral orta hat veya sahne 15 embriyolar hemocytes görüntü yanal göç monte sahne 13/14 embriyolarmotilite hemocytes embriyo üzerinde dağılımı aşağıdaki görüntü. </li><li> (Şekil 3) arasında yaklaşık 1 cm bırakarak voltalef yağı 2 küçük damla kullanarak bir Petriperm / Lumox çanak (Sarstedt) alt iki lamelleri (18x18mm, kalınlık 1), Çubuk, bu lamel üzerine yerleştirilen bir destek için kullanılacak embriyoların onları ezmek için değil. Petriperm yemekleri (50mm çap), hidrofobik, gaz geçirgen bir zar içerir. Biz yemekleri (yemekler% 70 etanol ile silinir ve yeniden olabilir) birkaç kez kullanıldıktan sonra kullanımı daha kolay hale gelir. </li><li> Diseksiyon mikroskobu aydınlık altında, bükülmüş forseps ve hat ventral tarafta seçilen embriyolar tek tek pick up ve paralel lamelleri kenarına (Şekil 3). Beceri ve sabrınız bağlı olarak, bu şekilde 15 kadar embriyolar hizalamak mümkündür. Embriyo ve Petriperm çanak membran hem kırılgan olduğu ve kolayca rüptüre olabilir hafifçe embriyolar işlemek için önemlidir. </li><li> Bir kere küçük bir damla yağ ekleyin ve iki lamelleri arasında homojen bir tabaka oluşturacak şekilde yayılır izin embriyoların hizalanır. Petrol yayıldı sonra (bu birkaç dakika sürebilir) embriyoların hala ventral tarafta olup olmadığını kontrol edin. Embriyoların biraz haddelenmiş varsa, forseps ile onları tekrar yeniden konumlandırmak. </li><li> Son olarak, cımbız (3 numara) iki önceden yapıştırılmış lamelleri üzerine oturtulmuş embriyolar üzerinde lamel (18x18mm, kalınlık 1) kullanarak. Tutkal lamel Bu lamel oje (Şekil 3) kullanılarak destekler. </li><li> Konfokal veya geniş alan mikroskobu monte embriyolar Petriperm çanak alın ve uygun bir adaptörü kullanarak sahnede Petriperm çanak montaj. Dik veya ters çevrilmiş bir mikroskop lamel (zarından aksine) odaklı objektif lens ile kullanılıyor olabilir Ya. </li></ol> Temsilcisi Sonuç: Bu protokol, embriyonun ventral tarafında hemocytes canlı görüntüleme için Drosophila embriyolar monte anlatılmaktadır. Eğer doğru yapılırsa hemocytes, fotoğraf ya da film ya da oluşturmak için kolay olacaktır. Hemocytes (özellikle objektif lens) görüntü için kullanılan en önemli belirleyicisi mikroskop, ancak elde edilen görüntülerin niteliği de geliştirme aşamasında bağlıdır, sıcaklık embriyoların kaldırdı ve Gal4 ve UAS hatları kullanılır. Floresan protein ekspresyonu yüksek seviyelerde hemocytes daha kolay bir şekilde görüntülü olmasını sağlayacak, bu nedenle, embriyoların (Şekil 2 ile alınan embriyoların içinde açık hemocytes örnekleri içeren protokol aşamasında 2.11 hemocytes görmek mümkün önemlidir. kamera) bir diseksiyon mikroskobu takılmıştır. Gal4 ve UAS yapıları nedenle artan sayıda, daha büyük bir sinyal-gürültü oranı sağlar. Ayrıca, bu da hemocyte davranış sağlayan görüntüleme, daha uzun süre takip edilmesi gereken yüksek lazer şiddetleri artan pozlama süreleri ihtiyacını azaltır. GFP ifade çok yüksek seviyede, surround yuvarlak hücre gövdesi (Şekil 4A-B), özellikle ince bir tabaka gibi lamel hemocyte morfolojisi ince ayrıntılarına kadar gösterecektir. GFP hariç Dairesel bölgelerde phagosomes (Şekil 4A-C) temsil eder. Lamel (Şekil 4B) çıkan filopodia-gibi Parmak de görülebilir. İki Gal4 sürücüleri (tartışma) bir veya daha fazla srp-Gal4 özellikle bu işlemler (Şekil 4C) görmek için yeterli kalır, ancak konfokal mikroskop yavaş tarama hızları veya daha fazla lazer güç gerekli olabilir. Ekspresyon düzeylerinde azalma gibi görüntü hemocytes, çıkıntılar daha zor olur; yine de bu çıkıntılar daha az belirgindir (Şekil 4D) bile hücre gövdesi ve açık kaldığı sürece, bu koşullar altında hemocytes göç izlemek için hala mümkündür. Önceki gelişim aşamaları (en fazla 13 sahne) hemocytes birbirleriyle yakın temas halinde göç eden ve tek tek hücrelerin ayırt etmek genellikle zordur. Aşamasının sonuna gelindiğinde 13 hemocytes ventral orta hat (Şekil 5A) aşağı tek bir satır oluşturdular, sonra, daha fazla hareketli olma, ventral sinir kablosu (Şekil 5B) kenarlarına yanal göç. Hemocytes dinamik çıkıntılar içinde aktin hücre iskeletinin GMA (Şekil 5C) veya kiraz moesin ifade aracılığıyla doğrudan görülebilir. Bu şekilde embriyoların Montaj gaz değişimi sağlar ve dehidratasyonu engeller ve embriyolar yaşayabilir aşağıdaki görüntü kalır. Embriyo, embriyo içerik, vitellin zarından sızıntı olarak genellikle açıktır montaj sırasında hasar görmüşse. Bir embriyo sonra kurutmak Eğer bu genellikle vitellin membran deformasyonlar görülmüştür. Bazen bir embriyo timelapse film seyri sırasında rulo, ancak bu sadece uzun zaman ölçeğinde filmler için sorunlu olma eğilimindedir. Lastly, aynı anda birden fazla embriyoların montaj experimentalist kendi deney için mükemmel bir yönde bir embriyo elde etmek için en iyi şansı verir. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Dechorionated embriyo manipülasyonu için Forseps. Saatçiler forseps (boyut numarası 5) ipuçları moda için bir araç, burada gösterildiği gibi embriyolar kadar kepçe bükük içe olmalıdır. Ponksiyon embriyo hiçbir keskin kenarlara sahip olarak bükülmüş bölgenin dış yüzeyi de Petriperm membran konumlandırma sırasında embriyoların işlemek için yararlıdır. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Iyi canlı görüntüleme sonuçlar verecektir embriyolar Temsilcisi görüntüler. Voltalef yağ dechorionated embriyolar (protokol 2.11 sahne) Görüntüler floresan diseksiyon mikroskobu alınan. CRQ Gal4, UAS-GFP embriyolar; aşamada 13 (A) ve sahne 15 (B) srp-Gal4, UAS-GFP Yanal manzaralı. Hangi bir sahne 15 srp-Gal4, UAS-GFP / + Yanal; CRQ-Gal4 uas-GFP/uas-N17Rac embriyo (C) hemocytes zaman hemocytes gibi neye embriyolar gösteren, kafasının dışına göç başarısız oldu onların göç yolları üzerinde belirgin değildir. Geliştirme (D) Bu aşamada gut dolambaçlı bir yapı gösteren CRQ Gal4, UAS-GFP embriyo; bir sahne 17 srp-Gal4, UAS-GFP Yanal görünümü kas kasılması başlangıcı bunun ötesinde embriyoların canlı görüntüleme önler gelişme aşamasında. Ventral aşamada 13 (E) ve sahne 14 kez (F) srp-Gal4, floresan etiketli çekirdekleri ile hemocytes yayılma gösteren UAS-kırmızı stinger embriyolar. Protokol aşamasında 2.11 floresan hemocytes Gözlem mükemmel görüntüler elde etmek için bir ön koşuldur; anterior tüm görüntüleri için doğru. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Embriyoların Petriperm / Lumox çanak montajı. İki 18x18mm lamelleri (kalınlığı 1) gösterildiği gibi yaklaşık 1cm ayrılmış küçük bir damla petrol kullanarak Petriperm çanak alt yüzüne yapışmış. Embriyolar sonra lamelleri kenarları uzun (ön-arka) eksenine paralel ventral tarafta kadar astarlı ve küçük bir damla yağ ile kaplıdır. Bir kez üçüncü bir lamel (18x18mm kalınlığı 1) hafifçe ezilmiş olan embriyolar önlemek için bir köprü olarak iki önceden yapıştırılmış lamelleri kullanarak yağ kaplı embriyoların üstüne yerleştirilen iki lamelleri arasındaki boşluğu doldurmak için petrol yayıldı. Bu lamel sonra oje iki küçük damla kullanarak iki lamel köprüler yapıştırılır. Bir kez ayarlandığında, embriyoların lamel (Petriperm zarından aksine) aşağı doğru odaklama objektif lens ile Dik veya ters çevrilmiş bir mikroskop görüntülenebilir. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. GFP etiketli hemocytes canlı görüntüleme Temsilcisi sonuçlar. CRQ Gal4, UAS-GFP embriyo (AB); bir sahne 14 srp-Gal4, UAS-GFP ventral tarafta hemocytes Z-projeksiyonları. (A) timelapse filmlerde hemocyte gelişimsel göçleri izlemek için kullanıldığı gibi daha düşük bir büyütme görüntü. (B) kendi morfolojisi ince ayrıntılarını gösteren, ventral orta hat hemocytes hala daha yüksek bir büyütme. (C), ventral orta hat üzerinde bir sahne 14 srp-Gal4, UAS-GFP / + hemocytes 1 m tek bir dilim CRQ-Gal4 UAS-GFP / + embriyo, ifşa Gal4 sürücüleri ve UAS düşük kopya sayısı yapıları da iyi bir görüntü oluşturmak için yeterlidir. (D) bir sahne 14 CRQ-Gal4, UAS-GFP embriyo hemocytes z-projeksiyon görüntüler. Burada hemocyte çıkıntılar nedeniyle, GFP, düşük ifadesi daha az belirgin ama film yapmak ve bu kombinasyon inşa Gal4 sürücü ve kullanıcı arayüzleri ile hemocyte göç izlemek için hala mümkün. Görüntüler Leica LSM510 konfokal mikroskop alındı ​​anterior tüm görüntüler; görüntülerin çevre halkalar vitellin membran otofloresans kaynaklanır. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. GMA ifade hemocytes canlı görüntüleme Temsilcisi sonuçlar. Evre (13), ventral orta hat (A) ve sahne 14 hemocytes Z-projeksiyonları (B) srp-Gal4 UAS-GMA embriyolar hemocytes gelişimsel göçler göstermek için timelapse filmleri alınmıştır. GMA ifade hemocytes (C) daha yüksek büyütme görüntüleme aktin dinamikleri hakkında detaylı bilgi elde edilebilir. GMA moesin ve etiketler aktin filamentler aktin bağlayıcı etki alanı erimiş GFP oluşur. Anterior tüm görüntüler; konfokal mikroskop görüntüleri alındı.

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF/VEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila.">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7, 73-84 (2004).</li><li>Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+morphogenetic+movements+in+Drosophila+using+Gal4-UAS-driven+expression+of+GFP+fused+to+the+actin-binding+domain+of+moesin.">Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin.</a> Genesis. 34, 146-151 (2002).</li><li>Stramer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes:+masters+of+multitasking.">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).</li><li>Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes.">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34, 135-138 (2002).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila protocols. , (2000).</li><li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila.">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120, 1829-1837 (1994).</li><li>Millard, T. H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+filopodial+interactions+during+the+zippering+phase+of+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure.</a> Development. 135, 621-626 (2008).</li><li>Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PAR-1+in+regulating+the+polarised+microtubule+cytoskeleton+in+the+Drosophila+follicular+epithelium.">The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium.</a> Development. 130, 3965-3975 (2003).</li><li>Olofsson, B., Page, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+the+central+nervous+system+in+embryonic+Drosophila+is+inhibited+by+blocking+hemocyte+migration+or+neural+activity.">Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity.</a> Dev Biol. 279, 233-243 (2005).</li><li>Paladi, M., Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+Rho+GTPases+in+embryonic+blood+cell+migration+in+Drosophila.">Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila.</a> J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).</li><li>Vlisidou, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryos+as+model+systems+for+monitoring+bacterial+infection+in+real+time.">Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time.</a> PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).</li><li>Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin-based+epithelial+adhesion+and+cell+matching+during+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure.</a> Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+movement+during+dorsal+closure+in+Drosophila+embryos.">Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos.</a> Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).</li><li>Kunwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tre1+GPCR+initiates+germ+cell+transepithelial+migration+by+regulating+Drosophila+melanogaster+E-cadherin.">Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin.</a> J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).</li></ol>

Bu prosedürün en önemli unsurlardan açıkça etiketli hemocytes sağlıklı embriyoların seçimi ve onlara zarar vermeden bunları dikkatli bir şekilde monte etmek için. Birkaç saat süreyle imaged embriyoların Halokarbon yağı sonra dehidratasyon dayanıklı ve bir kez monte edilebilir. Bizim ellerde 40X amacı ile her üç dakikada bir Zeiss LSM510 konfokal mikroskop görüntüleri z yığını alarak, embriyo ya da açık foto-hasar ihmal dehidratasyon üç saat görüntü hemocytes,. Hemocytes son derece d...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>70&mu;m pores</td>
</tr>
<tr>
<td>Halcarbon oil 700</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8898</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lumox/Petriperm dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>96077305</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations

Birçok çalışma, adres hücre göçü<em&gt; In vitro</em&gt; Yöntemleri, fizyolojik ilgili çevre ise organizmanın kendini. Burada montaj için bir protokol<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Embriyo ve floresan etiketli hemocytes sonraki canlı görüntüleme, bu organizmanın embriyonik makrofajlar. Gal4 UAS sistemini kullanarak<sup&gt; 1</sup&gt; Embriyo boyunca gelişimsel dağılma takip hemocytes genetik olarak kodlanmış, floresan etiketli işaretleyicileri çeşitli ifadesi sürücü. Embriyo gelişiminin istenilen aşamada aşağıdaki toplama, dış koryon kaldırılır ve embriyoların daha sonra bir hidrofobik, gaz geçirgen bir zar ve canlı görüntüleme için bir cam lamel arasında Halokarbon yağ monte edilmiştir. Hız ve yönlülük, F-aktin ve mikrotübüller bu sitoskeletal bileşenlerin dinamikleri ile ilgili daha detaylı bilgi verebilir floresan gazetecilere kullanımı ile birleştiğinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme gibi brüt göçmen parametrelere ek olarak.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations at JoVE.com

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

live-imaging-of-drosophila-melanogaster-embryonic-hemocyte-migrations

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

15.6K Görüntüleme.  University of Bath. Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Video: Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

İzolasyonu Drosophila melanogaster Testisler

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Bireysel hazırlanması Drosophila</emCanlı Görüntüleme için> Yumurta Chambers

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

In ömrü ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...