This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.

NOT: Tüm hayvan prosedürleri yönergeleri izleyerek ve Connecticut Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. NOT: YFP muhabiri 20 (JAX # 006148) çizgiler sırasıyla kullanıldı: NG2cre 18 bünye (JAX # 008533) ve NG2creER 16 uyarılabilir bu deneylerde (JAX # 008538) için transgenik fareler 19 (JAX # 003920) veya gtRosa26 / EG Z&#39;ye geçti Görüntü NG2 hücreleri ve soylarına. Görüntü olgun oligodendrositlere, PLPDsRed transgenik farenin 21 kullanılmıştır. Tutarlı hayatta kalmak için, dilimler ön beyin ve beyincik hem doğum sonrası gün 10 fareden izole edilebilir. 1. Dilim Hazırlık <ol><li> Bir kültürü kaputu, altı iyi plakaları doku kültürü yerlefltirmede ve (reaktif bölümünde tarifi) 1 ml dilim kültür ortamı ekleyin. % 5 ile 37 ° C&#39;de diseksiyon önce CO2 en az 2 saat, hücre kültürü inkübatöründe plakaları koyun. </li><li> % 70 etanol ile tüm araçları ve doku chopper sterilize edin. </li><li> Diseksiyon önce başlamasından en az 15 dakika boyunca buz üzerinde% 95 O2,% 5 CO2 ile kabarcık tampon diseksiyon (reaktif bölümünde tarif). </li><li> Onaylanmış hayvan protokollere göre 5-10 dakika süreyle buz üzerinde yerleştirerek fare yavrular anestezisi. Farenin kuyruk ve ayak sıkıştığı yanıt vermeyen onaylayarak anestezi uygun derinliğini teyit edin. </li><li> Hayvan protokolleri aşağıdaki keskin bir makas kullanarak hayvanları başını kesmek. Hızla ilk sterilize araçlarını kullanarak lateral insizyon ardından sagital kesim, yaparak ön beyin ve beyincik üzerinde kafatası çıkarın. Dikkatli bir tarafına doku yuvarlayarak beyin ve beyincik ventral yüzeyinden kafatası sinirlerinde kesin. </li><li> Buzla soğutulmuş, oksijenli diseksiyon tampon içeren steril bir 35 mm çanak doku yerleştirin. </li><li> Bir jilet kullanarak, beyincik ve ön beyin sever. Sonra mid-sagital kesim uçtan bir uca yapmakhemisferleri ayıran öf ön beyin ve beyincik. </li><li> Manuel doku kıyıcı ile ön beyin ve beyincik 300 mikron kalınlığında koronal ve sagital kesitler halinde kesilmiştir. NOT: Manuel doku kesici ve agaroz yerleştirilmesi için gerek kalmadan kültür kuluçkalamadan diseksiyon ikinci hızlı bir şekilde işlenebilirlik sağlar. Daha önce tarif edildiği gibi, 9 bir vibratome da kullanılabilir. </li><li> Buz üzerinde taze kabarmış soğuk diseksiyon tampon ayrılır dilim aktarın. </li><li> Küçük diseksiyon kullanın veya bireysel bölümleri ayırmak ve kültürü ekler ile altı iyi yemekler preinkübe aktarmak için spatulası ağırlığında. </li><li> Tek kullanımlık bir transfer pipeti veya P 200 pipet ucu kullanılarak kültür uç yüzeyinden herhangi bir aşırı diseksiyon tamponunu çıkarın. Üç önbeyinde üç serebellar dilim iki bir kültür insert yerleştirilebilir. NOT: ön beyin kültürleri ile tutarlı sonuçlar için, anterior korpus kallosum üçte birini kapsayan dilim almak idealdirAynı dilim içinde hem gri hem de beyaz cevher bölgelerini incelemek için (Şekil 1A). Her hayvan genellikle 6 ön beyin dilimleri ve 6 beyincik dilimleri verir. </li><li> Inkübatör altı havuzlu plakalar yerleştirin ve daha sonra 1 1 gün sonra dilim dilim hazırlanması ortamının mililitresi ve dilim sabitleme kadar her gün ile dilim orta yerine. </li><li> Deneye bağlı olarak, kültür 5-7 gün sonra dilimler kullanın. Sadece ilk birkaç gün sonra şeffaf hale dilimleri kullanın ve düzensiz opak bölgeler var olanlar atın. NOT: dilimler içinde Opak bölgeler gözle görünür ve faz kontrast altında koyu hücrelerin bir yığın olarak görünür. Teknik hakim olmuştur sonra ölü opak dilimler dilim az% 1-5, nadiren meydana gelir. </li></ol> NG2 hücre Bölümü ve Oligodendrosit Farklılaşma 2. Time-Lapse Görüntüleme NOT: ZEG farenin 16: biz NG2cre kullanmak NG2 hücre çoğalması ve farklılaşması zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek içinNG2 hücreleri ve soyu (Şekil 1C-E) EGFP ifade edilmektedir. Bu hat Raportör ekspresyonu, kısa bir sürede en az dört haftalık bir süre boyunca kesit sonra dilimler canlı GFP görüntüleri + hücreler elde etmek için yeterince sağlamdır. Açık görüntüler kültüründe ilk 3-5 gün içinde gerçekleşir dilim, ilk incelmesi döneminden sonra elde edilir. <ol><li> Deney boyunca, 37 ° C&#39;de hücre kültürü inkübatöründe dilimleri tutmak ve kısa süreler için, sadece kaldırma (dilim başına en az 15 dakika), altı yuvalı plaka sırasında görüntüleme üzerindeki kapağı tutmak. </li><li> Bir dijital kamera ile donatılmış bir ters floresan mikroskop kullanılarak, bir 10X objektif kullanılarak ilk kez noktasında görüntüleri yakalayabilir. NOT: İlk kez puan deney göre değişir ve dilimler hazırlanmıştır gün veya sonrasında herhangi bir zaman noktası olabilir. </li><li> Dilim hem gri hem de beyaz cevher alanlarında zaman noktasında bir çoklu bölgelerden görüntüler yakalayın. Not thdilim içinde belirli noktalara ile ve daha sonra bir görüntüleme oturumları için kullanılabilecek bir şema üzerinde görüntü konumu eşleyerek görüntülenmiş e bölgesi. Faydalı yerlerine beyaz cevher yollarının dilimleri ve / veya yönlendirme kenarlarını içerebilir. Görüntü her zaman noktasında her dilim 4-8 yerleri. </li><li> 4-6 saat arayla sonraki fotoğrafları çekmek NG2 hücre bölünmesini ve olgodendrosit farklılaşma, ideal üzerinde 5-7 gün inceleyerek eğer. </li><li> Tüm bölgelerin nihai bir görüntü yakalamak ve hemen dilimleri düzeltmek. Daha sonra dilimler üzerine başka bir 1 ml ilave edilir, kültür ucun tabanına (0.1 M L-lisin, 0.01 M sodyum meta-periodat ile% 4 PFA), sabitleyici 1 ml ilave edilir. Bu membran ayırmak gibi dilim doğrudan Fiksatif fışkırtma dikkat edin. 30 dakika boyunca doku saptamak ve bölüm 4&#39;te tarif edildiği gibi gelişimsel aşama spesifik markörleri kullanılarak immünohistokimya ile devam edin. </li><li> 0.2 M sodyum fosfat tamponu, 3 x 10 m ile yıkayın dilimleriolarak. 1-3 gün boyunca 0.2 M sodyum fosfat tampon maddesi içinde 4 ° C&#39;de, gerekli deposu dilimleri daha önce immüno-boyama ve ancak ideal olanı ise, 24 saat içinde ve boyama gibi. Oligodendrositler (Şekil 2D,-F) farklılaşmış olan hücrelerin oranını belirlemek için bölüm 4, aşağıda tarif edildiği gibi immünohistokimya ile devam edin. </li></ol> Dilim Kültürlerde indüklenebi- Muhabir transgenik fareler kullanılarak NG2 hücre Döl 3. Kader Haritalama Not: kültüründe belirli bir zaman noktasında NG2 hücrelerin kaderini izlemek için, uyarılabilir NG2creER: YFP transgenik fareler kullanılabilir. <ol><li> Kültür ortamına, etanol içerisinde çözündürüldü, 100 nM 4OHT ekleyerek, Cre rekombinasyonunu ve bildirici ifadesini teşvik eder. Not: Raportör pozitif hücreler, bütün NG2 hücre aşamasında hücreler olacaktır ~% 20-25, YFP + NG2 + / + hücrelerinin NG2 bir indüksiyon verimle ve bu zaman noktasında 1-2 gün içinde görünecektir (Şekil 2A-C) </li><li> Fix ve dilim yıkayınFarklı zaman noktalarında in çeşitli değişiklikler yapıldıktan sonra (Bölüm 2.5 ve 2.6 &#39;da tarif edilmiştir). </li></ol> 4. Dilim İmmünhistokimya <ol><li> Bir neşter kullanılarak ekler dışarı ekli dilimleri ile membranlar kesti. </li><li> Membran taşırken dilimin bileşimi bozmak için özen cımbız bir dizi kullanılarak 24 gözenekli bir plaka ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), tek tek oyuklara dilimleri aktarın. </li><li> 1 saat boyunca PBS içerisinde% 5 normal keçi serumu (NGS) ve% 0.1 Triton-X100 içeren bloke etme çözeltisi, 24 gözlü bir levhaya dilimleri aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de PBS içinde% 5 NGS / birincil antikor O&#39;da N dilimleri inkübe edin. NG2 hücre safhasında hücrelerin belirlenmesi için, ve NG2 PDGFRα antikorlar kullanır. Diferansiye oligodendrositlerin belirlenmesi için, adenomatus poliposis koli antijene karşı bir antikorun kullanılması (APC klon CC1). </li><li> PBS 3 x15 dakikada ikinci gün yıkama dilimleri, daha sonra ikincil Antibo kuluçkaya yatmaktadıroda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içerisinde% 5 NGS ölür. PBS 3 x15 dakika dilimleri yıkayın ve slaytlar monte. Membran objektif ve doku arasındaki olmayacak şekilde slayt karşı karşıya dilimleri yukarı ve membran ile monte edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).</li><li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+long-term+live+imaging.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Bahr, B. A., Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+maintenance+of+glutamate+receptors+and+other+synaptic+components+in+long-term+hippocampal+slices.">Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices.</a> Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).</li><li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex.">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li><li>Noctor, S. C., Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).</li><li>Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+purkinje+cell+dendritic+morphology+in+organotypic+slice+cultures.">The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).</li><li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains.">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).</li><li>Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polydendrocytes+(NG2+cells):+multifunctional+cells+with+lineage+plasticity.">Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).</li><li>Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+oligodendrocyte+dynamics+in+organotypic+culture.">Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture.</a> Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).</li><li>Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -. J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cell+transplantation+into+organotypic+cerebellar+shiverer+slices:+a+model+to+study+myelination+and+myelin+maintenance.">Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance.</a> PloS one. 7 (7), (2012).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).</li><li>Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+remyelination+after+antibody-mediated+demyelination+in+an+ex+model+for+immune+mediated+CNS+damage.">Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage.</a> Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).</li><li>Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axin2+as+regulatory+and+therapeutic+target+in+newborn+brain+injury+and+remyelination.">Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).</li><li>Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+fate+and+lineage+restriction+of+single+NG2+cells.">Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells.</a> Development. 138 (4), 745-753 (2011).</li><li>Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2+Cells+in+White+Matter+But+Not+Gray+Matter+Proliferate+in+Response+to+PDGF.">NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF.</a> Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).</li><li>Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2+cells+generate+both+oligodendrocytes+and+gray+matter+astrocytes.">NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes.</a> Development. 135 (1), 145-157 (2008).</li><li>Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z/EG,+a+double+reporter+mouse+line+that+expresses+enhanced+green+fluorescent+protein+upon+Cre-mediated+excision.">Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision.</a> Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).</li><li>Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+reef+coral+fluorescent+proteins+in+the+central+nervous+system+of+transgenic+mice.">Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).</li><li>Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li><li>Rivers, L. E., Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGFRA/NG2+glia+generate+myelinating+oligodendrocytes+and+piriform+projection+neurons+in+adult+mice.">PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).</li><li>Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progeny+of+Olig2-expressing+progenitors+in+the+gray+and+white+matter+of+the+adult+mouse+cerebral+cortex.">Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).</li><li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2++CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration.">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li><li>Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+the+dynamics+of+CNS+glial-axonal+interactions+in+vitro+and+ex+vivo.">Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo.</a> PloS one. 7 (1), e30775 (2012).</li><li>Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+increases+oligodendroglial+cell+proliferation+in+rat+cerebellar+slice+cultures.">Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).</li><li>Azim, K., Butt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK3&#946;+negatively+regulates+oligodendrocyte+differentiation+and+myelination+in+vivo.">GSK3&#946; negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo.</a> Glia. 59 (4), 540-553 (2011).</li><li>Hussain, R., El-Etr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+and+nestorone+facilitate+axon+remyelination:+a+role+for+progesterone+receptors.">Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Lubetzki, C., Demerens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+in+culture,+oligodendrocytes+myelinate+solely+axons.">Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).</li><li>Demerens, C., Stankoff, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myelination+in+the+central+nervous+system+by+electrical+activity.">Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).</li><li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells.">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li><li>Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+myelination+by+specific+patterns+of+neural+impulses.">Control of myelination by specific patterns of neural impulses.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).</li><li>Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine:+a+neuron-glial+transmitter+promoting+myelination+in+the+CNS+in+response+to+action+potentials.">Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials.</a> Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).</li><li>Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+local+protein+synthesis+and+initial+events+in+myelination+by+action+potentials.">Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials.</a> Science. 333 (6049), 1647-1651 (2011).</li><li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation.">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests

Merkezi sinir sisteminde etkin Myelinasyon nöronal iletişim ve aksonal hayatta 22 için gereklidir. 25 - En beyin bölgelerinde 16,23 içinde yerleşik nüfusu korurken NG2 hücreleri sürekli yetişkinlik içine Myelinating oligodendrositleri oluşturmak. Bu hücrelerin farklılaşmasını düzenleyen bazı genetik ve moleküler mekanizmalar tarif edilmiştir ama çok keşfedilmeyi beklemektedir. Organotipik dilim kültürleri nedeniyle anatomik bölge, hücre dışı ortama kolay man...

4 - merkezi sinir sistemi Organoytpic dilim kültürlerinin semiintact sistem 1 &#39;de nöron ve glial hücre biyolojisi çalışmak için çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. 9 - Bu kültürler, kabul ve bu hücre dışı ortamın bir manipülasyon ve tekrarlamalı uzun-süreli canlı hücre görüntüleme için kolay erişim ve elektrofizyolojik kayıtları 5, birincil hücre kültürleri ayrışmış birçok yararlarını korumak için nispeten basittir. Buna ek olarak, dilim kültürler, 3 boyutlu doku hücre mimarisini, bölgesel sinir bağlantısına sahip, ve en önemli hücre tiplerinin sistemde bulunmaktadır. Bu özellikler hücresel ve çevresel etkileşimleri ile tek hücre davranış ve fizyolojisini araştırmak için bu Kültürlerin benzersiz ve kullanışlı bir sistem yapmak. NG2 hücrelerinin çoğalmasını ve m oluşturmaya devam memelilerin merkezi sinir sistemindeki glial hücreler bir nüfusembriyonik ve postnatal gelişim 10 sırasında oligodendrositleri yelinating. Bunlar yaygın olarak ayrışmış primer hücre kültürlerinde incelenmiştir ve floresan proteinleri NG2, hücre spesifik ifadesi ile transgenik fare hatları son gelişmeler, akut dilim preparasyonlarında in vivo kaderi haritalama ve elektrofizyolojik kayıtları kolaylaştırmıştır. Hatta bu çalışmalar ile, küçük NG2 hücre çoğalması ve olgodendrosit farklılaşmasının zamansal dinamikleri hakkında bilinmektedir. Ayrışık hücre kültürü geniş farmakolojik ve genetik manipülasyon göreli tesis için kullanılır, ancak, bunun hücresel mikro-bağlamını sağlamak tercih edilir, özellikle, beynin farklı bölgelerinde bu hücrelerin fonksiyonel farklılıklar sorgulamak için uygun değildir. Dilim kültürleri, hücre farmakolojik manipülasyonlar mükellef ve olgodendrosit myelinleşmeyi 11,12 araştırmak için kullanılır olmuştur basit bir alternatif sağlamak(LPC) lisolesitin veya antikor farmakolojik tedavinin 15 üzeri demiyelinizasyonu 13,14 ve remiyelinizasyon indüklenmesini sonra ular yanıt. Bir yöntem araştırmak ve canlı görüntüleme ve sabit doku (veya Postfiksasyon) ön beyin ve beyincik hem de alınan organotipik dilim kültürlerde NG2 hücre çoğalması ve farklılaşması olgodendrosit analizini tarif gerçekleştirmek için. Bu bölünme sonrası 16 tek NG2 hücrelerinin hücre kaderine incelemek için ve büyüme faktörü ile uyarılan NG2 hücre çoğalması 17 bölge ve yaşa bağlı farka için kullanılabilir güçlü bir yöntemdir. Bu, nispeten basit teknik ayrıca doğuştan ve / veya çevresel, bu glial hücre fizyolojisi ve nöronal aktivite ya da mielin hasarına cevabı düzenleyen mekanizmaların hücre araştırılması yaygın erişilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Slice Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11090</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14175</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-4034</td>
			<td>25mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>1mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-0278</td>
			<td>0.4mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30074.03</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>124mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>3.004mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>1.25mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 (anhydrous)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>4.004mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>26mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-0278</td>
			<td>2.0mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4036</td>
			<td>0.075mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other Reagents and Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxy tamoxifen (4OHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904</td>
			<td>100nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19200</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-6027</td>
			<td>0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Metaperiodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1878</td>
			<td>0.01M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti NG2 antibody</td>
			<td>Chemicon (Millipore)</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti CC1 antibody</td>
			<td>Calbiochem (Millipore)</td>
			<td>OP80</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti Ki67 antibody</td>
			<td>Vision Biosystems</td>
			<td>NCL-Ki67-MM1</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti NeuN antibody</td>
			<td>Chemicon (Millipore)</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Species specific secondary antibodies</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture membrane inserts 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 5% CO2 gas mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile six well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual or automatic tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm and 60mm sterile Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microcope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic slice cultures to study oligodendrocyte dynamics and myelination

NG2 ifade eden hücreler (polydendrocytes oligodendrosit öncü hücreleri), merkezi sinir sisteminde, dördüncü bir glial hücre içerisinde yer alırlar. Embriyonik ve postnatal gelişim sırasında aktif çoğalırlar ve Myelinating oligodendrositleri oluşturmak. Bu hücreler sık ​​primer ayrışmış kültürler, nöron cocultures okudu ve sabit dokuda edilmiştir. Kullanımı uygun yeni transgenik fare soyları kültür sistemleri ön beyin ve beyincik hem gri ve beyaz madde bölgelerde oligodendrosit soy hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması araştırmak için kullanılabilir dilim. Dilim kültürleri erken doğum sonrası farelerde hazırlanan ve 1 aya kadar kültür içinde tutulur. Bu dilimler hücresel davranış ve etkileşimleri araştırmak için kültür dönemi boyunca birden fazla kez görüntülenmiş olabilir. Bu yöntem NG2 hücre bölünmesi görselleştirme ve ayrıntılı analizini sağlarken olgodendrosit farklılaşma giden adımlar bölgede-bağlıdır veriyorent NG2 hücre ve olgodendrosit fonksiyonel heterojenite. Bu ise, in vivo olarak bulunan andıran bir hücresel ortamda zaman bu hücreleri etkileyen iç ve dış sinyalleri araştırmak için kullanılan bir güçlü bir tekniktir.

Örnek veri örnekleri aşağıda verilmektedir P8 NG2cre bir ön beyin ve beyincik hem de dilim kültürleri kullanılarak elde edilmiştir ki: zeg, NG2creER: YFP ve transgenik fare hatları PLPDsRed. NG2 hücreleri ön beyin ve beyincik dilimleri (Şekil 1B-D, video 1) ve bu hücrelerin fenotip gün boyunca görüntülü olabilir tespit edilerek ve NG2 ve CC1 antikorları (Şekil 1E) ile immünboyama edilebilir. Canlı görüntülemeye ek olarak, hücre çoğalması aynı zamanda Ki67...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination at JoVE.com

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

organotypic-slice-cultures-to-study-oligodendrocyte-dynamics

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K Görüntüleme.  University of Connecticut. A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.